Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.
Methodenartikel
Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.
Cellen ingebed in collageen en fibrinegels hechten en oefenen tractiekrachten uit op de vezels van de gel. Deze krachten kunnen leiden tot lokale en wereldwijde reorganisatie en herschikking van de gelmicrostructuur. Dit proces verloopt op een complexe manier die deels afhankelijk is van het samenspel tussen de locatie van de cellen, de geometrie van de gel en de mechanische beperkingen op de gel. Om beter te begrijpen hoe deze variabelen globale vezeluitlijningspatronen produceren, gebruiken we time-lapse differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie in combinatie met een milieugestuurde bioreactor om het verdichtingsproces tussen geometrisch verdeelde explants (clusters van fibroblasten) te observeren. De afbeeldingen worden vervolgens geanalyseerd met een aangepast beeldverwerkingsalgoritme om kaarten van de stam te verkrijgen. De informatie verkregen uit deze techniek kan worden gebruikt om de mechanobiologie van verschillende celmatrixinteracties te onderzoeken, wat belangrijke implicaties heeft voor het begrijpen van processen in wondgenezing, ziekteontwikkeling en weefseltechnologietoepassingen.
Een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van cel-matrix interacties is de cel bevolkte collageen gel1,2. De gel biedt een 3D-omgeving die dichter bij het in vivo karakter van het weefsel ligt en beter geschikt is voor het begrijpen van celgedrag dan wordt aangeboden door traditionele 2D-culturen3. Vroege studies waarin fibroblasten homogeen werden verdeeld in een collageengel, ontdekten dat de cellen de collageenvezels snel consolideren en de gelverdichten 4,5. De contractiele fibroblasten in vrij zwevende gels gaan dan over in een rustgevende toestand kort nadat de gel volledig verdichting1,6,7heeft bereikt. D....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
1. Stencil voorbereiding
Bereid een stencil op Parafilm voor om de locatie van elke explant in te delen, volgens de gewenste geometrie (figuren 1A en 1B). Ruimte elke explant ongeveer 1-2 mm uit elkaar. Deze afstand komt overeen met een ideale afstand voor het genereren van vezeluitlijning tussen explants. Bevestig het stencil onder het gebied van de afdekglas waar het monster met tape wordt bereid.
2. Sterilisatie
Reinig alle componenten van de bioreactor grondig met 70% ethanol en steriliseer gedurende 2-3 uur onder UV-licht voorafgaand ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Weefselremodellering is een complex proces dat deels wordt aangedreven door wederzijdse fysieke interacties tussen cellen en de omringende matrix. De cellen reorganiseren de omringende vezels en genereren spanning in het glasvezelnetwerk. De uitlijning van vezels en mechanische omgeving op zijn beurt controleert celgedrag, zodat zowel cellen als matrix wereldwijd reorganiseren om geremodelleerd weefsel te produceren. In dit experiment begonnen de cellen van de explants, aanvankelijk rond in de morfologie, zich uit te bre.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit protocol is ontwikkeld met het oog op het observeren en kwantificeren van de mechanica die betrokken is bij celgemedieerde ECM-remodellering. Dergelijke processen liggen ten grondslag aan een aantal biologische verschijnselen en hebben belangrijke implicaties voor technische weefsels2,22, waardoor litteken1,23wordt verminderd , en inzicht in pathologische weefselremodellering12,24. Het gebruik van time-lapse DIC-microscopie stelt iemand in staat om de verplaatsing en uitlijning van fi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Geen belangenconflicten aangegeven.
We danken George Giudice en Steven Eliason voor het doneren van menselijke huidfibroblasten en Ramesh Raghupathy voor hulp bij het algoritme voor het volgen van de stam. Ondersteuning voor dit werk werd verleend door een U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen