Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Summary

De bereiding van hoogwaardige gist celextracten is een noodzakelijke eerste stap in de analyse van afzonderlijke eiwitten of hele proteomen. Hier een snelle, efficiënte en betrouwbare homogeniseren protocol voor gist cellen die is geoptimaliseerd om proteïnefuncties, interacties, en post-translationele modificaties behouden beschrijven we.

Abstract

Homogenisatie door kraal slaan is een snelle en efficiënte manier om DNA, RNA, eiwitten, metabolieten en bevrijden van gist cellen, die notoir moeilijk te verstoren. Hier beschrijven we het gebruik van een parelmolen homogenisator voor de extractie van eiwitten in buffers geoptimaliseerd om de functies interacties en post-translationele modificaties van eiwitten behouden. Logaritmisch groeiende cellen die het eiwit van belang worden gekweekt in een vloeibaar kweekmedium van keuze. De groeimedia kan worden aangevuld met reagentia om eiwitexpressie te induceren van induceerbare promoters (bijv. galactose), synchroniseren celcyclus stadium (bv. nocodazole), of remmen proteasoomfunctie (bijv. MG132). De cellen worden vervolgens gepelleteerd en geresuspendeerd in een geschikte buffer die protease en / of fosfatase remmers en worden hetzij onmiddellijk verwerkt of bevroren in vloeibare stikstof voor later gebruik. Homogenisatie bewerkstelligd door zes cycli van 20 sec bead-beating (5,5 m / s), elk gevolgd door een minuut incubatie op ijs. Het resulterende homogenaat wordt geklaard door centrifugeren en kleine deeltjes kunnen worden verwijderd door filtratie. De resulterende gewist gehele celextracten (WCE) wordt geprecipiteerd met 20% TCA als directe analyse van alle eiwitten door SDS-PAGE gevolgd door Western blotting. Extracten zijn ook geschikt voor affiniteitszuivering van specifieke eiwitten, de detectie van post-translationele modificaties, of de analyse van medezuiverende eiwitten. Zoals het geval voor de meeste eiwitzuivering protocollen, kunnen sommige enzymen en eiwitten vereisen unieke omstandigheden of buffer samenstellingen voor hun zuivering en anderen instabiel of onoplosbaar genoemde voorwaarden zijn. In het laatste geval kan het protocol gepresenteerd een goed uitgangspunt verschaffen empirisch bepalen van de beste kraal-beating strategie voor eiwit-extractie en zuivering. We tonen de winning en zuivering van een epitoopgemerkte SUMO E3 ligase, Siz1, een celcyclusgereguleerd eiwit dat wordt zowel sumoylated en gefosforyleerd, en een SUMO-gerichte ubiquitine ligase subeenheid Slx5.

Introduction

De ontzagwekkende kracht van gistgenetica is legendarisch, maar de voorbereiding en analyse van de natieve eiwitten uit gist Saccharomyces cerevisiae, is vaak beladen met problemen. Dit laatste is het gevolg van de aanzienlijke mechanische sterkte en elasticiteit van de gistcelwand ^1. Verschillende middelen zijn beschreven voor de enzymatische, chemische, mechanische en druk gebaseerde verstoring van gistcellen whole-cell-extract te verkrijgen ^2-6. Deze technieken verschillen sterk in hun effectiviteit om cel-vertegenwoordiger, natieve proteïne extracten die kan worden gebruikt voor verdere analyses of zuiveringsstappen leveren. Bijvoorbeeld, kan de gist celwand met lytische enzymen (bijv. zymolyase) en resulterende spheroblasts verwijderd kan worden verstoord door afschuiving, detergenten of osmotische lysis om eiwitten vrij. Deze aanpak is met succes toegepast als het startpunt voor vele subcellulaire fractioneringen maar het vereist langdurige incubatiedie niet verenigbaar zijn met de stabiliteit van sommige eiwitten ^7.

Proprietary gist lysis reagens (zoals detergenten) voor de chemische extractie van eiwitten van gistcellen in de handel verkrijgbaar, maar de doeltreffendheid van deze reagentia in eiwitextractie en hun effect op verdere biochemische karakterisatie van eiwitten is niet altijd duidelijk ^8. Hoge druk homogenisatoren, vaak aangeduid als Franse persen, effectief te breken gistcellen door eerst te onderwerpen aan hoge druk en vervolgens extruderen ze via een kleine opening in een drukcel. Deze techniek produceert hoogwaardige extracten maar de apparatuur is erg duur en niet geschikt voor kleine hoeveelheden cellen of meerdere monsters ^9. Daarom mechanische verbreking van gistcellen in een parelmolen is vaak de methode voor natieve gisteiwit preparaten ^10. Deze techniek houdt mechanische verbreking van de gist celwand met zuur-waschuur glasparels, die kan worden uitgevoerd met diverse shakers, vortexers of parelmolens. Met name kan deze methode worden gebruikt om meerdere kleinere monsters (1 ml cellen of minder) tegelijkertijd verwerken. Veel verschillende kralen of parelmolen verstoring matrices zijn nu commercieel beschikbaar voor bijna elke vorm van celtype in 2 ml buizen verstoren. Gezien de andere technieken en apparatuur, een parelmolen heeft het voordeel dat verstoring van gistcellen komt zeer snel, wat helpt bij post-translationele modificaties zoals sumoylation behouden, vooral wanneer de geschikte buffers met protease en / of proteasome inhibitors worden gebruikt en de temperatuur van extracten wordt geregeld.

Dit protocol is gericht op de snelle, efficiënte en betrouwbare extractie van endogene en overexpressie gebrachte eiwitten onder milde omstandigheden met het uiteindelijke doel om eiwitfunctie, interacties, en post-translationele modificaties behouden. Groeimedia, cellysebuffersamenstellingen en parelmolen instellingen worden geoptimaliseerd eiwit interacties en post-translationele modificaties zoals sumoylation en ubiquitinering handhaven.

Protocol

Zuivering van 6XHis-gemerkte eiwitten uitgedrukt in ontluikende gistcellen onder natieve omstandigheden

1. Groei van gistcellen en inductie van eiwitexpressie

(Modified van ²⁾

OPTIONEEL: Gebruik logaritmisch groeiende gist-kweken die eiwit van belang in plaats van de galactose-geïnduceerde kweken beschreven.

1. Transformeren cellen van een Gal ⁺ giststam met een plasmide dat codeert voor een galactose-induceerbare 6XHis gemerkte eiwit keuze. Bijvoorbeeld, zie lijst reagentia.
2. Inoculeer transformanten in 5 ml geschikte selectieve media (bijv. SD-uracil) bevattende 2% sucrose. Incubeer bij 30 ° CO / N, roterende.
3. Verdun O / N kweek, zodat de optische dichtheid bij 600 nm meet 0,3 (OD ₆₀₀ = 0,3) in 33 ml selectief medium met 2% sucrose. Groeien bij 30 ° C, onder schudden (Δ150 rpm).
4. Als de cultuur heeft bereikt OD ₆₀₀ = 0.8-1.5, Induceren de expressie van het gewenste eiwit door toevoeging van 17 ml YEP 3x met 6% galactose (recept in tabel 1), voor een uiteindelijke concentratie van 1 x YEP met 2% galactose. Totale cultuur volume is nu 50 ml. Incubeer onder schudden bij 30 ° C gedurende nog eens 5-6 uur.
   Opmerking: het volume cultuur kan worden gevarieerd. In stap 1.3, verdund in tweederde van de gewenste uiteindelijke volume. In stap 1.4, voegen een-derde het eindvolume 3x YEP / 6% galactose.
5. Meet de OD ₆₀₀ van de geïnduceerde kweek en centrifugeer Δ150-200 OD ₆₀₀ eenheden van cellen gedurende 5 min bij 5000 rpm bij 4 ° C.
6. Resuspendeer celpellet met 1 ml ijskoude PBS 1x met 1x proteaseremmer cocktail en transfer naar een 2 ml schroefdop buis.
7. Centrifugeer cellen gedurende 1 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. Decanteren supernatant.
8. Snap freeze celpellet in vloeibare stikstof, gevolgd door onmiddellijk cellysis of opslag bij -80 ° C tot verder gebruik.

2. Homogenisering van gistcellen and Extraction van eiwitten

1. Om de bevroren celpellet uit de vorige stap, voeg 200 pl zuur gewassen glazen parels en 500 ui ijskoude lysis buffer (recept in tabel 1 of gebruik cellysis buffer van keuze).
2. Kort pipet op en neer. Het is niet noodzakelijk volledig resuspendeer de cel pellet. Houd buizen op ijs te allen tijde.
   Opmerking: Het einde van de pipet tip kan worden afgesneden vóór en neer te pipetteren.
3. Bij 4 ° C, plaats de buis (s) met cellen in de kraal molen, balans, slot, en laat de machine volgens de instructies van de fabrikant.
4. Voer de kraal klopper met de tube (s) gedurende 20 sec bij 5,5 m / sec, dan plaats op slushy ijs gedurende 1 minuut. Herhaal 6x in totaal.
5. Schakel het geëxtraheerde proteïnen door centrifugeren gedurende 15 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. OPTIONEEL: verwijder kleine deeltjes door centrifugeren door een Spinx filter.
6. Bereid een monster van de gehele cel eitpakken (WCE) de aanwezigheid van het eiwit van belang bevestigen Western Blot:
   1. Voeg WCE overeenkomend met 2 OD ₆₀₀ eenheden van cellen (bijvoorbeeld 5 pl ontruimd extract als 200 OD ₆₀₀ eenheden van de cellen werden geoogst) tot 800 ul 20% trichloorazijnzuur (TCA). Vortex te mengen.
   2. Centrifugeer gedurende 2,5 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. Schenk de bovenstaande vloeistof, maar wees voorzichtig om de pellet te behouden.
   3. Voeg 800 ul van 2% TCA de pellet en vortex de buis gevolgd door centrifugatie gedurende 2,5 min bij 15.000 rpm bij 4 ° C. Schenk de bovenstaande vloeistof, maar wees voorzichtig om de pellet te behouden.
   4. Voeg 100 ul van TCA Sample Buffer (recept in tabel 1), vortex om pellet op te lossen. Opmerking: Als het monster buffer wordt zuur (geel wordt) na toevoeging aan de pellet, fracties van Δ10 ui Trisbase toevoegen [1M] totdat het monster is weer blauw.
   5. Incubeer in een 100 ° C warmte-blok voor 2-5 minuten.
   6. Vortex again om volledig te ontbinden indien restanten van pellet zijn nog aanwezig. Pellets middels deze methode bereid zijn notoir moeilijk volledig oplossen. Het kan Δ10 min van vortexen tot pellets volledig op te lossen nemen.
   7. WINKEL monster bij -80 ° C tot verder gebruik.
7. Snap bevriezen aliquots resterende vrijgemaakt WCE in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik.

3. Batch Zuivering van eiwitten uit gist celhomogenaten

Opmerking: Deze zuiveringswerkwijze werd geoptimaliseerd voor de zuivering van 6XHis gemerkte eiwitten on ^{Co2 +} metaalaffiniteitshars.

1. Hars Equilibration
   1. Voor een steekproef van ontruimd WCE bereid uit Δ20-40 OD ₆₀₀ eenheden van cellen, voeg 50-100 ul van affiniteithars een microcentrifugebuis. Eiwitten geëxtraheerd uit cellen die niet het gewenste eiwit of een niet-specifieke hars zoals amylose heeft uitgesproken, kan worden gebruikt als controles voor niet-specifieke binding.
   2. Was 5x hars met 1 ml wasbuffer: invertsuiker top-over-bottom totdat hars opnieuw gesuspendeerd en vervolgens draaien gedurende 1 min bij 5000 rpm bij 4 ° C. Het supernatans aspireren.
      Opmerking: als het uitvoeren van extractie en zuivering op dezelfde dag, kan hars evenwicht worden uitgevoerd voorafgaand aan extractie.
2. Eiwit Bindende voor Affinity Purification
   1. Zet 100-200 pi geklaard lysaat (Δ20-40 OD ₆₀₀ eenheden) tot 50-100 ul gewassen kralen, en brengen het totaal volume aan met lysebuffer 1 ml.
   2. Incubeer met nutatie of schommelen bij 4 ° C gedurende 2-5 uur.
   3. Draai gedurende 1 min bij 5000 rpm bij 4 ° C.
   4. Schrijf desgewenst een monster van het resterende supernatant voor verdere analyse van de niet-gebonden eiwitten. TCA neerslaan zoals hierboven voor de WCE (stap 2.6).
   5. Wassen met hars gebonden eiwitten 5x met 1 ml wasbuffer, gevolgd door een rotatie gedurende 1 min bij 5000 rpm bij4 ° C. Houd monsters koud tijdens wasbeurten.
3. Elutie van gebonden eiwitten
   1. Voeg 150 ul elutiebuffer om hars nutate bij 4 ° C gedurende 5 min, rotatie gedurende 1 min bij 5000 rpm bij 4 ° C en bewaar het supernatant in een nieuwe buis. OPTIONEEL: Herhaal 2x en zwembad eluties.
   2. Bereid uitgewassen steekproef voor Western Blot: Om 25 ul van geëlueerde eiwitten, voeg 25 ul 2x lithium-sulfaat (HLD) monsterbuffer met 2 pl β-mercapto-ethanol (BME) en incubeer in een 100 ° C hitte blok gedurende 2 minuten.
      Opmerking: Standard 2X Laemmli monster buffer kunnen ook worden gebruikt.
   3. Snap bevriezen overtollige geëlueerde eiwit in vloeibare stikstof.
      OPTIONEEL: strip overgebleven eiwitten uit hars met een gelijk volume van 2x LDS monsterbuffer bij 65 ° C gedurende 5 minuten, verwijder de LDS geëlueerde eiwitten naar een nieuwe buis en voeg 2 pl BME de geëlueerde eiwitten niet aan de hars. Deze volgorde is om het verwijderen van alle ionen of antilichamen die conjuga voorkomented aan de kralen.
   4. WINKEL monsters bij -80 ° C tot verder gebruik.
4. Western Blot en probe met geschikte antilichamen tegen eiwitten te visualiseren.
   1. Laad 10-20 pl (Δ1-3 OD ₆₀₀ eenheden) van elk monster en 3-10 ul van een eiwit ladder in een SDS-PAGE gel van keuze. Gels routinematig gebruikt voor dit protocol zijn 4-12% Bis-Tris en 8% Tris-Glycine.
   2. Voer gel bij 200 V gedurende 50 minuten.
   3. Transfer van eiwitten gel een PVDF membraan door semi-droge overdracht bij 19 V gedurende 20-30 min (recept in tabel 1).
   4. Blok membraan 4% milk/1x Tris gebufferde zoutoplossing TWEEN (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C (recept in tabel 1).
   5. Incubeer membraan met primair antilichaam tegen het epitoop-gemerkte eiwit plaats in 4% milk/1x TBST gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C.
   6. Was 3x membraan voor elk 1 x 5 minuten TBST.
   7. Incubeer membraan met de juistesecundaire mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd antilichaam gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur.
   8. Was 3x membraan gedurende 15 minuten elk in een groot volume 1x TBST.
   9. Bedek membraan met ECL substraat en wikkel in Saran Wrap.
   10. Blootstellen membraan te filmen en te ontwikkelen om eiwitten te visualiseren.

Results

De representatieve resultaten blijkt dat de beschreven kraal-beating en eiwitextractie protocol is bruikbaar voor de reproduceerbare bereiding van eiwitten voor verschillende stroomafwaartse toepassingen (samengevat in tabel 2). SDS-PAGE gevolgd door Coomassie kleuring van WCEs blijkt dat een groot aantal proteïnen (~ 12 tot> 250 kDa) reproduceerbaar kunnen worden geëxtraheerd uit gist cellen (Figuur 1A). Discrete banden over een reeks molecuulgewichten indicatie van hoge kwaliteit e...

Discussion

Dit protocol is gericht op de voorbereiding van intacte, inheemse, en post-translationeel gemodificeerde eiwitten uit gist cellen voor downstream-toepassingen. Voordat dit protocol, is het essentieel om te bepalen of het eiwit van belang gemakkelijk kan worden gedetecteerd in eiwitextracten bereid onder ¹² denaturerende omstandigheden. Indien polyklonale antilichamen niet beschikbaar kan voordelig zijn om het epitoop tag eiwit van belang, zodat het fusie-eiwit kan worden gedetecteerd op Western blots. In het ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ giststam die kan worden gebruikt voor inductie en extractie
pYES2.1 TOPO vector	Life Technologies	K4150-01	GAL+ giststam die kan worden gebruikt voor inductie en extractie; bevat een V5/6xHIS-tag
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap	BioExpress	C-3369-3	Zorg ervoor dat de buis goed past in de bead ruptor
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8161	Gebruik voor aanvullende filtering van opgehelderde lysaat
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	Voor de zuivering van 6xHIS-gelabelde eiwitten
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	Om monsters voor te bereiden en/of te elueren vóór SDS-PAGE en Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Voorbereide gels die vaak worden gebruikt voor SDS-PAGE vóór Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Proteïnegelstof
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381	Alternatieve commerciële lysisbuffer
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	Methode van immunoprecipitatie
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels	Life Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	Geiten-pAb voor muis-IgG (HRP)