Methodenartikel

Analyse van skeletspierdefecten bij larven van zebravis door middel van birisfringence- en touch-evoke escape response-assays

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50925

⸱

13 december 2013

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

De zebravis is nu een gevestigde en krachtige tool voor het modelleren van musculaire dystrofieën, aangeboren myopathieën en gerelateerde neuromusculaire ziekten. Tweekleurigheid en door aanraking veroorzaakt ontsnappingsgedrag zijn twee veelvoorkomende niet-invasieve tests die worden gebruikt om de mate van musculaire desorganisatie en bewegingsbeperking van zebravisembryo's tijdens de vroege ontwikkeling te bepalen.

Samenvatting

Zebravissen (Danio rerio) zijn een bijzonder effectief instrument geworden voor het modelleren van menselijke ziekten die spierweefsel aantasten, waaronder spierdystrofieën1-3, aangeboren myopathieën4,5 en verstoringen in sarcomeersamenstelling6,7, vanwege de hoge genomische en structurele overeenkomsten met zoogdieren8. Spierdisorganisatie en voortbewegingsproblemen kunnen in de zebravis snel worden beoordeeld in de eerste paar dagen na de bevruchting. Twee tests om skeletspierdefecten bij zebravissen te karakteriseren zijn birefringentie (structureel) en de tastreactie op ontsnapping (gedrag).

Birefringentie is een fysische eigenschap waarbij licht wordt geroteerd wanneer het door geordende materie passeert, zoals de pseudo-kristallijne opstelling van spiersarcomeren9. Het is een eenvoudige, niet-invasieve benadering om de integriteit van spieren bij doorzichtige zebravislarven vroeg in de ontwikkeling te beoordelen. Wilde zebravissen met hoog georganiseerd skeletspierweefsel lijken zeer helder op een donkere achtergrond wanneer ze tussen twee gepolariseerde lichtfilters worden bekeken, terwijl spiermutanten birefringentiepatronen hebben die specifiek zijn voor de primaire spierziekte die ze modelleren. Zebravissen die spierdystrofieën modelleren, ziekten die worden gekenmerkt door degeneratie van myofibers gevolgd door herhaalde rondes regeneratie, vertonen degeneratieve donkere vlekken in het skeletspierweefsel onder gepolariseerd licht. Niet-dystrofische myopathieën worden niet geassocieerd met necrose of regeneratieve veranderingen, maar resulteren in gedesorganiseerde myofibers en zwakte van het skeletspierweefsel. Myopathische zebravissen vertonen doorgaans een algemene vermindering van birefringentie, wat de desorganisatie van sarcomeren weerspiegelt.

De tastreactie op ontsnapping test omvat het observeren van het zwemgedrag van een embryo als reactie op taststimulatie10-12. In vergelijking met wildtype-larven vertonen mutante larven vaak een zwakke ontsnappingscontractie, gevolgd door langzaam zwemmen of een andere vorm van verminderde beweging die de larve niet meer dan een korte afstand voortstuwt12. Het voordeel van deze tests is dat de ziekteprogressie bij hetzelfde vistype gedurende meerdere dagen in vivo kan worden gemonitord en dat grote aantallen vissen in een korte tijd kunnen worden geanalyseerd in vergelijking met hogere gewervelden.

Protocol

1. In vivo Analyse van de skeletspierstructuur door Birefringence

  1. Bereid kweekkooien voor door de mannetjes(s) van de vrouwtjes van de gewenste zebravislijn(en) te scheiden laat in de namiddag na het voeren.
    1. Onderscheid vrouwtjes door hun grotere buik en lichte blauwe/witte kleuren, en mannetjes door hun slanke lichaamsvorm en roze/gele tinten.
    2. Succes met paarsgewijze kruisingen (één mannetje en één vrouwtje) kan slechts ongeveer 50% zijn. Voor een hoger succespercentage, kruist u één mannetje met 2-3 vrouwtjes.
  2. Verwijder de kooiverdelers de volgende ochtend kort na het begin van het licht en laat de vissen ongestoord paaien.
  3. Verzamel de eieren met een zeef wanneer voldoende bevruchte eieren op de bodem van de tank zijn gelegd.
  4. Breng de embryo's over in een diepe petrischaal door de zeef te spoelen met viswater en plaats de oudervissen terug in hun tanks. Plaats schalen met embryo's in een 28,5 °C incubator.
  5. Verwijder de onlevensvatbare eieren en puin later die dag of de volgende ochtend, en plaats de embryo's terug in de incubator voor verdere groei.
  6. Embryo's/larven bereiken de juiste leeftijd om birefringence waar te nemen op 3-7 dagen na bevruchting (dpf), omdat resultaten vóór 3 dpf mogelijk lijden aan beperkte contrast. Wilde-type embryo's komen tussen 48-60 uur na bevruchting (hpf) uit hun chorion, gevolgd door een rechttrekken van de lichaamsas. Laat uitkomende wilde-type of mutante embryo's kunnen manuele dechorionatie vereisen.
    1. Maak voorzichtig een scheur in het chorion met scherpe pincetten en draai het ondersteboven zodat het embryo eruit valt.
    2. Laat dechorioneerde embryo's rechttrekken voordat u met de test begint.
    3. Verdoof embryo's met tricaine (0,04% in viswater) om te helpen bij hun juiste positionering.
  7. Plaats een dissectiemicroscoop met een gepolariseerd lens dat geroteerd kan worden om de hoek van gepolariseerd licht aan te passen (Figuur 1A).
  8. Plaats dechorioneerde, verdoofde embryo's direct bovenop een tweede gepolariseerde lens langs de laterale as van het lichaam. De tweede lens moet onder de bovenste lens worden geplaatst, op het microscoopplatform (Figuur 1B). Gebruik op geen enkele manier plastic petrischalen tijdens de birefringence test, omdat plastic niet geschikt is voor de transmissie van gebroken licht.
  9. Draai de bovenste lens met het embryo van belang in zicht totdat de polarisatieassen van de twee lenzen op 90° van elkaar zijn gepositioneerd en de achtergrond volledig donker is.
  10. De optimale output van de test is afhankelijk van de oriëntatie van de vissen tussen twee gepolariseerde lenzen. Beweeg de vissen rond om ervoor te zorgen dat ze zo plat mogelijk liggen.
    1. Als de vis gebogen is, zullen alleen de segmenten met deze platte oriëntatie het gepolariseerde licht passeren en birefringence vertonen. Meet in dergelijke gevallen de birefringence in de platte gebieden en noteer de birefringence van het overeenkomstige gebied in de wilde-type vis (bijv. somieten 1-10 in zowel wilde-type als mutante vissen).
  11. Observeer het birefringente fenotype van de vis.
    1. Wilde-type vissen met hoog georganiseerde skeletspieren tonen heldere birefringence, omdat de brekingsindex voor het licht parallel aan de myofilamenten hoger is dan het gepolariseerde licht loodrecht op deze structuren.
    2. Vissen met disgeorganiseerde skeletspieren die suggereren op een niet-degeneratieve myopathie of een ontwikkelingsdefect, tonen doorgaans een algemene vermindering in birefringence.
    3. Vissen met disgeorganiseerde skeletspieren kenmerkend voor een spierdystrofie vertonen vaak een vlek-achtig patroon van birefringence, met donkere gebieden die spierdegeneratie vertegenwoordigen tussen heldere gebieden van normale spierarchitectuur.
  12. Kwantificeer birefringence door afbeeldingen van wilde-type en mutante vissen te maken onder gepolariseerd licht met dezelfde belichtingsinstellingen en vergroting. Sla afbeeldingen op als.tiff-bestanden.
    1. Open birefringence afbeeldingen in ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Selecteer voor elke afbeelding het gebied van de zebravisspier door een lijn rond het lichaam te tekenen met de optie “Polygon Selecties” uit de werkbalk.
    3. Gebruik “Set Measurements” onder het “Analyze” drop-down menu om de vereiste statistieken voor de afbeelding te selecteren.
      1. Minimale selectie vereist dat de vakken voor “Area,” “Mean gray value,” en “Min & max gray value” zijn aangevinkt.
      2. Een maximale grijze waarde van >255 geeft pixelsaturatie aan. Gebruik daarom afbeeldingen met maximale grijze waarden minder dan 255.
    4. Normaliseer de gemiddelde intensiteit met het geselecteerde gebied en herhaal deze kwantificeringsprocedure voor elke birefringence afbeelding.

2. Touch-evoked Escape Gedrag Assay

  1. Stel kweekparen van de geschikte zebravislijn(en) op en verzamel embryo's zoals beschreven in stappen 1.1-1.5 hierboven.
  2. Plaats dechorioneerde embryo's/larven op 2-7 dagen na bevruchting afzonderlijk in een diepe petrischaal of

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Birefringentie kan worden gebruikt als een efficiënte, niet-invasieve assay om inzicht te krijgen in de staat van de myofibrillaire organisatie in levende zebravisembryo's. Er worden voorbeelden gepresenteerd van wild-type zebravisen, evenals zebravisen met een verminderde expressie van genen die kritiek zijn voor de ontwikkeling en functie van de skeletspieren. Wild-type zebravisen op 5 dpf vertonen onder gepolariseerd licht sterk birefringente skeletspieren als gevolg van de geordende opstelling van myofilamenten (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Primaire neuromusculaire aandoeningen worden traditioneel geclassificeerd als dystrofische of non-dystrofische processen. Spierdystrofieën worden gekenmerkt door myofiber-degeneratie gevolgd door herhaalde rondes van regeneratie, wat uiteindelijk leidt tot een eindfaseproces gekenmerkt door fibrose en vervanging door vetweefsel14. Non-dystrofisch myopathieën daarentegen worden niet geassocieerd met necrose of regeneratieve veranderingen, maar resulteren wel in ongeorganiseerde myofibers en algehele skeletspier...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

Dankbetuigingen

We danken Behzad Moghadaszadeh voor zijn geweldige hulp bij de kwantificering van birefringentie-afbeeldingen. Dit werk werd gefinancierd door de Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) en het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345), evenals genereuze steun van A Foundation Building Strength, Cure CMD en de AUism Charitable Foundation. VAG wordt ondersteund door K01 AR062601 van het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, en LLS wordt ondersteund door F31 NS081928 van het National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tricaine SigmaA5040
PetrischalenFischer Scientific0875711Z
PincetFischer Scientific100189-588
InsectenpinFischer ScientificS67375
Gepolariseerde lenzenRitz CameraQuantaray Tristar Optics C-PL 72mm
IncubatorFischer ScientificIsotemp Incubator Model 630D
MicroscoopNikon Instruments Inc.SMZ 1500
CameraDiagnostic Instruments Inc.SPOT RT3
BeeldverwerkingssoftwareDiagnostic Instruments Inc.SPOT 5.1 Advanced

Referenties

  1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  2. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
  3. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  4. Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
  5. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
  6. Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle. J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).
  7. Hawkins, T. A., et al. The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis. Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).
  8. Barbazuk, W. B., et al. The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes. Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).
  9. Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy. Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).
  10. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish. Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).
  11. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).
  12. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
  13. Hirata, H., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).
  14. Wallace, G. Q., McNally, E. M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).
  15. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  16. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  17. Low, S. E., et al. TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors. J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).
  18. Liu, D. W., Westerfield, M. Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming. J. Physiol. 403, 73-89 (1988).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zebravislarvendubbelbrekingsassayaanraakingsge nduceerde ontsnappinganalyse van spierstructuurgepolariseerd lichtmicroscopiekwantificering van spierintegriteitmeting van ontsnappingsresponsin vivo monitoringhigh throughput screening

Gerelateerde artikelen