Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

Samenvatting

We ontwikkelden een in vitro model dat een belangrijke component van de acute ontstekingsreactie tijdens infectie van de blaas uropathogene Escherichia coli nabootst. De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt kwantitatieve beoordeling van menselijke neutrofiel migratie over blaas epitheel, gekweekt op permeabele dragers, in reactie op bacteriële infectie of chemoattractant stoffen.

Samenvatting

De rekrutering van immuuncellen van de periferie naar de plaats van ontsteking is een essentiële stap in de aangeboren immuunrespons op elk slijmvliesoppervlak. Tijdens infectie van de urineblaas, polymorfonucleaire leukocyten (PMN, neutrofielen) migreren van de bloedsomloop en beweeg de blaas epitheel. Het niet-infectie op te lossen in de afwezigheid van een neutrofiele respons toont het belang van PMN in blaas verdediging. Kolonisatie van de blaas epitheel, uropathogene Escherichia coli (UPEC) te vergemakkelijken, de verwekker van de meerderheid van urineweginfecties (UWI), temperen de acute ontstekingsreactie behulp van een verscheidenheid van gedeeltelijk gedefinieerd mechanismen. Om de wisselwerking tussen gastheer en bacteriële pathogenen te onderzoeken, een in vitro model van dit aspect van de aangeboren immuunrespons op UPEC ontwikkeld. In de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, een variatie op de Boyden-kamer, gekweekte blaas epithElial cellen worden gekweekt tot confluentie op de onderzijde van een doorlaatbare drager. PMN worden geïsoleerd uit menselijk veneus bloed en worden toegepast op de basolaterale zijde van de blaas epitheel cellagen. PMN migratie die de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting in reactie op bacteriële infectie of chemo-aantrekkende moleculen opgesomd met behulp van een hemocytometer. Dit model kan worden gebruikt om de interacties tussen UPEC en eukaryotische cellen te onderzoeken alsook de moleculaire vereisten voor traversal van blaas epitheel ondervragen door PMN. De transuroepithelial neutrofiel migratiemodel ons begrip van de initiële ontstekingsreactie op UPEC in de blaas bevorderen.

Inleiding

De beweging van cellen in het lichaam, vaak over grote afstanden, is nodig voor de groei en ontwikkeling, wondgenezing en immuunrespons. Celmigratie is complex en vereist de coördinatie van verschillende processen, waaronder signaal transductie en herschikking van cytoskelet componenten. Cellen kunnen willekeurig evenals bewegen (chemokinesis) richting gedefinieerde chemische gradiënten (chemotaxis). Vele technieken zijn ontwikkeld om celmigratie in vitro bestuderen. De oudste en meest gebruikte techniek, de Boyden-kamer, bestaande uit een verticaal tweekamersysteem waarbij een chemoattractant stof wordt in de onderste kamer en cellen van belang worden geplaatst in de bovenste kamer ^1. De beweging van cellen in de permeabele filter met poriën van gedefinieerde grootte, die de twee kamers wordt bewaakt. Aanvullende technieken ontwikkeld om celmigratie te onderzoeken, waaronder Zigmond kamer ² en kamer Dunn^3. Deze collectieve benaderingen hebben aanzienlijke inzicht in de beweging van vele verschillende celtypes opgeleverd.

Naast ondervragen de basisprincipes van chemokinesis en chemotaxis, zijn twee kamers assays onderzoek van celmigratie door extracellulaire matrixcomponenten en zowel endotheliale en epitheliale lagen vergemakkelijkt. Een voordeel van twee-kamer systemen via andere technieken is dat het poreuze membraan kan worden bekleed met eiwitten zoals collageen of fibrinogeen, en celmigratie in een extracellulaire matrix-achtige barrière kan worden beoordeeld. Daarnaast kunnen gekweekte cellijnen worden gekweekt en gedifferentieerd op permeabele steunen. Om de beweging van cellen in de endotheliale barrière te onderzoeken, worden gekweekte endotheelcellen gezaaid en gekweekt in het bovenste reservoir van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen, zoals immuuncellen, toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie in het onderste reservoir en in dedothelial barrière in de fysiologische apicale-to-basolaterale richting wordt waargenomen. Dit model is van onschatbare waarde geweest bij het begrijpen van extravasatie van immuuncellen uit het bloed. In tegenstelling tot transendotheliale migratie, de beweging van cellen in een epitheliale barrière treedt meestal in de basolaterale naar apicale richting. Om modelleren deze gebeurtenissen in vitro onderzoekers zaad en groeien gekweekte epitheelcellen aan de onderzijde van de permeabele steunen. Beweeglijke cellen worden toegevoegd aan het bovenste reservoir en migratie over de epitheliale barrière, die de basolaterale naar apicale richting bewaakt. Dergelijke modellen van transepitheliaal migratie hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van ontstekingsreacties op mucosale oppervlakken, in het bijzonder die van de long en darm ^4,5.

In tegenstelling, is immuun cel mensenhandel door het epitheel van de urinewegen veel minder aandacht gekregen. Om onze understandi verderng aangeboren immuunrespons bij de urinewegen tijdens infectie met uropathogene Escherichia coli (UPEC), ontwikkelden we een in vitro test, de transuroepithelial neutrofielen migratie assay, dat onderzoek van polymorfonucleaire leukocyten maakt (PMN; neutrofielen) beweging over een blaas epitheelbarrière ^{6 -8.} Zoals bij andere twee kamers modellen transepitheliale migratie worden gekweekte menselijke blaas epitheelcellen gegroeid op de onderzijde van een doorlaatbare steun en vormen confluente epitheliale lagen. Menselijke neutrofielen, geïsoleerd uit veneus bloed, worden aangebracht op de basolaterale zijde van de epitheliale laag en migratie over het epitheel van de fysiologisch relevante basolaterale naar apicale richting wordt gekwantificeerd in reactie op infectie door verschillende stammen van E. coli of de aanwezigheid van chemoattractant moleculen. Veel onderzoek was gericht op neutrofielen beweging, zowel chemokinesis en chemotaxis, bij het ontbreken van extra celtypes. De transuroepithelial neutrofielen migratie test is voordelig omdat het rekening houdt met de complexe interacties tussen de blaas epitheel cellen en immuuncellen tijdens infectie. Deze soepele in vitro model heeft het potentieel om de gedetailleerde onderzoek immuunrespons uroepithelial oppervlakken mogelijk.

Protocol

1. Het kweken van 5637 Blaas epitheelcellen

Voer de volgende stappen in een laminaire stroming weefselkweek kap bereid met UV-bestraling en afgeveegd met 70% ethanol.

1. Bereid RPMI-1640 medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) [genoemd RPMI +], filter gesteriliseerd met een 0,22 urn poriegrootte en opwarmen tot 37 ° C in een waterbad.
2. Ontdooi een Cryovial van 5637 cellen (American Type Culture Collection HTB-9, afgeleid van blaascarcinoom) in een 37 ° C waterbad. Snel overbrengen van de ontdooide cellen om een 75 cm ² weefselkweek kolf met 20 ml RPMI +.
3. Incubeer de kolf bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% _CO2 totdat de cellen ongeveer 95% confluent (~ 6 x 10 ⁶ cellen per kolf), ongeveer 4 dagen.
4. Om de 5637 cellen subcultuur:
   1. Verwijder het medium uit de kolf. Was de cellen met 10 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde Saline (DPBS) bij kamertemperatuur.
   2. Voeg 6 ml warm (37 ° C) 0,05% trypsine, 0,02% EDTA-oplossing aan de kolf en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 15 minuten.
   3. Breng de cellen om een ​​15 ml conische buis en pellet door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten. Verwijder de trypsine / EDTA-oplossing.
   4. Resuspendeer de cellen in 6 ml RPMI + (10 ⁶ cellen / ml) en breng 1 ml (10 ⁶ cellen) in nieuw 75 ^cm2 kolf met 20 ml RPMI +.
5. Herhaal stap 1.4 tot cellen subcultuur om de 4 dagen of wanneer de cellen te bereiken 95% samenvloeiing.

2. Zaaien en Growing 5637 Cellen op Permeable Supports

Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. Voor optimale resultaten gebruikt u 5.637 cellen die minder dan 10 subculturen hebben ondergaan.

1. Met behulp van een steriel pincet, keren de doorlaatbare dragers in een steriele 25 mm diep weefselkweek schotel.
2. Trypsinize een 75 cm ² kolf van 5.637 cellen bij 95% samenvloeiing volgens stappen 1.4.1-1.4.3.
3. Met een 1.000 III pipet voorzichtig resuspendeer de cellen in ~ 2 ml RPMI + tot een concentratie van 3 x 10 ⁶ cellen / ml, bepaald met celtelling behulp van een hemocytometer.
4. Breng 50 pl van de celsuspensie (1,5 x 10 ⁵ cellen) aan elke doorlaatbare ondersteunen zonder het membraan. Plaats de deksel op de schaal en zorgvuldig plaats de schaal bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende ten hoogste 16 uur.
5. Met behulp van een steriel pincet, rechts de doorlaatbare dragers in een 24-wells plaat met 0,6 ml RPMI + per putje. Voeg 0,1 ml RPMI + het bovenste reservoir van elke doorlaatbare drager. Incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2.
6. Vervang het medium om de 2 dagen. Eerste, aspireren medium uit het bovenste reservoir gevolgd door de onderste reservoir, en breng verse RPMI + in omgekeerde volgorde, naar het onderste reservoir (0,6 ml) en vervolgens de bovenste reservoir (0,1 ml).
7. Zeven dagen na zaaien het permeabele steunen met 5637 cellen beoordelen samenvloeiing van de cellen. Vul het bovenste reservoir met RPMI + (~ 0,35 ml). De cellen voldoende confluent wanneer het medium niet in evenwicht tussen de bovenste en onderste reservoirs.

3. Bereiding van het bacterieel inoculum

1. Met behulp van aseptische techniek, voeg 20 ml van de juiste cultuur bouillon in een 250 ml kolf met een dop. Gebruik Luria-Bertani (LB) bouillon voor E. coli culturen en antibiotica aan de bouillon waar nodig.
2. Met behulp van een steriele inenting lus, te enten de bouillon met bacteriën uit een glycerol voorraad of een streep plaat. Voor UPEC stammen, incubeer de bacteriële kweek bij 37 ° C gedurende ongeveer 16 uur zonder schudden (productie van type 1 pili bevorderen).
3. Breng de bacteriecultuur een centrifugebuis. Pellet de bacteriën door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 10 minuten.
4. Schenk de bovenstaande vloeistofEn resuspendeer de bacteriën in PBS bij OD ₆₀₀ = 1,000, equivalent aan ~ 10 ⁹ CFU / ml.
   1. Een verhitting gedode bacteriële stimulus genereren incubeer een hoeveelheid (bijv. ~ 1,5 x 10 ⁸ CFU in 150 pl) van de geresuspendeerde bacteriën bij 55 ° C gedurende 30 minuten. Plaat een hoeveelheid van de door hitte gedode suspensie om bacteriële dood te bevestigen.
5. Vlak voor het gebruik, verdunnen de geresuspendeerd bacteriën (live of hitte gedode) 10-voudig tot 10 ⁸ CFU / ml in warme serum-vrij RPMI [genoemd RPMI-] in een microfugebuis.

4. Isolatie van humane neutrofielen uit perifeer bloed

De collectie van het bloed van volwassen vrijwilligers nodig vooraf beoordeling en goedkeuring van een Institutional Review Board. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en op de juiste verwijdering van gevaarlijke materialen om blootstelling aan menselijk bloed voorkomen.

1. Ongeveer 25 ml veneus bloed van gezonde volwassenen volunteer moeten in 3 steriele natrium-heparine bevattende bloedafnamebuisjes worden getrokken door personeel dat is opgeleid in aderlaten.
   1. Wikkel een rubber tourniquet rond de bovenarm, boven de elleboog.
   2. Ontsmet de ingangsplaats, de antecubitale fossa, met behulp van een steriele 70% alcohol schoon te vegen.
   3. Bevestig een plastic buis houder op een gevleugelde vlinder naald systeem.
   4. Steek de naald in een ader antecubitale bij een hoek van 30 ° of minder, schuine naar boven. De naald de ader doorboord wanneer een spurt van bloed in de plastic buis.
   5. Plaats een bloedafname in de plastic buis houder. Wanneer de eerste collectie buis vol is, te vervangen door de tweede collectie buis. Herhaal dit met de derde buis.
   6. Wanneer de derde collectie buis is ongeveer half vol, verwijder de tourniquet.
   7. Bedek de prikplaats met een steriele katoenen bal en langzaam trek de naald uit de ader. Schuif het beschermend schild over de naald en plaats ina biohazard naaldcontainer.
   8. Oefen druk uit op de prikplaats. Bedek de prikplaats en katoenen bal met een pleister.
   9. Keer de bloedafnamebuisjes aan de heparine verspreiden.

Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden.

2. Met behulp van een pipet 10 ml, zachtjes het bloed over te dragen aan een nieuwe, steriele 50 ml conische buis. Voeg een gelijkwaardige hoeveelheid 3% (w / v) dextraan in 0,9% NaCl en meng door omkeren. Incubeer de buis wordt bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
3. Zonder verstoring van de onderlaag voorzichtig zuigen de bovenlaag en overbrengen naar een nieuwe 50 ml conische buis. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant.
4. Resuspendeer de celpellet in een hoeveelheid 0,9% NaCl gelijk aan het uitgangsvolume bloed.
5. Laag 10 ml-centrifugatie oplossing onder de celsuspensie, preserveren van het grensvlak tussen de twee fasen. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min zonder remmen. Verwijder het supernatant.
6. Achtergebleven rode bloedcellen lyseren, resuspendeer de celpellet in 10 ml koude 0,2% NaCl. Incubeer gedurende 30 sec, en vervolgens onmiddellijk voeg 10 ml koud 1,6% NaCl tot isotoniciteit herstellen.
7. Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 6 minuten. Verwijder het supernatant.
8. Herhaal stap 4,6-4,7 totdat de celpellet duidelijk vrij van rode bloedcellen, typisch 3 rondes van lysis te zijn.
9. Met behulp van een pipet 1.000 III, resuspendeer de celpellet, voornamelijk PMN in warm (37 ° C) RPMI-een concentratie van 10 ⁷ cellen / ml, bepaald met celtelling behulp van een hemocytometer. Laat de cellen bij 37 ° C tot gebruik. Kenmerkend PMN levensvatbaarheid en zuiverheid> 99% zoals bepaald door trypan blauw exclusie en visualisatie van nucleaire morfologie na kleuren respectievelijk.

5. Transuroepithelial neutrofielen migratiezeggen

Voer de volgende stappen in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden. Gebruik alleen doorlaatbaar steunen dragende samenvloeiing 5637 cellagen, zoals bepaald in stap 2.7. De 24-well platen met RPMI-kan worden voorbereid en bij 37 ° C gehouden met 5% CO ₂ tot gebruik.

1. Aliquot 1 ml warm RPMI per putje in een 24-well plaat; bereiden 3 putten per doorlaatbare ondersteuning.
2. Zuig het medium van de bovenste en onderste reservoirs van de permeabele steunen.
3. Met behulp van een steriel pincet, overdracht van de doorlatende steunen aan de 24-well plaat bereid in stap 5.1. Was de doorlaatbare dragers driemaal in door de steunen uit goed goed.
4. Als een bacterieel inoculum wordt gebruikt, keren de doorlaatbare dragers in een steriele 25 mm diep weefselkweekplaat. Als een chemoattractant (bijv. N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) of IL-8) wordt gebruikt, ga dan naar stap 5.6.
5. Voor experimenten met levende of gedode bacterial stimuli, te enten de apicale zijde van elke doorlaatbare steun met 60 ul RPMI-(pseudo-infectie) of met de bacteriële inoculum (6 x 10 ⁶ CFU) bereid in stap 3.5. Plaats de deksel op de schaal en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 1 uur.
6. Voeg 0,6 ml RPMI per-goed op een 24-well laag-bevestigingsplaat, goed voor te bereiden 1 per doorlaatbare ondersteuning. Bereid 3 putjes die 0,5 ml RPMI-PMN ingang sommen.
   1. Als een chemoattractant wordt gebruikt in plaats van bacteriën, voeg de chemoattractant tot 0,6 ml RPMI-in 24-well plaat bereid in stap 5.6.
7. Rechts de doorlaatbare dragers in de 24-well laag-bevestigingsplaat.
8. Voeg 0,1 ml PMN (10 ⁶ PMN), bereid in stap 4.9, naar de bovenste reservoir (basolaterale zijde) van elke doorlaatbare ondersteuning. Voeg 100 ul PMN direct aan putjes die 500 ul RPMI-. Incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 1 uur.
9. Met behulp van een steriel pincet voorzichtig schrapen dedoorlaatbare membraan van de steun tegen de rand van de put om extra PMN van de apicale kant verwijderen en afvoeren van de drager.
10. Verzamel PMN door voorzichtig schrapen de bodem van elk putje met 1000 ul pipetpunt en dragen PMN suspensies microfuge buizen.
11. Opsommen PMN behulp van een hemocytometer.
12. Om het totale aantal PMN in het onderste reservoir berekenen, vermenigvuldigt het aantal PMN in 1 mm ² (100 nl) van 6000. Gegevens worden gerapporteerd als een percentage van de input PMN, of PMN getallen genormaliseerd tot 10 ⁶ ingang PMN.

Resultaten

De transuroepithelial neutrofiel migratie assay maakt de kwantitatieve beoordeling van menselijke PMN migratie over blaas gekweekte epitheelcellen lagen in reactie op verschillende stimuli (Figuur 1B). Terwijl het protocol is eenvoudig, er een aantal variabelen die PMN migratie beïnvloeden en bijgevolg invloed op de reproduceerbaarheid van deze test. Maatregelen moeten worden genomen, terwijl de voorbereiding van de doorlatende steunen en de PMN variabiliteit te verminderen tussen de technische en biolo...

Discussie

Met behulp van een gekweekte blaas epitheelcellijn en vers geïsoleerde humane PMN, hebben we een in vitro model van transuroepithelial neutrofielmigratie. Dit model is behulpzaam geweest bij het ​​begin tot de complexiteit van de aangeboren immuunrespons tijdens infectie van de urinewegen (UTI), een zeer veel voorkomende bacteriële infectie meestal veroorzaakt door UPEC ⁹ ontleden geweest. Tijdens blaasontsteking of cystitis, werving van PMN aan de blaas lumen is essentieel voor bacteriële verwijderi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Transwell Inserts (d.w.z. doorlaatbare dragers)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm porie, polyester membraaninsert
BD Vacutainer Bloedopnamebuizen	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml groene dop buizen met natriumheparine
BD Safety-Lok Bloedopname en Infusie Set	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 inch naald x 12 inch slang
BD Vacutainer eenmalig, niet-stapelbaar houder	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextraan	Sigma-Aldrich	D4876	Van Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS dichtheidscentrifugeeroplossing	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra-Low Attachment Platen	Corning	3473	24-well, heldere platte bodem
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	Gereconstrueerd in DMSO tot 10 mM
Recombinant Human CXCL8/IL-8	R&D Systems	208-IL	Gereconstrueerd in PBS tot 100 μg/ml