In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Martina Sonego; Ya Zhou; Madeleine Julie Oudin; Patrick Doherty; Giovanna Lalli

doi:10.3791/50905

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

13.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50905

⸱

25 november 2013

Martina Sonego^*¹ , Ya Zhou^*¹ , Madeleine Julie Oudin² , Patrick Doherty¹ , Giovanna Lalli¹

¹Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, ²David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

Samenvatting

Subventriculaire zone (SVZ) is een van de belangrijkste neurogene niches in de postnatale hersenen. Hier, neurale voorlopercellen vermenigvuldigen en aanleiding geven tot neuroblasts staat langs de rostrale migratie stroom (RMS) te verplaatsen naar de bulbus olfactorius (OB). Deze lange-afstand migratie vereist voor de daaropvolgende rijping van pasgeboren neuronen in de OB, maar de moleculaire mechanismen reguleren deze taak zijn nog onduidelijk. Het onderzoeken van de signaalwegen leidend neuroblast beweeglijkheid kan niet alleen helpen begrijpen een fundamentele stap in neurogenese, maar ook therapeutisch regeneratief potentieel, gezien het vermogen van deze neuroblasts hersenen plaatsen aangetast door verwonding, beroerte, of degeneratie richten.

In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende time-lapse imaging van neuroblast migratie in de muis RMS. Postnatale elektroporatie kan efficiënt transfecteren SVZ voorlopercellencellen, die op hun beurt neuroblasts migreren langs de RMS. Met behulp van confocale draaiende schijf time-lapse microscopie op acute hersenen slice culturen, kan neuroblast migratie worden bewaakt in een omgeving die gelijkenis vertonen met de in vivo toestand. Bovendien kan neuroblast beweeglijkheid worden gevolgd en kwantitatief geanalyseerd. Als voorbeeld beschrijven we hoe in vivo postnatale elektroporatie van een GFP-expressie plasmide gebruiken labelen en visualiseren neuroblasts migreren langs de RMS. Elektroporatie van shRNA of CRE-recombinase tot expressie plasmiden conditionele knockout muizen onder toepassing van de LoxP systeem kan ook worden gebruikt om genen van belang richten. Farmacologische manipulatie van acute hersenen slice culturen kunnen worden uitgevoerd om de rol van verschillende signaalmoleculen in neuroblast migratie te onderzoeken. Door de koppeling van in vivo elektroporatie met time-lapse imaging, hopen we de moleculaire mechanismen die neuroblast beweeglijkheid te begrijpen en bij te dragen tot de ontwikkeling vanling van nieuwe benaderingen herstelmechanismen in de hersenen te bevorderen.

Inleiding

In de hersenen van zoogdieren, de generatie van nieuwe neuronen (neurogenese) plaatsvindt na de geboorte voornamelijk in twee gebieden, de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone in de dentate gyrus van de hippocampus ^1. Verzameld in de afgelopen jaren aanzienlijk bewijs ondersteunt een cruciale rol voor postnatale neurogenese in de hippocampus en het reukorgaan geheugenfuncties ^1-3. Belangrijk postnatale neurogenese heeft ook therapeutisch potentieel vanwege de relatie met degeneratieve neurologische aandoeningen, en het vermogen van neuroblasts te migreren naar gewonde gebieden in de hersenen ^4-6.