Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio's van de Adult knaagdierhersenen

Samenvatting

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Samenvatting

Recent onderzoek toont aan dat het centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en het ontstaan ​​van tumoren gaat populaties van stamcellen (SC) ingezetene in de volwassen hersenen. Echter, de mechanismen die normaal rustende cellen gebruiken om de goede werking van neurale netwerken, alsook hun rol in het herstel van de schade en de beperking van neurodegeneratieve processen te waarborgen zijn weinig begrepen. Deze cellen verblijven aangeduid als "niches" dat een onderhoudende milieu door modulerende signalen van zowel de vasculaire en immuun systemen regio. De isolatie, onderhoud, en differentiatie van CNS SCs onder gedefinieerde kweekomstandigheden die onbekende factoren uit te sluiten, maakt ze toegankelijk zijn voor behandeling met farmacologische of genetische middelen, en geven zicht op hun in vivo gedrag. Hier bieden we gedetailleerde informatie over de methoden voor het genereren van culturen van CNS SC's uit verschillende regio's van de volwassen hersenen en benaderingen om hun d beoordelenifferentiation potentieel tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in vitro. Deze techniek levert een homogene celpopulatie een monolaag cultuur die kunnen worden gevisualiseerd individuele SC en hun nageslacht bestuderen. Bovendien kan het worden toegepast in verschillende diermodellen en klinische monsters, die eerder werden gebruikt voor regeneratieve reacties in de beschadigde volwassen zenuwstelsel voorspellen.

Inleiding

Het centrale dogma van neurobiologie, door de fundamentele opmerkingen van de hersenen cytoarchitecture gemaakt door Ramón Y. Cajal meer dan een eeuw geleden gelegd, geoordeeld dat neurogenese onwaarschijnlijk was na de adolescentie gezien de complexiteit van de neurale netwerken in het CZS ^1. Hoewel de werkzaamheden van Altman in de jaren 1960 en later Kaplan, waaruit blijkt dat ^3H-thymidine kunnen worden gevonden in volwassen neuronen aangeeft dat daadwerkelijk neuronen werden geproduceerd in verschillende gebieden van de volwassen hersenen, het dogma bleef houden ^{2, 3.} Bewijs bleef te monteren met Nottebohm onderzoek beschrijft de ....

Protocol

Het werk houdt zich aan de Verklaring van Helsinski en de ARVO Animal Statement. De dieren werden gebruikt voor weefselverzameltoestel en alle relevante werkwijzen werden gevolgd volgens de instructies van de dierfaciliteit bij de Universiteit van Dresden. De dieren werden behandeld en gehuisvest in overeenstemming met de Duitse richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van proefdieren, en de studie werd goedgekeurd door de Landesdirektion Dresden. Neem contact op met het veterinaire beleid van uw instelling (IACUC of ander board) met betrekking tot geschikte euthanasie methodologie.

Specifieke voorraad en concentraties van de reagent....

Resultaten

Het identificeren van de regio van belang om uit te neurale stamcellen te oogsten is de belangrijke eerste stap en zal de hoeveelheid tijd die het duurt om een ​​samenvloeiing plaat van cellen krijgen definiëren. Bijvoorbeeld, de SVZ is een klassiek neurogene stippellijn daarom een ​​hogere relatieve verhouding van neurale stamcellen. Echter, de hier gepresenteerde techniek worden gebruikt met andere regio's vaak niet erkend als robuust neurogene mogelijk tijdens de volwassenheid. Voor de toepassing van dit protocol.......

Discussie

Veel van de kritische stappen succesvolle isolatie, expansie en differentiatie van neurale stamcellen uit volwassen hersenen worden gedeeld gemeen met standaard weefselkweektechnieken. De doelstelling om in gedachten te houden is dat NSCs geïsoleerd van de volwassen hersenen als veel van hun in vivo eigenschappen mogelijk (Figuur 2J) moet blijven. Vaak een evenwicht tussen noodzakelijke voorzichtigheid en gepaste snelheid moet worden gevonden. Zorg met de isolatie van de hersenen uit de schedel.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stockoplossing bereid in tweemaal gedestilleerd water (stabiel gedurende meerdere maanden bij -20 °C). Werkconcentratie 0,5 mg/ml in water (stabiel gedurende 1 maand bij 4 °C).
Fibronectine	R&D Systems	1030-Fn	Stockoplossing niet schudden
Filtratieapparaat	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	Zie opmerking hieronder voor volledige N2-mediavoorbereiding
Apo-transferrine	Sigma-Aldrich	T-2036
Insuline	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stockoplossing in ddH2O (stabiel bij 20 °C gedurende 6 maanden)
Natriumseleniet	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stockoplossing in ddH2O (stabiel bij -20 °C gedurende 6 maanden)
Progesteron	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stockoplossing in ethanol (stabiel bij -20°C gedurende 6 maanden)
Penicilline/Streptomycine	Invitrogen	15140-122
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Werkconcentratie 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Werkconcentratie  500 ng/ml
Angiopoetine 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Werkconcentratie  500 ng/ml
JAK-remmer	Calbiochem	420099	Werkconcentratie 200 nM
Rundserumalbumine	Sigma-Aldrich	A-2058
15- en 50-ml Conische buizen	Corning Life Sciences	430053, 430829
Andere benodigde items omvatten: Algemene dissectie-instrumenten, inclusief scheermes en pincet, Volwassen rat (3-6 maanden oud; Sprague-Dawley of Long Evans), CO2 vergiftigingskamer, Laminaire stroomkap voor celkweek en incubator Incubator (bevochtigd, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Opmerking: Voor volledige N2-mediavoorbereiding, voeg aan een fles DMEM/F-12 (500 ml) 0,05 g apotransferine toe, 0,0125 g insuline (vers opgelost in 1 ml van 10 mM NaOH), 50 μl putrescine, 30 μl natriumseleniet, 100 μl progesteron-stocks en 5 ml penicilline/streptomycine-oplossing.  Pas pH aan op 7,2, indien nodig. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken en bescherm tegen licht.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stockoplossing in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Verdunningsfactor: 1:400 Soort: Muis IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Verdunningsfactor: 1:100 Soort: Konijn IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Verdunningsfactor: 1:100 Soort: Muis IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Muis IgG1
β-tubuline III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Verdunningsfactor: 1:500 Soort: Muis IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Verdunningsfactor 1:500 Soort: Konijn
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Geit anti Muis IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Geit anti Muis IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Verdunningsfactor: 1:200 Soort: Geit anti Konijn