Method Article

Contextuele en cued Fear Conditioning Test Met behulp van een video analysesysteem in Muizen

DOI:

10.3791/50871

⸱

March 1st, 2014

 ,  ,  , 
1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science, Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency, Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een protocol voor een contextuele en cued vreesconditionering test met een video-analysesysteem om angst leren en geheugen in muizen te beoordelen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De contextuele en cued vreesconditionering test is een van de gedragstesten dat het vermogen van muizen om te leren en te onthouden van een associatie tussen omgevingsfactoren en negatieve ervaringen beoordeelt. In deze test worden muizen in een conditioneringskamer geplaatst en krijgen snippers van een geconditioneerde stimulus (een auditieve cue) en een aversieve ongeconditioneerde stimulus (een elektrische footshock). Na een vertragingstijd worden de muizen blootgesteld aan dezelfde conditioneringskamer en verschillend gevormde kamer met voorstelling van de auditieve cue. Invriezen gedrag tijdens de test wordt gemeten als een index van angst geheugen. Om het gedrag automatisch te analyseren, hebben we een video-analyse-systeem met behulp van de ImageFZ software programma, dat beschikbaar is als gratis download op http://www.mouse-phenotype.org/ is ontwikkeld. Hier, om de details van ons protocol tonen, onze procedure voor de contextuele demonstreren en cued vreesconditionering test C57BL/6J-muizen met de ImageFZ syst weem. Daarnaast hebben we ons protocol gevalideerd en video analysesysteem uitvoering door bevriezing tijd gemeten door de ImageFZ systeem of een fotocel computer meetsysteem met die gescoord door een menselijke waarnemer vergelijken. Zoals in onze representatieve resultaten, verkregen door ImageFZ data waren vergelijkbaar met die welke door een menselijke waarnemer geanalyseerd, wat aangeeft dat de gedragsanalyse met het ImageFZ systeem is zeer betrouwbaar. De huidige film artikel geeft gedetailleerde informatie over de testprocedures en zal inzicht in de experimentele situatie te promoten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De contextuele en cued vreesconditionering test is de gedrags-paradigma gebruikt om associatieve angst leren en geheugen bij knaagdieren 1-3 te beoordelen. Deze test is op grote schaal gebruikt om de neurobiologische mechanismen van angst leren en geheugen in transgene en knockout muizen 1,4-16 begrijpen. Invriezen gedrag, gedefinieerd als complete immobiliteit, met uitzondering van de ademhaling, is een gemeenschappelijke reactie op angstige situaties. In deze gedrags-paradigma, nadat de dieren zijn blootgesteld aan een koppeling van een auditieve cue met een elektrische footshock, ze reageren op de angst-producerende stimulus door het weergeven van bevriezing gedrag, dat wordt gemeten als een index van associatieve angst leren en geheugen. Deze test vereist minder uitgebreide uitrusting, minder lichamelijke inspanning door de onderzoeker, en veel minder trainingstijd voor muizen dan andere leer-en geheugentaken, het vergt gewoonlijk ongeveer 5-10 minuten / dag per muis voor 2 dagen. Hoewel de testprocedure is siMPLE en vergt weinig tijd uit te voeren, moet de onderzoeker zorgvuldig te observeren en meten muisgedrag, daarom werden verschillende geautomatiseerde meetsystemen ontwikkeld om de gedragsanalyse 17-20 voeren. Onze video-analysesysteem, die we ontwikkeld met de ImageFZ softwareprogramma, stelt ons in staat om gemakkelijk te analyseren bevriezing gedrag en produceren van zeer betrouwbare resultaten. Dit artikel geeft gedetailleerde informatie over onze testprocedure en beschrijft hoe de ImageFZ software programma te gebruiken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle van de experimenten moeten worden uitgevoerd volgens de richtlijnen en protocollen vastgesteld door de lokale Animal Care en gebruik comites.

1. Apparaat instellen

  1. De inrichting voor het conditioneren en context-test is een vierkante kamer met een electrifiable roostervloer, een geluidsbron, en een gekalibreerd schok generator. Verschillende kamer maten worden gebruikt, met afmetingen variërend van 54 cm x 27 cm x 30 cm 21 tot 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. In dit protocol, het apparaat bestaat uit een acryl vierkante kamer (33 cm x 25 cm x 28 cm, transparant in het voor-en achterwanden, wit in de zijwanden) met metalen roosters (0,2 cm diameter, een afstand van 0,5 cm van elkaar) gedekt een transparant acryl deksel (Figuur 1A). Het is noodzakelijk om de kamer te plaatsen op een wit acryl vloer (Figuur 1B) om het gedrag van zwart, agouti, of verdunde bruine muizen geanalyseerd, omdat een beeld analysesysteem met de ImageFZ software (gratis te downloaden, zie tabel van materialen / reagentia) onderscheidt een donker onderwerp van een witte achtergrond in elk beeld opgenomen video. Albino muizen kunnen ook getest met zwarte metalen roosters en een zwarte acrylaat vloer (Figuur 1B). Light-emitting diode (LED) lampjes aan het plafond boven het apparaat is aangesloten. De roostervloer is verlicht met 100 lux door de LED-verlichting. Een luidspreker verbonden met een witte ruis / toongenerator (figuur 1C) gemonteerd op een plafond 5 cm boven het deksel een auditieve cue (witte ruis, 55 dB) presenteren als een geconditioneerde stimulus (CS). De roosters zijn aangesloten op een schok generator (figuur 1C) om een elektrische footshock leveren zoals de ongeconditioneerde stimulus (US). De testkamer wordt geplaatst in een geluiddichte ruimte (170 cm x 210 cm x 200 cm) (figuur 1D) om externe ruis tijdens de tests te beperken. Deze voorwaarde voorkomt ook de muizen die momenteel niet worden onderworpen aan eentesten van het horen van een auditieve cue of de vocalisatie van de test muizen.
  2. De inrichting voor het gecuede proef bestaat uit een kamer die verschillende eigenschappen uit de bovengenoemde kamer heeft, die een nieuwe context. Het is noodzakelijk om de zintuiglijke signalen veranderen zoveel mogelijk, zodat de muis waarneemt roman context als los van de conditioneringskamer. In het algemeen wordt een anders gevormde doos of een driehoekige kamer gebruikt. Daarnaast worden verschillende verlichting en / of olfactorische signalen ook voorzien aan de muis. In dit protocol is het apparaat een acryl driehoekige kamer (33 cm x 29 cm x 32 cm; wit in elke zijwand) met een platte, witte vloer voor zwart, agouti, of verdunde bruine muizen of een platte, zwarte vloer voor albino muizen, bedekt met een transparant acryl deksel (figuur 1E). LED-lampen worden aan het plafond boven het apparaat is aangesloten. De lichtsterkte van de vloer is 30 lux. Een luidspreker aan het plafond 5 cm boven het deksel gemonteerd prESENT een auditieve cue die dezelfde is als die bij de conditionering die aan de muizen. De driehoekige kamer is gelegen in een andere geluiddichte ruimte van de kamer waarin de conditionering en context-test worden uitgevoerd.
  3. Elke kamer is uitgerust met een plafond gemonteerde Charge Coupled Device (CCD) camera aansluit op een Windows-computer via quad video splitter en USB beeldvastleginrichting om het gedrag van de muis te controleren, en beelden van de apparatuur en de muis worden opgevangen en geanalyseerd door de applicatiesoftware programma ImageFZ (zie Protocol nr. 6). De witte ruis en footshock generatoren worden automatisch geregeld door het ImageFZ softwareprogramma, de starttijd en de duur van de witte ruis en footshock moet worden geschreven in een tekstbestand (zie een voorbeeld tekstbestand 'eenvoudig-cond' getoond in de video voor de informatie over de parameters worden geschreven in het bestand), die wordt gelezen in de applicatie.
  4. Vóór elke test begint, de acryl wandenen vloeren worden afgeveegd met een handdoek gedrenkt in super hypochloorzuur water (pH 6-7), en de roosters worden schoongemaakt met 70% ethanol om een ​​voorspanning op basis olfactorische signalen voorkomen. De roosters worden afgeveegd met ethanol in plaats van super hypochloorzuur water zodat de roosters niet hun elektrische geleidbaarheid verminderen door roest.

2. Bereiding van dieren

  1. Over het algemeen zijn 2-4 muizen gehuisvest per kooi in een temperatuurgecontroleerde dierenverblijf (23 ± 2 ° C) met een 12 uur licht / donker-cyclus (bv. lichten aan om 07:00).
  2. In dit protocol mogelijke invloeden kooi transport verminderen gedrag en de muizen aan de experimentele omgeving, worden de kooien met de muizen overgedragen van het dierenverblijf in een geluiddichte wachtkamer naast een geluiddichte testkamer tenminste 30 minuten voor elke test begint.
  3. Alle experimenten (Figuur 2A) moeten in het s worden uitgevoerdame periode in de lichte of donkere fase elke dag naar de gedrags-varianten geproduceerd door het testen op verschillende tijdstippen 23,24 minimaliseren. In dit protocol alle experimenten worden uitgevoerd tussen 1 uur na het begin van de lichtperiode en 1 uur voor het begin van de donkere fase (8:00-18:00 in de lichte fase). Als er slechts een apparaat beschikbaar is, moet muizen van elk genotype worden getest in een vorkheftruck om de potentiële effecten van de experimentele tijd en de testen te onderwerpen op gedrags-prestaties verminderen. ImageFZ kan maximaal 4 apparaten bedienen. Testen 4 muizen tegelijk met behulp van 4 apparaten in een gecompenseerd orde stelt de onderzoeker om tijd te besparen en vermindert de mogelijke effecten van de experimentele parameters op muisgedrag.

3. Conditioning

  1. Muizen worden geplaatst in de conditioneringskamer, en de muizen zijn meestal toegestaan ​​om de ruimte vrij te verkennen voor 120 sec. Daarna worden de auditory cue, zoals een witte ruis, toon, en auditieve clicker, wordt gepresenteerd als een CS voor 30 sec, en een 0,1-0,8 mA footshock wordt gegeven aan de muizen als de VS tijdens de laatste 2 seconden van het geluid. De presentatie van de CS-US paring wordt herhaald om de vereniging te versterken. De muizen worden achtergelaten in de kamer voor een bepaalde tijd na de laatste presentatie aan de associatie tussen de context van de kamer en de aversieve ervaring verder te vestigen. In dit protocol, na 120 sec van vrije exploratie, een auditieve cue (witte ruis, 55 dB) wordt aangeboden voor 30 sec, en een 0,3 mA footshock wordt tijdens de laatste 2 seconden van de witte ruis continu geleverd. Na 90 sec, is de koppeling van de auditieve cue met de footshock die aan de proefpersonen weer. De presentatie van de CS-US herhaalt drie keer per sessie (120, 240, en 360 seconden na het begin van de conditionering) (Figuur 2B). Na de laatste footshock worden de muizen ongestoord gelaten in de kamers voor 90 sec.
  2. Vóór de conditionering sessie begint, lopen de ImageFZ applicatie software, selecteert u de plug-in menu 'FZ Conditioning en FZ Online (4 kamer)', en stel de parameter waarden stap-voor-stap als volgt.
    1. Stap 1: Project-ID. Geef een map waar u uw gegevens op te slaan.
    2. Stap 2: Sessienaam. Typ de woorden, zoals de experimentele datum, in de 'Session' in en selecteer een verwijzing tekstbestand waarin de starttijd en de duur van de witte ruis en footshock zijn geschreven, in de 'Reference' doos. Een voorbeeld tekstbestand in beeld.
    3. Stap 3: parameterinstellingen. Voer parameterwaarden in elk vak als volgt.
      1. Rate (beeld / sec): frame rate van het beeld acquisitie, bijv. 1 beeld / sec.
      2. Duur (sec): in het geval van conditionering, de totale duur van 480 sec.
      3. Bin duur (sec): bv 60 sec, de gegevens worden geanalyseerd in elk blok60 sec.
      4. Onderwerp formaat - min (pixels): ImageFZ een muis en lawaai als zwarte deeltjes (enkele massa van pixels) op een witte achtergrond in elk beeld detecteert. Wanneer het gebied van de zwarte deeltjes (pixels) kleiner is dan de 'Subject grootte - min (pixels) "waarde (bijvoorbeeld 100 pixels), de deeltjes worden beschouwd als ruis en worden uitgesloten van de beeldanalyse.
      5. Onderwerp formaat - max (pixels): wanneer de grootte van de zwarte deeltjes zijn meer dan de grootte van de 'Subject grootte - max (pixels) "waarde, de deeltjes zijn uitgesloten van de analyse.
      6. Framemaat - breedte / hoogte (cm): kamer dimensie, dwz 33 cm breed en 25 cm hoog.
      7. Invriezen criterium (pixels): bv 30 pixels, zie de details in protocol 6.
      8. Invriezen duur - min (sec): bijv. 2 sec, als er geen muis beweging wordt waargenomen voor slechts minder dan 2 seconden, wordt het gedrag niet als 'bevriezen';.
      9. Shock-tarief (beeld / sec): zie de details in protocol 6.
    4. Stap 4: Onderwerp ID. Voer het onderwerp identificatie.
    5. Stap 5: Camera-instellingen. Controle van de helderheid en het contrast van het vastgelegde beeld.
    6. Stap 6: Threshold Settings. Pas de drempelwaarden een zwarte muis detecteren als zwarte pixels in een witte achtergrond in elk beeld en muisgedrag oordelen als 'freezing' of 'non-freezing' (zie de details in Protocol nr. 6). Om een ​​albino muis analyseren, klikt u op het selectievakje 'omkeren mode', en de drempelwaarden juiste wijze aan te passen.
    7. Stap 7: Stel Cage Field. Geef het gebied van elke kamer die u wilt vastleggen. Na het klikken op de rechthoek knop in de toolbox, trek een rechthoek om de vloer van de kamer op het live-beeld venster. Selecteer vervolgens de kamer in en klik op de knop 'Instellen'. Klik ten slotte op de knop 'Compleet'.
  3. Nadat de parameters zijn ingesteld, moet een voorbereidend onderzoek worden gegeven met behulp van de praktijk muizen (muizen niet gebruikt als proefpersonen) voor de eerste test van de dag om te bepalen of het beeld analysesysteem en witte ruis / shock generatoren werken zonder problemen.
  4. Verplaats een kooi met daarin de praktijk muizen om de geluidsdichte testkamer van de aangrenzende wachtkamer, en leg elke muis in de conditioneringskamer. Onmiddellijk na het plaatsen van de muizen in de kamer, klikt u op de startknop van ImageFZ. De software zal auditief en / of elektrische footshocks presenteren aan de muizen in de volgorde die u opgeeft in een referentiebestand.
  5. Na 480 seconden verstreken, de terugkeer van de muizen naar hun kooi en de terugkeer van de kooi om de plank in de verhoorkamer.
  6. Reinig de kamers zorgvuldig. Klik vervolgens op 'Next Analysis' knop, en herhaal de stappen 3.2.4-3.6 voor de test muizen.
  7. ImageFZ winkels wonen en traceren afbeeldingen in het TIFF-formaat. Het programma staatons naar een offline analyse uit te voeren om de beelden opnieuw te analyseren met behulp van aangepaste parameterwaarden. Als u een offline analyse uit te voeren, selecteert u de plug-in menu 'Fear Conditioning en FZ Offline' en selecteer de map data die u wilt opnieuw analyseren. Daarna voer de parameterwaarden weer, en klik op de knop 'Compleet'.

4. Context Test

  1. Na het conditioneren sessie is voltooid, worden de muizen terug naar dezelfde conditioneringskamer en scoorde voor het invriezen van gedrag contextueel geconditioneerde angst (context test) te meten. Een vertraging interval tussen de conditionering en de context test is over het algemeen vastgesteld op 24 uur. In dit protocol, aan de recente geschiedenis en externe geheugen (gemeten door de test 1 dag en meer dan 28 dagen na deze behandeling, respectievelijk) 25 te beoordelen, worden de muizen blootgesteld aan de context test ongeveer 24 uur en 30 dagen na de conditionering sessie. De muizen worden in de cond geplaatstitioning kamer en mogen de kamer voor 300 sec vrij te verkennen zonder CS en US presentaties (figuur 2C).
  2. Voer het ImageFZ softwareprogramma en stel parameterwaarden de applicatie software op dezelfde wijze als in de inrichting (zie paragraaf 3.2.3), maar wijzigt de tijdsduur van de test 300 seconden en selecteer verwezen tekstbestand verband proef . Na het wijzigen van de instelling, moet een voorbereidend onderzoek worden gegeven met behulp van de praktijk muizen om de ImageFZ systeem te controleren.
  3. Plaats elke muis in de conditioneringskamer en klik op de startknop. Na 300 seconden verstreken, de terugkeer van de muizen in hun kooi, en totdat de cued test begint laat de kooi ongestoord.
  4. Reinig de kamers. Klik vervolgens op 'Next Analysis' knop, en herhaal de stappen 4,3-4,4 in de test muizen.

5. Cued Test

  1. Cued test wordt uitgevoerd op dezelfde dag van de proef context of op de volgende dag.In deze test worden muizen geplaatst in een testkamer met zeer verschillende eigenschappen, die een nieuwe context die geen verband houdt met de conditioneringskamer gedurende 3 minuten. Aan het einde van de eerste 3 minuten, wordt het auditieve signaal dat wordt gepresenteerd bij de conditionering gegeven aan muizen gedurende 3 min in de nieuwe context milieu. In dit protocol wordt ingelast uitgevoerde test een paar uur na de context test. Muizen worden toegestaan ​​om de driehoekige ruimte verkennen voor 360 sec. In de eerste 3 min, noch een CS noch de VS wordt gepresenteerd, en daarna, een CS (een 55 dB witte ruis) wordt gepresenteerd voor de laatste 3 minuten.
  2. Voer het ImageFZ softwareprogramma en de parameter waarden op dezelfde wijze als in conditionering, behalve de tijdsduur van de proef modificeren tot 360 seconden en selecteer een referentietekst bestand voor de geactiveerde test. Na het instellen moet een voorbereidend onderzoek worden gegeven met behulp van de praktijk muizen om de ImageFZ systeem te controleren.
  3. Plaats elke muis in de driehoekige kamer en klik op de startknop. Na 360 seconden verstreken, de terugkeer van de muizen naar hun kooi en de terugkeer van de kooi om de plank van het bedrijf kamer.
  4. Reinig de kamers. Klik vervolgens op de 'Next Analysis "knop en herhaal de stappen 5,3-5,4 in de test muizen.
  5. Om verder te testen externe geheugen, herhaal de Protocollen 4-5 ongeveer 30 dagen na de conditionering sessie (Figuur 2A).

6. Beeldanalyse

  1. Voer data-acquisitie en-analyse automatisch met behulp ImageFZ. Deze applicatie software programma is gebaseerd op het publieke domein ImageJ programma (ontwikkeld door Wayne Rasband bij de National Institutes of Health en die tegen http://rsb.info.nih.gov/ij/), gewijzigd door Tsuyoshi Miyakawa (ImageFZ applicatiesoftware , beschikbaar als gratis download, zie tabel van materialen / reagentia).
  2. Voor alle experimenten, beelden vast te leggen op een bepaald frame rate (bijv. 1 fps) met ImageFZ met een USB-video-opname-apparaat, zoals eenvideocamera. Om de afgelegde afstand van de opeenvolgende beelden te meten, waarde van het programma (bijvoorbeeld 80 pixels), die is ingesteld om het segment van de beelden in een zwart deeltje (een muis) en een witte achtergrond de 'drempel min' aan te passen. De afgelegde afstand wordt berekend uit de afstand tussen elke set van de xy-coördinaten van het zwaartepunt van het deeltje in de opeenvolgende beelden.
  3. Om de bevriezing gedrag van de opeenvolgende beelden te meten, stel de 'drempel min (xor) "waarde van het programma (bijvoorbeeld 160 pixels), die is ingesteld om het segment van de beelden in een zwart deeltje (muis) en de achtergrond, en berekent vervolgens de hoeveelheid ruimte (pixels) van de overlappende gebieden tussen deeltjes van elk paar opeenvolgende afbeeldingen. Pas de waarde met behulp van de schuifregelaar van de drempel gereedschap totdat de zwarte deeltje in elk beeld overeenkomt met de vorm van het hele lichaam van de muis met uitzondering van de staart. Als het gebied van de nonoverlapping gebied onder de "bevriezing criterium" waarde (bijv. 30 pixels) wordt het gedrag beschouwd als "bevriezing" (figuur 3), die over het algemeen wordt gedefinieerd als een totale afwezigheid van beweging behalve ademhaling en hartslag. Wanneer het gebied boven deze waarde wordt het gedrag als "niet-freezing '(figuur 3) zijn. Het vonnis moet worden gemaakt op basis van de definitie van het vriespunt. Muizen soms vertonen een subtiele beweging en een tijdelijke immobiliteit, die niet kan worden beschouwd als een bevriezing gedrag dat angst weerspiegelt. De immobiliteit dat duurt een korte tijd (bijvoorbeeld minder dan 2 seconden), die waarschijnlijk verschilt van de manifestatie van angst, kan de analyse worden uitgesloten door de tijd drempel van bevriezing. Waarde (bijv. 2 sec) - Om de tijd drempel, input 'min (sec) Invriezen duur' set.
  4. De ImageFZ programma automatisch calculates de afgelegde afstand (cm) en het percentage bevriezing. De resultaten worden opgeslagen in tekstbestanden en leven en sporenelementen beelden worden opgeslagen in een TIFF formaat. Voor het meten van de afgelegde afstand (cm) als een index van elektrische footshock gevoeligheid, het ImageFZ programma verwerft ook beelden met een hoge framerate (bijv. 4 fps) voor 6 seconden, gemeten vanaf 2 seconden voordat de levering van een 2 sec footshock tot 2 sec na footshock tijdens online analyse. Om de frame rate voor het vastleggen instellen voor, tijdens, en na footshock, voer een waarde in de 'Shock tarief (beeld / sec)' box. Na de online analyse uitvoeren offline analyse door een plug-in menu 'FZ Shock Offline' om de gegevens voor de afgelegde afstand te verkrijgen selecteren.
  5. De parameter waarden van de ImageFZ programma moet worden geoptimaliseerd om de resultaten vergelijkbaar zijn met die verkregen door menselijke waarnemers in de voorbereidende testen genereren. Voor handmatige scoring, wordt de bevriezing gedrag continu gemeten met behulp van een stopwatch en een event-opname programma of een onmiddellijke time-sampling procedure elke 3-10 seconden, tijdens de analyse met behulp van ImageFZ software. Twee waarnemers typisch gedrag van de gedragsobservatie. Om de parameter waarden van de ImageFZ programma 'bevriezen criterium' waarden aan te passen om ervoor te zorgen dat de uitkomsten van de beeldanalyse zijn consistent met die van menselijke waarnemers, voeren een offline analyse van de ImageFZ programma, het aanpassen van de 'drempel min (xor)' en . Om de offline analyses uit te voeren, selecteert u de plug-in menu 'FZ Offline' en voer een parameter waarden.

7. Problemen oplossen

  1. Hoe kan het ImageFZ programma worden verkregen en geïnstalleerd?
    Het ImageFZ programma is gratis te downloaden van onze website (zie tabel van materialen / reagentia) en draait op een Windows-computer. Download de folder rits voor ImageFZ en installeren van de software op uw computer. Zie de 'readme.txt' bestand voor de installatop details en volg de instructies stap-voor-stap.
  2. Waarom wordt de foutmelding 'Error instelling capture device' weergegeven?
    Controleer de aansluiting van de camera kabel en uw installatie van het stuurprogramma van de afbeelding USB-opnameapparaat. Als er geen probleem is met de instellingen en de ImageFZ software werkt mogelijk niet met uw beeldopname apparaat. Zie de 'readme.txt' bestand met betrekking tot het juiste apparaat te gebruiken met ImageFZ software.
  3. ImageFZ kan het hele lichaam van de muis niet detecteren als een deeltje.
    Stel de waarde van de 'drempel min' en / of 'drempel min (xor)' lager dan de huidige waarde. Als ImageFZ de muis niet kan detecteren in een bepaalde plaats, bijvoorbeeld de hoek van een testkamer, dan onvoldoende testomstandigheden, zoals een uniform verlicht vloer of een iets contrasterende verschil tussen de muis en de achtergrond, kunnen bestaan. Om dit probleem op te lossen, stelt u de parameter waarden (bv. helderheid en het contrast van het live-beeld en drempelwaarden) van ImageFZ, controleren het aantal en de positie van het licht, of gebruik een witte achtergrond voor een zwarte muis.
  4. Vastleggen van het beeld op een hoge framerate vertraagt ​​de computer tijdens het online analyse.
    Stel de frame rate op een waarde lager dan de huidige koers, en het uitvoeren van online analyse. De ImageFZ analyse door beeldacquisitie 1 fps, volstaat voor het nauwkeurig meten bevriezen, zie de resultaten representatief gedeelte.
  5. De resultaten van de analyse ImageFZ het niet eens met die van de menselijke scoren.
    Onderzoekt het opgeslagen beeld en oordeel resultaat bestanden. Als ImageFZ overschat bevriezen, stelt u de 'bevriezing criterium' op een waarde lager dan de huidige waarde, en het uitvoeren van offline analyse. Als ImageFZ onderschat bevriezen, stelt u de 'bevriezing criterium' op een waarde hoger dan de huidige waarde.
  6. In optogenetical en in vivo elektrofysiologische experiments, de glasvezelkabel aan de kop van de muis interfereert met het oordeel van het vriespunt.
    De vacht van de kabels in het wit voor een zwarte muis, en verander de positie en de hoek van de camera totdat de kabels niet worden gedetecteerd.
  7. Wat nodig voor offline analyse?
    Maak een map met de naam 'Image_FZ' in de root directory van de ImageFZ programma. In deze map is, maakt de submappen 'Images' en 'Sessions'. Verplaats een Grijswaardenbeeld 8 bit naar de map 'Afbeeldingen', en een tekstbestand waarin de naam van het bestand is geschreven in de map 'Sessions'. Daarna lopen de ImageFZ offline analyse, en volg de instructies van het programma.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de vreesconditionering test menselijke onderzoekers gebruikt om de bevriezing gedrag Kwantificering via arbeidsintensieve directe observatie 26-29, maar onlangs fotocel computer metingen (bijv. de 'Freeze Monitor systeem) en beeld-analysesystemen zijn gebruikt om automatisch meten de bevriezing gedrag 26,30-32. ImageFZ is een geautomatiseerd beeld-analysesysteem dat resultaten vergelijkbaar met die verkregen door menselijke waarneming produceert, zoals hieronder beschreven. Hier hebben we de uitkomsten van de menselijke waarneming met die van ImageFZ analyse onder variërende parameters: 'Rate (beeld / sec)' en 'Freezing criterium (pixels).' In dit experiment, vijf mannelijke C57BL/6J muizen (gemiddelde lichaamsgewicht ± SD (g) 31,4 ± 3,55, gemiddelde ± SD lichaamsgrootte (pixels), 351,6 ± 62,2) werden bij 15-27 weken. De menselijke waarneming werd gedaan met behulp van een event-opname-programma (een Macintosh OS9 softwareprogramma), een toets in te drukken gebeurtenis die nog steedsd 2 seconden of meer wanneer een muis toonde een aanval van geen beweging werd beschouwd als 'bevriezing'. Het percentage van de bevriezing werd berekend om de 60 seconden in elke test en gebruikt voor correlatie analyses. Het percentage van het bevriezen gescoord door de 2 waarnemers (interbeoordelaarsbetrouwbaarheid, voor het conditioneren, r = 0,879, want context test, r = 0,957, want gecued test, r = 0,866, voor alle gevallen, r = 0.888) werd gemiddeld om een ​​mens te genereren scoren. Correlaties tussen de bevriezing percentages gemeten door ImageFZ met elk frame rate (dwz 1, 2, en 4 fps) en die verkregen door menselijke waarnemingen werden onderzocht. Zoals geïllustreerd in figuur 4, werden de bevriezing percentages berekend door ImageFZ (1, 2, en 4 fps) sterk gecorreleerd met de gemiddelde waarde verkregen uit de metingen van de 2 waarnemers. Met name het vastleggen van beelden met een hogere framesnelheid leidt niet altijd tot de beste correlatie. Beeldanalyse bij 1 bps gegenereerde resultaten vergelijkbaar zijn met die verkregen uit menselijke waarnemers in each test. Correlaties tussen de bevriezing percentages gemeten door menselijke waarnemingen en het gebruik ImageFZ onder elke conditie van de 'Freezing criterium (pixels) "(dwz 20, 30, en 40 pixels) werden onderzocht. De bevriezing percentages berekend met ImageFZ in 'Freezing criterium (pixels) "van 20, 30 en 40 pixels zijn, in alle gevallen sterk gecorreleerd met die verkregen door menselijke waarnemingen (figuur 5). Zoals getoond in figuur 5D, wanneer de bevriezing criterium is ingesteld op een lage waarde, de subtiele beweging van een muis, worden beschouwd als "bevriezing" door menselijke waarnemers, zou worden beschouwd als "niet bevriezen 'met ImageFZ. Indien daarentegen het criterium is ingesteld op een hoge waarde, de beweging van een muis, scoorde "niet invriezen" door menselijke waarnemers, zou worden beschouwd als "bevriezing" met ImageFZ (figuren 5C, 5F en 5I). Dus, om de meest betrouwbare resultaten te verkrijgen, elke parameter van het ImageFZ programma worden gekalibreerd onsdaarbij de gegevens gescoord door menselijke waarnemingen in elke testomgeving.

Verder vergeleken we de door een menselijke waarnemer resultaten, met behulp van een fotocel computer meetsysteem (het Freeze monitor systeem), die verkregen met ImageFZ (zie figuur 6). De menselijke waarnemer werd verblind om de behandelde groep en de resultaten van ImageFZ scoren. Voor de parameterinstellingen van het Freeze Monitor systeem, gebruikten we 3 metingen van het percentage van het bevriezen van een eerder gevalideerd 30. Kortom, het aantal 10-seconden intervallen waarin de dieren vereiste meer dan 1 of 2 seconden tot de eerste nieuwe straal van het interval (1 sec 10 sec 10 sec en 2 sec, respectievelijk) en de wachttijd tussen het begin van elke 5 seconden interval overschrijden en de derde nieuwe bundel onderbreking binnen dit interval (Latency3) werden gemeten. De percentages van de intervallen waarin de muis werd bevriezing of het percentage van de totale tijd rerplicht te breken de derde fotocel werden berekend.

De percentages invriezen gemeten in elk systeem zijn weergegeven in figuur 6. De groepen werden vergeleken met behulp van twee-weg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door de t-test (zie tabel 1). De bevriezing percentages gemeten met ImageFZ (figuur 6B) waren vergelijkbaar met die behaald door menselijke waarneming (Figuur 6A) dan verkregen met behulp van een fotocel systeem (figuren 6C-E) gegevens. De bevriezing percentages gemeten met de ImageFZ programma in elke test waren sterk gecorreleerd met die behaald door menselijke waarneming (conditioneren, r = 0,947, context test, r = 0.970, geactiveerde test, r = 0,934), terwijl de correlaties tussen de bevriezing percentages gemeten met behulp van de fotocel computer meetsysteem (1sec 10sec, 2sec 10sec of Latency3) en de menselijke waarnemer waren lager (conditionering, r = 0.503, 0.593 en 0.761; context test, r = 0,772, 0,819 en 0,912) vergeleken met de correlaties tussen de bevriezing percentages gemeten met ImageFZ en menselijke waarneming (figuren 7A en 7B). Daarnaast figuur 7 blijkt dat de verschillen tussen de bevriezing percentages verkregen door menselijke waarneming en gebruik ImageFZ in elke muis werden de kleinste verschillen. Deze resultaten gaven aan dat de bevriezing percentages gemeten met ImageFZ waren vergelijkbaar met die verkregen door menselijke waarneming en ImageFZ erg goed is bij het meten van de hoeveelheid bevriezing.

figure-results-1
Figuur 1. Apparaten voor de contextuele en cued vreesconditionering test. (A) Een acryl vierkante kamer voor de conditionering en context test, ( B) metalen roosters op een witte plastic vloer voor zwart, agouti, of verdunde bruine muizen (boven) en electrifiable black metal roosters op een zwarte kunststof vloer voor witte muizen (onderaan); vergrote beelden van de roosters worden in de juiste paneel, (C) een witte ruis / toongenerator en een schok generator, (D) een geluiddichte ruimte, en (E) een acryl driehoekige ruimte met een vlakke vloer voor de cued test. Klik hier voor grotere afbeelding.

figure-results-2
Figuur 2. Schematische weergave van het protocol. (A) Overzicht van de contextuele en cued vreesconditionering test, (B) conditionering, (C) cONTEXT test, en (D) gecued test. Klik hier voor grotere afbeelding.

figure-results-3
Figuur 3. Beeldanalyse de ImageFZ softwareprogramma. Voor elk paar opeenvolgende afbeeldingen, de oppervlakte die (pixels) waarmee de muis bewogen wordt berekend door ImageFZ. Wanneer dit gebied is onder een bepaalde drempel (bijvoorbeeld 30 pixels) wordt het gedrag geacht worden te 'bevriezen'. Wanneer de hoeveelheid van het gebied gelijk is aan de drempelwaarde overschrijdt, wordt het gedrag als 'non-bevriezing' zijn. Klik hier voor grotere afbeelding.

figure-results-4
Figuur 4. Vergelijkingen van de bevriezing percentages berekend op basis van beelden op verschillende framerates behulp ImageFZ met die gemeten door middel van de menselijke waarneming. De angst conditionering tests werden uitgevoerd met behulp van mannelijke C57BL/6J-muizen (n = 5). Tijdens de proeven, twee waarnemers scoorde de bevriezing gedrag. Tegelijkertijd werden live beelden vastgelegd op 4 fps met behulp van de ImageFZ programma. De bestanden die zijn gemaakt op 4 fps werden afgeslankt na extractie de frames overeen te komen met beelden die zijn vastgelegd op 1 fps of 2 fps. De parameter waarden van 'Rate (beeld / sec) werden ingesteld op 1, 2 of 4 fps, en invriezen percentages in elke 60-sec bin werden berekend uit beeldbestanden te ImageFZ offline analyse. Elke stip vertegenwoordigt een bevriezing percentage van elke 60-sec bin. Pearson's correlatiecoëfficiënten tussen de verkregen uit menselijke waarneming en ImageFZ analyse gegevens werden berekend.Klik hier voor grotere afbeelding.

figure-results-5
Figuur 5. De bevriezing percentages berekend uit de beelden op verschillende bevriezen criterium waarden met ImageFZ en de gemeten door menselijke waarnemingen werden vergeleken. Het vreesconditionering proeven werden mannelijke C57BL/6J muizen (n = 5). Tijdens de proeven, twee waarnemers opgenomen de bevriezing gedrag, en de live beelden werden vastgelegd met behulp van de ImageFZ programma. De bevriezing percentages per 60 sec bin werden berekend uit de afbeeldingen (1 beeld / sec) door ImageFZ offline analyse, waarin de parameterwaarden van "Freezing criterium (pixels) om 20, 30 of 40 pixels. Elke stip vertegenwoordigt een bevriezing percentage van elke 60-sec bin. Pearson's correlatie cocoëfficiënten tussen de verkregen uit menselijke waarneming en de ImageFZ analyse gegevens werden berekend in elke test. Klik hier voor grotere afbeelding.

figure-results-6
Figuur 6. De percentages van bevriezing werden gemeten met behulp van geautomatiseerde systemen en menselijke waarneming in ongeconditioneerde en geconditioneerde groepen mannelijke C57BL/6J muizen (n = 5 elke groep). (A) menselijke waarneming, (B) ImageFZ, (C) Freeze Monitor systeem 1 (1sec 10sec), (D) Freeze Monitor systeem 2 (2sec 10sec) en (E) Freeze Monitor system 3 (Latency3). Groep vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van twee-weg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door de t-test (ongecoördineerdnditioned groep versus geconditioneerde groep, *, P <0,05; †, p <0,01). De verkregen met behulp ImageFZ waren vergelijkbaar met die scoorde door menselijke observatie data. Klik hier voor grotere afbeelding.

figure-results-7
Figuur 7. Correlatie en frequentieverdeling van de verschillen tussen de bevriezing percentages, gemeten met behulp van geautomatiseerde systemen en de menselijke waarneming. (AB) Spreidingsdiagrammen en Pearson's correlatiecoëfficiënten tussen het vriespunt percentages gescoord door geautomatiseerde systemen en menselijke waarneming worden getoond. De bevriezing percentages, berekend op basis van ImageFZ, waren sterk gecorreleerd met die verkregen door menselijke waarneming. (CF) Voorkomen van minder dan 10% verschilschil tussen de bevriezing percentages verkregen uit geautomatiseerde systemen versus menselijke waarneming hoogste waren toen de gegevens geanalyseerd met behulp ImageFZ werden vergeleken met die door menselijke observatie geanalyseerd. Klik hier voor grotere afbeelding.

ANOVA
Voorwaarde Tijd Voorwaarde x Tijd
Dag 1 (conditionering)
Menselijk F (1,8) = 28.53, p = 0.0007 F (7,56) = 20.79, p <0,0001 F (7,56) = 16.58, p <0,0001
ImageFZ F (1,8) = 13.97, p = 0,0057 F (7,56) = 21.40, p <0,0001 F (7,56) = 11,69, p <0,0001
Freeze Monitor (1sec10sec) F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 F (7,56) = 2,39, p = 0,0329 F (7,56) = 0,72, p = 0,6572
Freeze Monitor (2sec10sec) F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 F (7,56) = 3,44, p = 0.0039 F (7,56) = 1,52, p = 0,1803
Freeze Monitor (Latency3) F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 F (7,56) = 9,94, p <0,0001 F (7,56) = 4,33, p = 0.0007
Dag 2 (context)
Menselijk F (1,8) = 42,94, p = 0,0002 F (4,32) = 1,91, p = 0,1336 F (4,32) = 1,48, p = 0,2302
ImageFZ F (1,8) = 49,61, p = 0,0001 F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 F (4,32) = 0,83, p = 0,5174
Freeze Monitor (1sec10sec) F (1,8) = 20,28, p = 0,002 F (4,32) = 1,63, p = 0,1918 F (4,32) = 0,55, p = 0,6997
Freeze Monitor (2sec10sec) F (1,8) = 40,20, p = 0,0002 F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 F (4,32) = 1,20, p = 0,3306
Freeze Monitor (Latency3) F (1,8) = 35,30, p = 0.0003 F (4,32) = 2,49, p = 0.0626 F (4,32) = 1,09, p = 0,3793

Tabel 1. Vergelijkingen van de statistieken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De contextuele en cued vreesconditionering test is een van de meest gebruikte paradigma's te leren en geheugen te beoordelen. Deze test is een vorm van Pavlov-conditionering waarbij een associatie wordt gemaakt tussen een context en / of een geconditioneerde stimulus (auditieve cue) en een aversieve stimulus (elektrische footshock). Na zelfs een enkele koppeling van de context / auditieve cue en footshock, muizen vertonen langdurige bevriezing wanneer zij worden geconfronteerd met ofwel de context of de cue. In deze test wordt bevriezing gedrag gebruikt als een index van angst geheugen. Farmacologische en laesie studies hebben uitgewezen dat de vorming van het geheugen, de consolidatie en het ophalen worden gereguleerd door verschillende gebieden van de hersenen, zoals de amygdala, hippocampus en de prefrontale cortex 3,33-35. Bovendien hebben moleculaire genetica studies de rol van specifieke genen en moleculen betrokken bij leren en geheugen in deze hersengebieden met behulp van genetisch gemanipuleerde muizen 36 aangetoond. Daarom is deze test is simple en nuttig voor het verkennen van de neurobiologische basis onderliggende angst leren en geheugen. In deze film artikel hebben we ons protocol ingevoerd om onderzoekers te voorzien van gedetailleerde informatie te begrijpen en eenvoudig uitvoeren van de test.

Invriezen gedrag werd gekwantificeerd door middel van directe observatie door menselijke onderzoekers. Een goed opgeleide onderzoeker wordt verwacht dat betrouwbare, stabiele resultaten over waarnemingen te produceren. Deze methode houdt potentiële problemen, zoals verschillen in de waarnemings werkwijze waarnemer vooroordelen en eenvoudige kwantificering fouten, waardoor het moeilijk om direct de resultaten te vergelijken van onafhankelijke onderzoekers en verschillende laboratoria. Een geautomatiseerde-fotocel computer meetsysteem is ook gebruikt 26,30-32. Dit systeem presenteert ook potentiële problemen bij het meten bevriezen gedrag. Vanwege de sensor regeling, kan dit systeem niet in staat zijn om kleine hoofdbewegingen dat zou Typica detecterenlly gescoord worden als 'actief' door menselijke waarneming. Bovendien trillen tijdens bevriezing kan worden beschouwd als nonfreezing omdat wanneer een dier bevriest, intermitterende onderbrekingen in de fotocel wordt waargenomen als gevolg van trillen. Als een alternatieve methode, hebben geautomatiseerde beeld-en video-analysesystemen ontwikkeld 17-20,37,38. Anagnostaras et al.. 37 beschreven een paar systemen met beeldanalyse software programma's die goede validiteit te hebben en scoren invriezen goed 17,20,37-38. De meeste van deze systemen en analyseprogramma's moeten verkregen worden van commerciële leveranciers en zijn typisch kostbaar. We hebben de ImageFZ software voor de analyse van bevriezing gedrag, en dit programma wordt gedistribueerd als gratis softwareprogramma. ImageFZ detecteert de muis als een geheel van pixels (een deeltje) en discrimineert subtiele muisbewegingen als "bevriezen" of "niet-bevriezing" afhankelijk van de hoeveelheidgebied van de overlappende gebieden tussen deeltjes van elk paar opeenvolgende afbeeldingen. Zoals in de representatieve resultaten, metingen met het ImageFZ programma stroken met of nauwkeuriger dan verkregen met andere methoden. Zo is de ImageFZ programma meet automatisch het gedrag dat menselijke waarnemers oordelen als invriezen met behulp gedefinieerde criteria. Bovendien berekent het programma ImageFZ de afstand (cm) voor, tijdens en na blootstelling footshock, een beoordeling van de schok gevoeligheid en analyse van de bevriezing gedrag vergemakkelijken.

Methodologische verschillen bestaan ​​tussen laboratoria. Deze verschillen kunnen leiden tot moeilijkheden bij de vergelijking van gegevens tussen laboratoria en repliceren leidt tot verschillende laboratoria. Stabielere en vergelijkbare gegevens te verkrijgen, is het noodzakelijk standaardiseren het testprotocol zoveel mogelijk. Het analysesysteem met ImageFZ tot de automatisering van testprocedures, die bijdragen totde standaardisatie van protocollen gebruikt in laboratoria.

Verschillende gedragsreacties moeten worden overwogen wanneer het analyseren van bevriezing gedrag. Ten eerste, wanneer de dieren geconfronteerd met een angstige situatie, kunnen ze vluchten in plaats van invriezen 39. Vluchten is een van de angstreacties, en haar optreden zal leiden tot een onderschatting van angst geheugen. Ten tweede kan bevriezing afhankelijk zijn van een algemeen niveau van activiteit, en het activiteitenniveau in de experimentele en controle muizen moet worden onderzocht. Hoewel bijvoorbeeld muizen die het M1 muscarine acetylcholine receptor vertoonden verlaagde niveaus van bevriezen vergeleken met wildtype muizen, verschillende gedragstesten aangegeven dat de resultaten kunnen worden toegeschreven aan de hyperactiviteit fenotype plaats van de geheugenstoornis 18. ImageFZ berekent de afstand (cm) reisde door de proefpersonen. De gegevens zijn beschikbaar om te onderzoeken of er verschillen bestaan ​​in de algemene activiteit niveaus tussen onderwerpen. Als er een groep verschilde afgelegde afstand, een mogelijke aanpak van het probleem is om te overwegen de afgelegde afstand tijdens de eerste 2 minuten van de opleiding als de basislijn activiteit en een suppressieratio gebruiken (onderdrukking ratio = (activiteit tijdens het testen) / (activiteit tijdens basislijn + activiteit tijdens testing)) als een secundaire index van angst 17,40. Tenslotte kan een verschil in pijngevoeligheid, induceren de veranderingen in reactiviteit een elektrische footshock eventueel leiden tot variaties in bevriezen gedrag. ImageFZ berekent ook de afgelegde afstand (cm) in detail van 2 seconden voordat een blootstelling van 2 seconden footshock tot 2 seconden na blootstelling (gedurende 6 seconden), die kan worden gebruikt als een index van footshock gevoeligheid.

Video-analysesystemen zijn ontwikkeld om de bevriezing gedrag albino, zwart, agouti meten en verdund bruine muizen. ImageFZ maakt gebruik van een zwarte vloer dienblad en zwarte roosters aan witte muizen te onderzoeken (zie figuur 1B). De zwarte roosters zijn gemaakt van speci ally bewerkte metalen met gecoate zwarte verf en een elektrisch geleidingsvermogen vergelijkbaar met die van de niet-beklede metalen roosters, die doorgaans worden gebruikt voor zwarte muizen. ImageFZ analyseert ook de bevriezing gedrag bij ratten en andere knaagdieren door aanpassingen van het programma parameters. In de huidige versie van ImageFZ wordt het gedrag van de patiënt opgenomen met een videocamera van de bovenwand om bevriezing te analyseren. ImageFZ kan ook gebruikt worden in een set-up waar de beelden worden vastgelegd van de kant van de kamer. Bovendien regelt de ImageFZ maximaal 4 apparaten. Deze functie kan de onderzoeker om gelijktijdig te onderzoeken 4 muizen, bespaart tijd en het verminderen van de mogelijke invloeden van verschillen in de uitvoeringstijd van elk onderwerp en het testen te hebben op gedrag. Zo ImageFZ vereenvoudigt de testprocedure en analyse van bevriezing gedrag, en dit programma faciliteert het testen met minder arbeid en zonder enige training voor de gedragsexperimenten.

e_content "> In de Miyakawa laboratorium hebben we meer dan 110 stammen van genetisch gemanipuleerde muizen en wildtype controle muizen in de contextuele en geactiveerde vreesconditionering test met de video analysesysteem om de effecten van een bepaald gen op leren en geheugen helderen geëvalueerd 41-42 We hebben een grote set van ruwe data De ruwe data die werd gebruikt voor gepubliceerde wetenschappelijke artikelen 4-16 verkregen voor meer dan 5.000 muizen worden opgenomen in de 'Mouse Fenotype Database' als een openbare databank (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). De huidige film artikel geeft gedetailleerde informatie over de details van onze experimentele procedure en bevordert het inzicht in de testsituatie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij bevestigen dat er geen bekende belangenconflicten in verband met deze publicatie en er geen aanzienlijke financiële steun voor dit werk, dat de uitkomst kon zijn beïnvloed geweest.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sommige van de hier vermelde gegevens werden verkregen in het laboratorium van Dr Jacqueline N. Crawley in het Amerikaanse National Institute of Mental Health en we willen haar bedanken voor het toestaan ​​van ons om de gegevens in het document te tonen. We danken ook Kazuo Nakanishi voor zijn hulp bij het ontwikkelen ImageFZ programma voor gedragsanalyse. Dit onderzoek werd ondersteund door Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (B) (21300121), Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve Areas (Comprehensive Brain Science Network) van het ministerie van Onderwijs, Wetenschap, Sport en Cultuur van Japan subsidie ​​uit Neuroinformatica Japan Center (NIJC), en subsidies van CREST van Japan Science and Technology Agency (JST).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ImageFZ-programmaOntwikkeld door Tsuyoshi MiyakawaDit programma is verkrijgbaar via O'Hara & Co., Tokyo, Japan en gratis te downloaden op http://www.mouse-phenotype.org/. Deze software draait op 32-bit Windows XP/Vista/7. 
ConditioneringskamerO’Hara & Co., JapanCL-3002LVoor muis.
Aangeduide testkamerO’Hara & Co., JapanCLT-3002LVoor muis.
InterfaceO’Hara & Co., JapanCL-1040De interface bevat een witte ruis/toongenerator, die kan worden bediend door het ImageFZ-programma.
Gecodeerde shockgeneratorO’Hara & Co., JapanSGA-2040De shockgenerator kan worden bediend door het ImageFZ-programma.
Shockrastertester (ampèremeter)O’Hara & Co., JapanSG-T
USB-video-opnameapparaatXLR8USB2IVOSX
Quad-beeldsplitserWireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan400AS
Geluiddichte kamerO’Hara & Co., JapanCL-4210
Freeze MonitorSan Diego Instruments, Inc., CA, USA16 x 16 fotostraalarm ( 2,5 cm afstand)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crawley, J. N. What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , John Wiley & Sons. New York. (2007).
  2. Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
  3. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  4. Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
  5. Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
  6. Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
  7. Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
  8. Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
  9. Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
  10. Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
  12. Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
  13. Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
  14. Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
  15. Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
  16. Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
  17. Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
  18. Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
  19. Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
  20. Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
  21. Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
  22. Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
  23. Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
  24. Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
  25. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
  26. Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
  27. Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
  28. Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
  29. Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
  30. Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
  31. Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
  32. Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
  33. Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
  34. Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
  35. Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
  36. Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
  37. Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
  38. Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
  39. Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
  40. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
  41. Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
  42. Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Contextual Fear ConditioningCued Fear ConditioningFreezing Behavior AnalysisVideo Analyzing SystemImageFZ SoftwareAuditory Cue PresentationElectric FootshockMouse Behavioral TestAutomated Behavior AnalysisThreshold Settings

Related Articles