Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine

Summary

De lichte keten van het botulinum-neurotoxine type A (BoNT/A LC) is een metalloprotease die motorneuronen binnendringt, zijn substraat SNAP-25 splitst en de neurotransmissie verstoort, wat resulteert in slappe verlamming. Met behulp van een op hoog-doorvoer geschikte FRET-gebaseerde test, kunnen grote bibliotheken van kleine moleculen worden getest op hun impact op de enzymatische activiteit van BoNT/A LC.

Abstract

Botulinum neurotoxin (BoNT) is een krachtig en mogelijk dodelijk bacterieel toxine dat zich bindt aan motorische neuronen van de gastheer, wordt geïnternaliseerd in de cel en intracellulaire eiwitten afbreekt die essentieel zijn voor de afgifte van neurotransmitters. BoNT bestaat uit een zware keten (HC), die de binding en internalisatie van gastheercellen mediëren, en een lichte keten (LC), die intracellulaire gastheereiwitten afbreekt die essentieel zijn voor de afgifte van acetylcholine. Terwijl therapieën die toxinebinding/internalisatie remmen een kleine tijdsvenster voor toediening hebben, hebben verbindingen die zich richten op de intracellulaire LC-activiteit een veel groter tijdsvenster voor toediening, wat bijzonder relevant is gezien de extreem lange halfwaardetijd van het toxine. In de afgelopen jaren zijn kleine moleculen zwaar geanalyseerd als mogelijke LC-remmers op basis van hun verhoogde cellulaire permeabiliteit in vergelijking met grotere therapeutischa (peptiden, aptamers, etc.). De identificatie van kandidaten omvat vaak high-throughput screening (HTS), waarbij grote bibliotheken van kleine moleculen worden gescreend op basis van hun vermogen om de functie van het therapeutische doelwit te moduleren. Hier beschrijven we een FRET-gebaseerde assay met een commercieel BoNT/A LC-substraat en recombinant LC die kan worden geautomatiseerd voor HTS van potentiële BoNT-remmers. Bovendien beschrijven we een handmatige techniek die kan worden gebruikt voor secundair follow-upscreening, of voor het vergelijken van de potentie van verschillende kandidaatverbindingen.

Introduction

Botulinum neurotoxin A (BoNT/A), de krachtigste bekende toxine op dit moment (LD₅₀ ~1 ng/kg)¹, is een krachtige neurotoxine die wordt geproduceerd door de bacterie Clostridium botulinum. Binnen een getroffen gastheer, verstoort BoNT/A de neurotransmissie bij de neuromusculaire junctie door motorische neuronen te binden, in het cytosol te internaliseren en uiteindelijk neuronale eiwitten af te breken die essentieel zijn voor acetylcholine exocytose. Eenmaal in een neuron, kan BoNT/A tot wel enkele maanden aanhouden². Langetermijnremming van acetylcholine-afgifte belemmert normale spiercontractie en resulteert in slappe verlamming, die in ernstige gevallen kan leiden tot cardiale en/of respiratoire falen. Vanwege zijn extreme potentie, gemakkelijke productie en langetermijneffecten binnen de gastheer, heeft de CDC alle BoNT-serotypen gelabeld als hoog-risico bioterrorisme-agenten.

De werkingsmechanisme van de toxine omvat talrijke stappen, waaronder binding aan neuronale oppervlaktereceptoren, cellulaire opname via receptor-gemedieerde endocytose en translocatie naar het neuron cytosol. BoNT/A bestaat uit twee ketens, een zware en een lichte keten, en beide ketens zijn vereist voor toxiciteit. De zware keten (HC) bevat bindings- en translocatiedomeinen, terwijl de lichte keten (LC) een zink-afhankelijke metalloprotease is die van de endosome naar het cytoplasma transloceert. Eenmaal in het cytosol, lokaliseert de LC/A metalloprotease zich aan de binnenste cytoplasmatische membraan en kleurt het membraangebonden gastheereiwit SNAP-25. SNAP-25 is een lid van de SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor) eiwitfamilie, die een cruciale rol speelt bij acetylcholine exocytose (beoordeeld in referentie³). LC/A-afbraak van SNAP-25 belemmert de SNARE-complexfunctie, wat de neurotransmitterafgifte van acetycholine remt en spiercontractie belemmert.

Momenteel is de behandeling voor botulisme beperkt en omvat vaak toediening van een equus neutraliserend antilichaam⁴; echter, omdat de toxine snel wordt geïnternaliseerd in neuronen, heeft het antilichaam een beperkte tijdsperiode voor toediening. Daarom geloven veel onderzoekers dat de BoNT/A LC een beter therapeutisch doelwit kan zijn. Omdat de LC een zink-afhankelijke metalloprotease is, is een aanpak om de LC/A-activiteit te remmen, het ontwikkelen van verbindingen die het actieve-site zinkion cheleren. Bijvoorbeeld, hydroxamaatverbindingen cheleren het actieve-site zink en hebben uitstekende in vitro potentie (K_i van de beste BoNT/A LC kleine molecuulremmer tot nu toe is 77 nM)⁵. Echter, veel kleine moleculen falen om door verschillende problemen ex vivo of in vivo te vorderen, waaronder slechte wateroplosbaarheid, snelle metabolisme, en/of hoge cytotoxiciteit. Daarom zijn nieuwe verbindingen met verbeterde farmacologische en farmacokinetische eigenschappen nodig. Kleine molecuulverbindingsidentificatie omvat vaak high-throughput screening (HTS) om nieuwe scaffolds te identificeren. Aanvankelijke methoden voor BoNT/A LC-activiteitsscreening waren gebaseerd op HPLC-detectie van korte peptide substraatafbraak, wat tijdrovend is en niet geschikt is voor HTS-toepassingen^6-8. Vervolgens ontwikkelden Schmidt en collega's⁹ een high-throughput BoNT/A LC-activiteitsassay die een fluoresceïne-gelabelde peptide substraat gebruikt dat covalent aan een microtiterplaat is bevestigd. De BoNT/A LC kleurt het substraat en geeft fluoresceïne vrij, wat kan worden gekwantificeerd met een fluorometer. Het plaatformaat van deze assay maakt het mogelijk om talrijke verbindingen tegelijkertijd te screenen; echter, de assay vereist het labelen van synthetische peptiden met fluoresceïne en het coaten van de assayplaten met gederivatiseerde substraatmoleculen, wat bewerkelijk zijn. Een veel eenvoudiger methode voor het detecteren van BoNT/A LC-activiteit bij lage concentraties werd later beschreven door Schmidt et al., waarbij een reeks fluorogene substraten werd gebruikt om BoNT LC-activiteit in real time te monitoren¹⁰. Aanvullende technieken beschreven in de literatuur omvatten een depolarisatie na resonantie energieoverdracht-gebaseerde assay om BoNT-activiteit in ruwe extracten te detecteren en te kwantificeren; deze methode kan worden gebruikt voor high-throughput toepassingen^10,11, hoewel het geavanceerde apparatuur vereist om fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) en polarisatie signalen te meten. Ten slotte zijn er verschillende cel-gebaseerde modellen voor BoNT-intoxicatie gerapporteerd (beoordeeld in referentie¹¹) die onderzoekers in staat zullen stellen om de vaak beperkende eigenschappen van eerder genoemde verbindingen te bestuderen, inclusief cytotoxiciteit, celpermeabiliteit en stabiliteit. Echter, de meeste van de bestaande cel-gebaseerde assays zijn niet geschikt voor HTS, en zijn arbeids- en tijdintensief.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een HTS-methode die gebruikmaakt van de commercieel verkrijgbare FRET-gebaseerde BoNT/A LC substraat. Het substraat is gebaseerd op de SNAP-25-afbraaksequentie en is een synthetisch 13-mer peptide dat een terminaal fluorofoor en demper bevat. BoNT/A-afbraak scheidt de fluorofoor en demper, wat FRET afschaft en gemeten fluorescentie verhoogt, wat continu kan worden gemeten in een fluorometer plaatlezer. De assay wordt routinematig gebruikt in onze, evenals andere laboratoria, om nieuwe klassen van BoNT/A LC remmers te identificeren of om de relatieve potentie van eerder geïdentificeerde verbindingen te bepalen^5,12-15. Deze assay is geschikt voor HTS vanwege zijn eenvoud, automatiseringspotentieel, lage materiaalkosten en vermogen om talrijke verbindingen tegelijkertijd te screenen (zie referentie¹⁶; Caglıet al., ingediend; Bompianiet al., in voorbereiding). Naast HTS kan deze assay worden gebruikt om de relatieve potentie van verbindingen te vergelijken door de IC₅₀ waarde (concentratie vereist om 50

Protocol

Handmatige screening of IC₅₀ Bepaling

Dit protocol kan worden gebruikt om de relatieve potentie van een verbinding (IC₅₀ waarde) te bepalen door een verdunningsreeks van de verbinding voor te bereiden, of om handmatig te screenen op remmer van kleine moleculen bij een enkele concentratie.

1. Voorbereiding van buffers, reagentia en benodigde instrumentatie

1. Bereid 50 ml testbuffer (40 mM HEPES, pH 7,4 en 0,01% Tween-20) voor en steriliseer gefilterd. De buffer kan gedurende enkele maanden op kamertemperatuur (RT) worden bewaard.
2. Bereid een werkende verdunning van 70 nM recombinante botulinum neurotoxine/A lichtketting (LC/A (1-425))¹⁷ in testbuffer, voorzichtig vortex en bewaar op ijs. Het testen van elke verbinding vereist minimaal 120 µl van LC/A werkende verdunning.
3. Bereid een werkende verdunning van 7 µM FRET-gebaseerde BoNT/A LC substraat in testbuffer met 10% DMSO. Verdun aanvankelijk een 5 mM stockoplossing van het substraat in een geschikt volume van 100% DMSO en voeg vervolgens langzaam (druppelgewijs) de testbuffer toe terwijl u voorzichtig mixt. Wikkel in folie en bewaar op ijs. Het testen van elke verbinding vereist minimaal 130 µl van de werkende substraatverdunning.
4. Configureer een fluorescentie microtiterplaatlezer om de plaat 10 seconden op medium snelheid te schudden, en bewaak vervolgens de fluorescentie bij excitatie- en emissiegolflengten van 490 nm en 523 nm, respectievelijk, elke 5 min (kinetische modus) gedurende 90 min bij RT. Merk op dat de productvorming (dwz de toename in fluorescentie) gedurende deze periode lineair is (Figuur 1A).

2. Voorbereiding van verbindingsverdunningsreeks

1. Bepaal het concentratiebereik van de verbinding (dwz aantal verdunningen in de verdunningsreeks en verdunningsfactor); het concentratiebereik wordt gekozen op basis van de verwachte IC₅₀ waarde om een optimale curve-fit te garanderen. Voor verbindingen met een onbekende IC₅₀, gebruik onverdunde verbinding stock als de hoogste verbindingsconcentratie.
2. Label buisjes met de juiste verbindingsnaam en concentratie.
3. Pipetteer 100% DMSO in alle buisjes om ze voor te bereiden op seriële verdunning van de verbinding. Een minimum van 2 µl eindverdunningsvolume wordt aanbevolen, waarbij 1 µl van elke concentratie per putje in de testplaat wordt gebruikt. Bijvoorbeeld, een standaard 1:3 verdunningsreeks vereist het mengen van 2 µl verbinding met 4 µl DMSO per buisje.
4. Bereid seriële verdunningen van verbindingen en vortex of meng voorzichtig tussen elke verdunning; verander pipetpunten tussen elke verdunning. Voor de standaard 1:3 verdunningsreeks, voeg 2 µl van de onverdunde verbinding toe aan 4 µl DMSO in de eerste buis van de verdunningsreeks en meng goed. Met een nieuw pipetpunt, verwijder 2 µl van de eerste verdunning en voeg toe aan 4 µl DMSO in de tweede buis; meng goed. Herhaal voor de resterende verdunningen. Zorg ervoor dat de verbindingsverdunningen goed worden gemengd om ervoor te zorgen dat de verbindingsconcentraties nauwkeurig zijn.
5. Dek de verbindingsbuisjes af en laat ze bij kamertemperatuur rusten.

3. Plaatvoorbereiding en aanbrengen (Tabel 1)

1. Verkrijg een vlakbodem, ondoorzichtige, zwarte 96-wells plaat. Zie de aanbevolen plaatopstelling in Tabel 1, waarbij elke verbindingsverdunningsreeks is geformatteerd in rijen van een 96-wells plaat. Dispenseer handmatig 1 µl van de respectieve verbindingsverdunning direct naar de bodem van elke overeenkomstige put (putjes 1-9). Dispenseer 1 µl van de hoogste concentratie van de te testen verbinding in put 11 (intrinsiek fluorescentiecontrole van de verbinding).
2. Dispenseren handmatig 1 µl van een bekend krachtig remmer in put 12 (positieve controle), en 1 µl 100% DMSO in put 10 (negatieve controle).
3. Met een geautomatiseerde pipettor, dispenseren 79 µl testbuffer naar de zijkant van putjes 1-10 en 12 (verbindingsverdunningen en positieve controle), en 89 µl naar de zijkant van put 11 (intrinsiek fluorescentiecontrole van de verbinding). Zorg ervoor dat de punt niet naar de bodem van de put komt waar de verbinding aanwezig is, zodat u de putjes niet kruisbesmetten.
4. Vortex de LC/A werkende verdunning en gebruik een geautomatiseerde pipettor om 10 µl aan de zijkant van elke put toe te voegen, behalve put 11 (intrinsiek fluorescentiecontrole van de verbinding). Tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat alle toegevoegde enzym naar de bodem van de put gaat.
5. Meng voorzichtig, dek af, en incubeer de plaat gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Deze incubatie biedt een voorevenwichtsstap voor de verbindingen om zich te binden aan LC/A vóór substraattoevoeging.

4. Substraattoevoeging en fluorescentiemeting

1. Vortex voorzichtig het BoNT/A LC substraat, en voeg met een geautomatiseerde pipettor 10 µl substraat toe aan de andere kant van elke put. Zorg ervoor dat het substraat wordt toegevoegd aan de kant van de put tegenover waar het enzym eerder is toegevoegd.
2. Tik voorzichtig op de plaat om de reagentia te mengen, plaats onmiddellijk in de plate reader en begin met de fluorescentiemeting met de instellingen die eerder in stap 1.4 zijn gespecificeerd.
3. De enzymsnelheden worden berekend uit de helling van de lijn die wordt gegenereerd door het grafiek maken van de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) versus tijd tijdens de lineaire periode van de reactie.

<

Results

De FRET-gebaseerde BoNT/A LC-assay kan handmatig worden uitgevoerd op een lage doorvoer om bekende remmers te karakteriseren of kleine bibliotheken te screenen; als alternatief kan het protocol worden opgeschaald en geautomatiseerd voor high-throughput screening (HTS) met grote bibliotheken met als doel nieuwe BoNT/A LC-remmers te identificeren. Ongeacht de gekozen aanpak, moet een toename van fluorescentie worden waargenomen in de loop van de tijd wanneer BoNT/A LC wordt geïncubeerd met het substraat ( Figuur 1A...

Discussion

De FRET-gebaseerde BoNT/A LC-test die hier wordt beschreven, is een aantrekkelijke methode voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen die de BoNT/A LC-activiteit moduleren. De oplossingsgebaseerde aard van de test maakt dit protocol geschikt voor high-throughput screening zoals beschreven in de sectie Geautomatiseerde werking van de Protocoltekst. De Z-factor wordt vaak gebruikt om de geschiktheid van een test voor HTS-campagnes te bepalen¹⁸. Bepaald als Z = 1 – 3 (σ_p + σ_n

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Teknova	H1021
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Methanol (HPLC-kwaliteit)	Sigma-Aldrich	34860
Isopropanol (HPLC-kwaliteit)	Sigma-Aldrich	650447
96-well Black assay plaat	Costar	3915
384-well Lage volume zwarte assay plaat	Greiner	788076
SNAPtide FITC/Dabcyl substraat	List Biological Laboratories	521	FRET-gebaseerde BoNT/A LC substraat
Pin cleaning oplossing	V&P Scientific	VP 110
Lint-vrij blotting papier	V&P Scientific	VP 540DB
Biomek Seal en Sample Aluminiumfolie deksels	Beckman Coulter	538619