Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in

16.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50879

⸱

29 november 2013

 ,  , 
1School of Molecular Biosciences, Washington State University, 2Center for Reproductive Biology, Washington State University

In dit artikel

Samenvatting

Caenorhabditis elegan is een bruikbaar model om de functies van meervoudig onverzadigde vetzuren verkennen in ontwikkeling en fysiologie. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode van aanvulling van het C. elegans dieet van meervoudig onverzadigde vetzuren.

Samenvatting

Vetzuren zijn essentieel in vele celfuncties. Ze dienen als energieopslagtechnologieën moleculen vormen de hydrofobe kern van membranen, en deelnemen aan verschillende signaalwegen. Caenorhabditis elegans synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren te produceren. In combinatie met de eenvoudige anatomie en het bereik van beschikbare genetische hulpmiddelen, het een aantrekkelijk model vetzuur functie te bestuderen. Om de genetische wegen die de fysiologische effecten van dieet vetzuren mediëren onderzoeken, hebben wij een methode om de C. aanvulling ontwikkelde elegans dieet met onverzadigde vetzuren. Suppletie is een effectief middel om de vetzuursamenstelling van wormen veranderen en kan ook worden gebruikt om defecten in vetzuur-deficiënte mutanten redden. Onze methode maakt gebruik van nematoden groeimedium agar (NGM), aangevuld met vette acidsodium zouten. De vetzuren in de aangevulde platen worden incorporated in de membranen van de bacteriële voedselbron, dat vervolgens wordt opgenomen door de C. elegans die zich voeden met het aangevulde bacteriën. We gaschromatografie protocol beschrijft ook de veranderingen in vetzuursamenstelling die liggen in aangevuld wormen volgen. Dit is een efficiënte manier om de voeding van zowel grote als kleine populaties C. vullen elegans, waardoor voor een aantal toepassingen voor deze methode.

Inleiding

Vetzuren essentiële structurele componenten van membranen en energieopslagtechnologieën moleculen. Daarnaast kunnen vetzuren worden afgesplitst van cellulaire membranen door lipasen en enzymatisch gewijzigd om signalering effectoren 1 produceren. Natuurlijk voorkomende meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA's) bevatten twee of meer cis dubbele bindingen. De omega-3-vetzuren en omega-6-vetzuren zijn van elkaar onderscheiden op basis van de posities van dubbele bindingen ten opzichte van het methyl einde van het vetzuur. Gezonde voeding vereisen zowel omega-6 en omega-3 vetzuren. Echter, Westerse diëten zijn bijzonder rijk aan omega-6 vetzuren en arm aan omega-3 vetzuren. Een hoog omega-6 tot omega-3-vetzuren is geassocieerd met een verhoogd risico van cardiovasculaire en ontstekingsziekten zijn echter de precieze gunstige en ongunstige functies van specifieke vetzuren niet goed begrepen 2. De rondworm Caenorhabditis elegans is nuttig bij het ​​bestuderen van vetzuren functie omdat synthetiseert alle enzymen die nodig zijn om een reeks van omega-6 en omega-3 vetzuren, waaronder een omega-3 desaturase, een activiteit die afwezig is in de meeste dieren 3,4 produceren. Mutanten die vetzuurdesaturase-enzymen niet specifieke PUFA's te produceren, wat leidt tot verschillende ontwikkelings-en neurologische gebreken 4-6.

De fysiologische effecten van dieet vetzuren bestuderen, hebben we een biochemische assay geschikt genetische analyse ontwikkeld met zowel mutant en RNAi knock-down technieken C. elegans. Suppletie met specifieke PUFA wordt bereikt door een vetzuur natriumzout oplossing van het agarmedium voegen voor het gieten. Hierdoor PUFA opname door de E. coli voedselbron, waar het zich ophoopt in de bacteriële membranen. C. elegans innemen de PUFA-bevattende bacteriën en dit dieetaanvulling voldoende is om de defecte reddents van PUFA-deficiënte mutanten. Suppletie meeste vetzuren geen nadelige effecten op wildtype dieren echter specifiek omega-6-vetzuren, met name dihomo-gammalinoleenzuur (DGLA, 20:03 n-6) veroorzaken een permanente vernietiging van C. elegans kiemcellen 7,8.

Gaschromatografie wordt gebruikt om de introductie van de aangevulde vetzuur in de bacteriële voedselbron (hetzij OP50 of HT115) en in de nematoden controleren. De toevoeging van het detergens Tergitol (NP-40) in het medium zorgt voor een gelijkmatige verdeling van vetzuren door de gehele plaat en efficiëntere opname van vetzuren door de E. coli en nematoden. We hebben gevonden dat onverzadigde vetzuren gemakkelijk ingang vinden door bacteriën en C. elegans, maar de opname van verzadigde vetzuren is veel minder efficiënt. Dit artikel beschrijft stap voor stap hoe u de agar media vullen met vetzuren, evenals hoe om vetzuur opname in th controlerene nematode met behulp van gaschromatografie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Meervoudig onverzadigde vetzuren zijn gevoelig voor warmte, licht en zuurstof. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het opstellen van vetzuursuppletie platen zodanig dat vetzuren niet worden blootgesteld aan overmatige warmte en licht. NGM medium dat 0,1% Tergitol (NP-40) wordt geautoclaveerd en gedeeltelijk afgekoeld, waarna vetzuren natriumzouten worden toegevoegd onder constant roeren. De platen mogen drogen in het donker. Opname van vetzuren met C. elegans gekweekt op deze platen kunnen vervolgens worden gevolgd met gaschromatografie.

1. Bereiding van vetzuur gesupplementeerd Media

  1. Meet media componenten in een juiste maat kolf. Per 1 L, voeg 17 g Bacto-agar, 2,5 g trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml cholesterol opgelost in ethanol en 10 ml 10% Tergitol opgelost in water.
  2. Voeg 80% van de uiteindelijke gewenste volume van Millipore water en autoclaaf de media samen met lege glazen flessen (gelijk aan het aantal verschillendevetzurenconcentraties te testen), en passende maatcilinders.
  3. Cool media in een waterbad tot 55 ° C. Terwijl de media afkoelt bereiden werkvoorraadoplossing van het vetzuur natriumzout door het breken van de glazen flacon met veiligheidsmaatregelen en waarborgen glasdeeltjes niet mengen met de vetzuren. Weeg genoeg vetzuur om een ​​100 mM werkvoorraad maken.
  4. Breng het vetzuur oplossing tot een eindconcentratie van 100 mM met gezuiverd water. Volledig oplossen van het vetzuur natriumzout meestal duurt ongeveer 20-30 minuten. Spoel de werkvoorraad vetzuur met argon of stikstof, omdat contact met een inert gas voorkomt oxidatie. Cap het flesje en bewaar de werkvoorraad in het donker totdat media is afgekoeld.
  5. (Optioneel) Als RNAi media gewenst, meet ampicilline en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) oplossingen hier.
  6. Wanneer de agar is afgekoeld tot 55 ° C voeg per 1 L: 1ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2 en 25 ml fosfaatbuffer (108,3 g KH 2 PO 4 en 35,6 g K 2 HPO 4 per 1 L geautoclaveerd). Voeg de filter gesteriliseerd ampicilline en IPTG oplossingen als het maken van RNAi platen. Voor alle soorten borden, voeg steriel water om de laatste media-volume op 1 L. brengen
  7. In de buurt van een vlam, transfer media om een ​​autoclaaf en de juiste maat maatcilinder en voeg vervolgens warm steriel water om het gewenste volume. Transfer media terug naar de eerste kolf en meng door roeren.
  8. Vlakbij een vlam, overbrengen medium in een aantal flessen gelijk aan het aantal concentraties worden getest door meting met een autoclaaf en geschikte afmetingen maatcilinder. Handhaving van de hoeveelheden verdeeld media als vloeistof met behulp van een waterbad tot het vetzuur werkvoorraad volledig is opgelost.
  9. Plaats een fles op een roer plaat en roer totdat de media is warm aan, maar niet heet. Zorg ervoor dat je jezelf genoeg te verlatentijd te roeren in het vetzuur voorraad oplossing en giet platen voor de media begint te stollen. Als roerplaat heeft temperatuurregeling, stel deze in op 55 ° C.
  10. Verdun de 100 mM vetzuur werkvoorraad in de media voor de uiteindelijke concentratie gewenst. Roer media totdat de witte neerslag in oplossing (ongeveer 1 minuut). Media kan nog licht bewolkt en wordt het daarna.
  11. (Optioneel) Als RNAi media gewenst add ampicilline tot 0,1 mg / ml IPTG en 2 mM eindconcentratie.
  12. Giet media met behulp van een automatische pipet hulp en een steriele 25 ml pipet, het toevoegen van 8 ml van de media per plaat van 60 mm of 25 ml van de media per 100 mm plaat. Herhaal vetzuren toevoeging en plaat gieten stappen voor de overige flessen.
  13. Nadat de agar gestold is, bedek de vetzuren aangevuld platen met een doos of op te slaan op kamertemperatuur in een goed geventileerde lade te beschermen tegen licht oxidatie.
  14. Seed E. coli OP50 op platen twee dagen na de platen gedroogd.Voor 60 mm platen, pipet 300 ul van een nacht OP50 kweek (gekweekt bij 37 ° C). Als RNAi platen werden gegoten, zaad met 300 ul van RNAi bacteriën nadat de platen zijn gedroogd gedurende vier dagen. Plaat droogtijd moet worden aangepast door verschillen in vochtigheid in diverse laboratorium omgevingen.
  15. Incubeer de platen in een donkere plaats bij kamertemperatuur terwijl het bacteriedek droogt.

2. Inducerende Germ Cell Vernietiging door Suppletie van DGLA

  1. C. elegans gegroeid op platen die 0,3 mM DGLA (20:03 n-6) steriel worden door het vernietigen van kiemcellen in zowel larve en volwassen nematoden.
    1. Bereid een gesynchroniseerde bevolking van L1 larven door het behandelen van zwangere hermafrodieten met alkalische hypochloriet oplossing (voor een 10 ml oplossing: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml bleekwater en 7 ml H 2 O). Schud de zwangere hermafrodieten in deze oplossing, totdat de volwassen worms te ontbinden. Eieren zullen worden bewaard, en kunnen worden afgedraaid door lage snelheid centrifugeren.
    2. Was eipreparaat 3 keer in M9-buffer (3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O tot 1 L. toevoegen MgSO4 na het autoclaveren). Om voldoende zuurstof te voorzien, resuspendeer de eieren in een 15 ml plastic buis tot een eindvolume van 5 ml M9 buffer en rock op een shaker 's nachts.
    3. L1 larven dienen aan de aangevulde platen toegevoegd twee dagen na zaaien met OP50, of een dag na het uitplaten van de RNAi bacteriën. Incubeer wormen bij 20 ° C gedurende drie dagen of totdat ze het volwassen stadium.
  2. Volwassen wormen kunnen worden gescoord voor steriliteit met behulp van een dissectie microscoop met hoog genoeg vergroting om embryo's te ontwikkelen in de baarmoeder te visualiseren. Succesvolle kiemcel verlies zal er als een heldere baarmoeder leegte van eieren.
  3. Wormen kunnen ook worden gescoord door de vaststelling en kleuring met het nucleïnezuur eencid diamindinophenylindole kleurstof (DAPI), waarbij de visualisatie van kernen in kiemcellen en ontwikkelende embryo vergemakkelijkt. Een snelle DAPI kleuring wordt bereikt door het uitkiezen wormen in een druppel M9 buffer op een horlogeglas 9.
    1. Flood horloge-glas met 1 ml van een 0,2 ng / m. DAPI in 95% ethanol-oplossing, laat zitten voor ongeveer 5 minuten.
    2. Kies wormen in een druppel Vectashield op een dia, en dek af met een dekglaasje.
    3. Verbinding dekglaasje en bewaar bij 4 ° C in het donker overnacht voor optimale kleuring echter slides ook onmiddellijk bekeken. Score aanwezigheid of afwezigheid van kiemcellen kernen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een UV lamp en filter.

3. Fatty Acid opname bevestigt met gaschromatografie

Algemeen vetzuursamenstelling van C. elegans kan worden bepaald door het produceren van vetzuurmethylesters (Fames) die vervolgens worden gescheiden en gekwantificeerd met gas chromatography 4.

  1. Verzamel 500-1.000 volwassen wormen door het wassen ze af van de platen met water en het overbrengen naar een gesilaniseerd 13 mm x 100 mm glazen schroef bovenbuis.
  2. Laat wormen af ​​te wikkelen door de zwaartekracht, en verwijder zoveel mogelijk water met een glas Pasteur pipet.
  3. Was wormen eenmaal met water, en dan weer verwijder zoveel mogelijk water.
  4. Bekendheid worden gevormd door toevoeging van 1 ml 2,5% H 2 SO 4 in methanol, en vervolgens verwarmen bij 70 ° C gedurende 1 uur in een waterbad.
  5. Haal de buizen uit het waterbad en afkoelen gedurende 1 minuut.
  6. Extract Bekendheid door toevoeging van 1,5 ml water en 0,25 ml hexaan.
  7. Recap buizen en schud krachtig.
  8. Centrifugebuizen in een tafelblad klinische centrifuge gedurende 1 minuut bij maximale snelheid tot hexaan scheiden van waterig oplosmiddel.
  9. Transfer hexaan (toplaag) om een ​​GC flacon insert binnen een GC flesje, dat evenwel niet tot een van de waterfase overdragen. Voor GC eennalyse, 1-2 pi Fames in hexaan wordt geïnjecteerd op een polair capillaire gaschromatografiekolom geschikt voor Fames analyse. De Agilent 7890 GC injector bij 250 ° C met een stroomsnelheid van 1,4 ml / min en de GC oven is geprogrammeerd voor een begintemperatuur van 130 ° C, dat wordt gehouden gedurende 1 minuut. Vervolgens wordt de temperatuur opgevoerd 10 ° C / min tot 190 ° C, en men daarna stijgen opnieuw bij 5 ° C / min tot 210 ° C en gedurende nog eens 1 minuut.
  10. Om opname van DGLA opgetreden Bekendheid analyseren vlamionisatiedetectie (FID) of massaspectrometrie (MS) detectie, met authentieke standaarden voor de identificatie van C. elegans vetzuren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Suppletie van de C. elegans dieet beperkt door het vermogen van de bacteriële voedselbron voor opname en nemen vetzuur in het bacteriële membraan. Om het vermogen van E. bepalen coli OP50 verschillende vetzuren assimileren in de membranen, OP50 werd uitgeplaat op medium zonder supplement, 0,1 mM en 0,3 mM concentraties stearinezuur (18:00), natriumoleaat (18:01 n-9) en natrium DGLA (20 : 3n-6). Platen werden gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen in het donker, en geïncubeerd bij 20 °...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een werkwijze voor aanvulling van C. elegans voedingsvezels onverzadigde vetzuren. Zoals hierboven vermeld, moet erop worden gelet bij de bereiding van PUFA aangevuld platen omdat de reactieve aard van de dubbele bindingen in PUFA oorzaak van deze vetzuren gevoelig voor oxidatie door warmte en licht 11. Om oxidatie te voorkomen, is het belangrijk om de PUFA het vloeibaar agarmedium toevoegen nadat het materiaal is afgekoeld tot 55 ° C en slaat platen in een donkere omgeving.

<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken Chris Webster voor het uitvoeren van de voorlopige experimenten weergegeven in figuur 3 van de representatieve resultaten en Jason Watt en Chris Webster voor nuttige commentaar op het manuscript. Financiering voor deze studie werd verstrekt door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) naar JLW. Sommige nematode stammen die in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacto-AgarDifco214010
TryptoneDifco211705
NaClJ.T. Baker3624-05
TergitolSigmaNP40S-500mL
CholesterolSigmaC8667-25G(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4J.T. Baker2504-01
CaCl2J.T. Baker1311-01
K2HPO4J.T. Baker3254-05
KH2PO4J.T. Baker3246-05
Sodium dihomogamma linolenateNuCHEKS-1143
Warm steriel Millipore water
Sterile water voor het verzamelen van wormen
Nuclease-vrij water voor DGLA voorraadoplossingAmbionAM9932
AmpicillineFisher ScientificBP1760-25100 mg/ml in water (voor RNAi platen)
Isopropyl-bèta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Gold Biotechnology12481C1001 M in water (voor RNAi platen)
HSO4J.T. Baker9681-03
MethanolFisher ScientificA452-4
HexaanFisher ScientificH302-4
diamindinofenylindole (DAPI)SigmaD9542
VectaShieldVector LaboratoriesH-1000
GlaskolfCorning4980-2L
Autoclaveerbare glazen flessen met roerstaafjesFisherbrandFB-800
Autoclaveerbare glazen scheikundige cilinderFisherbrand08-557
RoerplaatVWR97042-642
Waterbad op 55+ °CPrecision Scientific Inc.66551
Schroefdop bruine glazen flaconSun SRI200 494
Argon gastank
Geautomatiseerde pipettenhulpPipette-AidP-90297
Steriele serologische pipetten (25 ml)Corning4489
BunsenbranderVWR89038-534
DissectiemicroscoopLeicaTLB3000
Gesilaniseerde glazen buisThermo ScientificSTT-13100-Svoor FAMEs derivatisatie
PTFE schroefdoppenKimble-Chase1493015D
Klinische tafelcentrifugeIEC
GC Crimp-vialSUN SRi200 000
GC-vial insertSUN SRi200 232
GC-vial dopSUN SRi200 100
GaschromatograafAgilent7890A
Massaspectrometrie detectorAgilent5975C
Kolom voor gaschromatografieSuppelcoSP 238030 m x 0.25 mm fused silica capillaire kolom

Referenties

  1. Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
  2. de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50(2012).
  3. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
  4. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  5. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
  6. Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
  7. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108(2006).
  8. Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
  9. Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
  10. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
  11. Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
  12. Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
  13. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
  14. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
  15. Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
  16. Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
  17. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
  18. Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599(2011).
  19. Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

C elegansvetzuursuppletiegaschromatografienematodegroeimediumsteriliteitsscorenvetzuursamenstellingDGLA suppletiebacteri le voedingsbronvetzuurmethylestersgenetische mutanten
Aanvulling van de voeding van meervoudig onverzadigde vetzuren in
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.