Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellen ingebed in collageen en fibrinegels hechten en oefenen tractiekrachten uit op de vezels van de gel. Deze krachten kunnen leiden tot lokale en wereldwijde reorganisatie en herschikking van de gelmicrostructuur. Dit proces verloopt op een complexe manier die deels afhankelijk is van het samenspel tussen de locatie van de cellen, de geometrie van de gel en de mechanische beperkingen op de gel. Om beter te begrijpen hoe deze variabelen globale vezeluitlijningspatronen produceren, gebruiken we time-lapse differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie in combinatie met een milieugestuurde bioreactor om het verdichtingsproces tussen geometrisch verdeelde explants (clusters van fibroblasten) te observeren. De afbeeldingen worden vervolgens geanalyseerd met een aangepast beeldverwerkingsalgoritme om kaarten van de stam te verkrijgen. De informatie verkregen uit deze techniek kan worden gebruikt om de mechanobiologie van verschillende celmatrixinteracties te onderzoeken, wat belangrijke implicaties heeft voor het begrijpen van processen in wondgenezing, ziekteontwikkeling en weefseltechnologietoepassingen.
Inleiding
Een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van cel-matrix interacties is de cel bevolkte collageen gel1,2. De gel biedt een 3D-omgeving die dichter bij het in vivo karakter van het weefsel ligt en beter geschikt is voor het begrijpen van celgedrag dan wordt aangeboden door traditionele 2D-culturen3. Vroege studies waarin fibroblasten homogeen werden verdeeld in een collageengel, ontdekten dat de cellen de collageenvezels snel consolideren en de gelverdichten 4,5. De contractiele fibroblasten in vrij zwevende gels gaan dan over in een rustgevende toestand kort nadat de gel volledig verdichting1,6,7heeft bereikt. De fibroblasten in gels die aan de grenzen zijn beperkt, blijven in een actieve, synthetische toestand8 en ze genereren vezeluitlijning op een manier die afhankelijk is van gelgeometrie en externe beperkingen5,9. Verschillen in celactiviteit lijken het gevolg te zijn van de interne spanning (of het ontbreken daarvan) die zich ontwikkelt naarmate de cellen tractiekrachten uitoefenen via integrinen op de collageenvezels in de gel.
Een variant van deze techniek omvat het plaatsen van fibroblast explants(d.w.z. klonten cellen) op een afstand van elkaar binnen een collageengel en het observeren van celmatrixinteracties en de geleidelijke ontwikkeling van vezeluitlijning tussen de explants (soms ligamentachtige banden genoemd)10-12. Het belangrijkste voordeel van het explantsysteem is dat het iemand in staat stelt om de cellen in eenvoudige geometrische patronen te rangschikken, waardoor het gemakkelijker wordt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan celgestuurde vezelherschikking te visualiseren en te onderzoeken. Deze uitlijningspatronen - die voornamelijk afhankelijk zijn van het samenspel tussen celtractiekrachten, cel ruimtelijke verdeling, gelgeometrie en de mechanische beperkingen op de gel - zijn belangrijk om te begrijpen omdat ze een centrale rol spelen in de wereldwijde weefselorganisatie, mechanische functie en lokale mechanische omgeving13.
Op het gebied van weefseltechniek omvat één strategie voor het produceren van mechanisch functionele, gemanipuleerde weefsels het controleren van het vezeluitlijningspatroon dat zich ontwikkelt uit celverdichting, zodat het gemanipuleerde weefsel vezeluitlijning bezit die die van het inheemse weefselnabootst 14,15. Een dergelijke uitlijning wordt verondersteld noodzakelijk voor gemanipuleerde weefsels om het complexe mechanische gedrag van inheemse weefsels te repliceren. Een wijziging van deze strategie is om de collageengel te vervangen door een fibrinegel16. De fibrinegel ontwikkelt een vergelijkbaar uitlijningspatroon als een collageengel tijdens verdichting. Na verloop van tijd wordt de fibrine afgebroken en vervangen door celgesynthetiseerde ECM die het initiële fibrinevezeluitlijningspatroon volgt. De resulterende ontworpen constructie heeft aanzienlijk verbeterde mechanische eigenschappen in vergelijking met collageengel afgeleide constructies17.
Het uitlijningsproces en de daaropvolgende renovatiegebeurtenissen in fibrinegels verlopen op een gecompliceerde en slecht begrepen manier. Om deze interacties en hun effect op celgedrag en ECM-remodellering beter te karakteriseren, hebben we een procedure ontwikkeld die is gebaseerd op de explantmethode. Bij deze methode worden fibroblast explants op een fibrinegel geplaatst in verschillende geometrische patronen. De gels worden onderhouden in een milieugecontroleerde, op een microscoop gemonteerde bioreactor18,en het proces van verdichting en vezelherschikking wordt bewaakt met time-lapse differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie. Verplaatsingsvelden worden gekwantificeerd met aangepaste algoritmen. De gegevens die uit deze experimenten worden verkregen, hebben uiteenlopende implicaties voor een aantal processen, waaronder het optimaliseren van weefselengineeringsstrategieën, het verbeteren van wondgenezing en het behandelen van pathologische weefselremodellering.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Stencil voorbereiding
Bereid een stencil op Parafilm voor om de locatie van elke explant in te delen, volgens de gewenste geometrie (figuren 1A en 1B). Ruimte elke explant ongeveer 1-2 mm uit elkaar. Deze afstand komt overeen met een ideale afstand voor het genereren van vezeluitlijning tussen explants. Bevestig het stencil onder het gebied van de afdekglas waar het monster met tape wordt bereid.
2. Sterilisatie
Reinig alle componenten van de bioreactor grondig met 70% ethanol en steriliseer gedurende 2-3 uur onder UV-licht voorafgaand aan het experimenteren. Als een alternatief vat wordt gebruikt in plaats van een bioreactor, moeten de juiste sterilisatietechnieken worden gebruikt. Zie stap 4.12 voor opmerkingen over het gebruik van een petrischaal met glazen bodem.
3. Fibrin Gel Voorbereiding
Nadat de componenten van de bioreactor zijn gesteriliseerd, giet u een dunne laag fibrinegel op het oppervlak van de afdekglas. Details voor het bereiden van fibrinogeen en trombine voorraadoplossingen voor het maken van 6,6 mg/ml fibrinegels worden beschreven in Sander et al. 13 Een soortgelijk protocol van Ye et al. 19 voor het maken van 3,3 mg/ml fibrinegels kan ook worden bekeken op de JoVE-website.
- Bereid een oplossing van fluorescerende microbeads in DMEM met een concentratie van 10 miljoen kralen/ml. De kralen worden gebruikt om gelverplaatsingen te volgen. Om deze concentratie te bereiken, combineert u 0,017 ml microbeadbouillonoplossing en 0,149 ml DMEM in een microcentrifugebuis.
- Soniceer deze suspensie gedurende 10 minuten om de kralen te verspreiden en de oplossing te homogeniseren.
- Fibrineoplossing — Meng in een c-tube van 15 ml 0,22 ml fibrinogeenbouillonoplossing met 0,44 ml HEPES-buffer van 20 mM. Voeg de 0,1667 ml DMEM toe met microbeads gemaakt in stap 3.1.
- Trombineoplossing — Meng in een afzonderlijke c-tube van 15 ml 0,0328 ml trombinebouillonoplossing, 0,131 ml 20 mM HEPES-buffer en 0,00246 ml 2 M CaCl2.
- Meng de trombineoplossing (stap 3.4) voorzichtig met de fibrinogeenoplossing (stap 3.3) door 5-10x op en neer te gaan totdat de oplossing gelijkmatig is verdeeld. Vermijd zoveel mogelijk bubbels te introduceren. Om de hoeveelheid geproduceerde bubbels te verminderen, moet u ervoor letten dat u de pipet niet volledig ontlaadt tijdens het mengen.
- De toevoeging van trombine zorgt ervoor dat de oplossing snel gel (~ 30 sec). Pipetteer de gemengde oplossing zo snel mogelijk op de afdekglas. Laat de gel polymeriseren bij RT.
- Sluit de bioreactor af, plaats de verwarmingsblokken en sluit de thermokoppels aan op de temperatuurregelaar. Incubeer de gel bij 37 °C gedurende 15-30 min.
4. Cel Explant Voorbereiding
- Verwijder het medium uit de T-75 kolf met de menselijke huidfibrosecellen.
- Spoel het oppervlak voorzichtig af met ongeveer 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om serumeiwitten te verwijderen. Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe en incubeer gedurende 3 minuten, of totdat de cellen zijn opgetild.
- Nadat de cellen zijn opgetild, draait u de suspensie gedurende 5 minuten in een centrifuge van 200 x g naar beneden. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in een volume DMEM dat een uiteindelijke concentratie van 20 miljoen cellen/ml mogelijk maakt.
- Terwijl de cellen in de centrifuge naar beneden draaien, koppelt u de bioreactor los van de verwarmingsblokken en de thermokoppels. Breng de bioreactor over in een bioveiligheidskast en verwijder het deksel voorzichtig volgens de asceptische technieken.
- Maak explants door 0,3 μl van de celsuspensie op de gepolymeriseerde fibrinegel te pipetten, volgens het patroon op het stencil. Elke explant moet ongeveer 6.000 cellen bevatten. Zorg ervoor dat micropipettips met een laag volume worden gebruikt (0,1-10 μl).
- Laat cellen bezinken en hechten aan de fibrinematrix gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Voeg met de bioreactor nog open ongeveer 5 ml DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 0,1% amfotericine B en 10 mg/ml aprotinine rechtstreeks in de bioreactorkamer toe. DMEM is bicarbonaat gebufferd en vereist 5% CO2 om een neutrale pH te behouden. Aangezien de bioreactor niet wordt geleverd met CO2,conditioneer het medium in een incubator met 5% CO2 gedurende 2-3 uur voor gebruik. Aprotinine is een serine proteaseremmer die veel wordt gebruikt om de snelheid van fibrinedegradatie te verminderen20.
- Reseal de bioreactor. Gebruik een spuit om nog eens 5 ml CO2 geconditioneerd medium af te leveren via de prikkeldraadfitting op de inlaatpoort. Doseer het medium langzaam en zorg ervoor dat het hele volume van de bioreactorkamer gevuld is. Verwijder voorzichtig bellen die zich in de bioreactor vormen.
- Lever gedurende het hele experiment vers, 5% CO2-geconditioneerd medium aan de bioreactor om de pH te behouden, voedingsstoffen te leveren en afvalproducten te verwijderen. Stel een spuitpomp in met een spuit van 10 ml of 30 ml gevuld met 5% CO 2-geconditioneerd medium. Sluit de spuit rechtstreeks aan op de inlaatpoort op het deksel van de bioreactor met steriele slang met Luer-lock. Verwijder de mannelijke fitting en bevestig de slang aan de prikkeldraadfitting op de bioreactor (zie figuur 1C).
- Stel de perfusiesnelheid in op 0,01 ml/min. Sluit aangepaste stukken slang aan op beide uitlaatpoorten en plaats de uiteinden in een bekerglas van 100 ml om afval op te halen.
- Gebruik een labaansluiting om de hoogten van de inlaat- en uitlaatvoedingen zo in te stellen dat er geen drukverschil ontstaat in de bioreactor (zie ter referentie figuur 1D).
- Als er geen bioreactor beschikbaar is, bereid dan monsters in petrischalen met glazen bodem van 35 mm. Gebruik er een met een coverslipgrootte die is geoptimaliseerd voor de specifieke set doelstellingen die moet worden gebruikt. Monsters die in petrischalen worden bereid , moeten in een incubator bij 37 °C en 5% CO2worden bewaard .
Opmerking: Polystyreen depolariseert licht en interfereert met DIC-beeldvorming, dus glazen bovenkanten moeten worden gebruikt als DIC-beeldvorming wordt uitgevoerd. Fasecontrast is een geschikte alternatieve beeldvormingsmodaliteit. Het overbrengen van gerechten tussen de incubator en de microscoop zal de registratie van afbeeldingen moeilijk maken. Als afbeeldingen niet correct zijn geregistreerd, is de stam berekend in sectie 6 niet nauwkeurig.
5. Time-lapse Beeldvorming
- Zodra het monster is voorbereid, moet u de bioreactor opnieuw insealeren, de verwarmingsblokken en de thermokoppels opnieuw aansluiten en de temperatuur van de bioreactor op 37 °C instellen.
- Plaats de bioreactor op het op de microscoop gemonteerde gemotoriseerde podium. Plaats de 20X DIC-doelstelling onder de weergavepoort. Een lagere vergrotingsdoelstelling is aanvaardbaar, vooral als er geen precisiemotorische fase beschikbaar is. Zorg ervoor dat de polarisator, analysator en prisma allemaal op hun plaats zitten. Als alternatief kunnen monsters ook worden afgebeeld met fasecontrast.
- Open de beeldvormingssoftware.
- Richt de doelstelling op het gebied tussen de drie explants.
- Sla de coördinaten (x, y en z) van deze locatie op in de imaging-software.
- Als u het hele gebied tussen en rond de explants wilt afbeelden, selecteert u de optie om een grote afbeelding te verkrijgen en de grootte van het gebied op te geven. Hierdoor kunnen meerdere afbeeldingen rond het opgegeven gebied worden veroverd en kan een betegelde afbeelding worden gemaakt die een groter gebied van het voor beeld vertegenwoordigt.
- Stel de belichtingstijd en lichtintensiteit in op de laagst mogelijke waarden om celdood veroorzaakt door fototoxiciteit te voorkomen, terwijl het nog steeds voldoende resolutie biedt om onderscheid te maken tussen cellen, microbeads en fibrinevezels.
6. Strain Volgen
Voor meer informatie en instructies over de gebruikte strain tracking software (Figuur 2) zie Raghupathy et al. 21 Het algoritme is een aangepaste MATLAB-code die kan worden gedownload van http://www.license.umn.edu/default.aspx. Merk op dat DIC-afbeeldingen vaak voldoende textuur hebben voor het volgen van de spanning. De microbeads zijn inbegrepen om te dienen als een controle op de berekende stamvelden. Als strain tracking wordt gedaan, is het van cruciaal belang dat de verkregen beelden op exact dezelfde locatie worden gemaakt, zodat de beelden worden geregistreerd. Niet-geregistreerde afbeeldingen produceren valse soorten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Weefselremodellering is een complex proces dat deels wordt aangedreven door wederzijdse fysieke interacties tussen cellen en de omringende matrix. De cellen reorganiseren de omringende vezels en genereren spanning in het glasvezelnetwerk. De uitlijning van vezels en mechanische omgeving op zijn beurt controleert celgedrag, zodat zowel cellen als matrix wereldwijd reorganiseren om geremodelleerd weefsel te produceren. In dit experiment begonnen de cellen van de explants, aanvankelijk rond in de morfologie, zich uit te bre...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is ontwikkeld met het oog op het observeren en kwantificeren van de mechanica die betrokken is bij celgemedieerde ECM-remodellering. Dergelijke processen liggen ten grondslag aan een aantal biologische verschijnselen en hebben belangrijke implicaties voor technische weefsels2,22, waardoor litteken1,23wordt verminderd , en inzicht in pathologische weefselremodellering12,24. Het gebruik van time-lapse DIC-microscopie stelt iemand in staat om de verplaatsing en uitlijning van fi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten aangegeven.
Dankbetuigingen
We danken George Giudice en Steven Eliason voor het doneren van menselijke huidfibroblasten en Ramesh Raghupathy voor hulp bij het algoritme voor het volgen van de stam. Ondersteuning voor dit werk werd verleend door een U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
Referenties
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
- Pedersen JA,, Swartz MA, Mechanobiology in the third dimension. Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
