Methodenartikel

Kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus

DOI:

10.3791/50933

⸱

7 december 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven procedures om atherosclerotische laesies in muismodellen te kwantificeren en te karakteriseren door middel van nauwkeurig snijden van de aortasinus en de ascenderende aorta, gecombineerd met histochemische en immunohistochemische analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atherosclerose is een ziekte van de grote slagaders en een belangrijke onderliggende oorzaak van hartinfarct en beroerte. Er zijn verschillende muismodellen ontwikkeld om het onderzoek naar de moleculaire en cellulaire pathofysiologie van deze ziekte te vergemakkelijken. In dit manuscript beschrijven we specifieke technieken voor de kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aorta sinus en opgaande aorta. Het voordeel van deze procedure is dat het een nauwkeurige meting van de dwarsdoorsnede en het totale volume van de laesie biedt, die kan worden gebruikt om atherosclerotische progressie tussen verschillende behandelingsgroepen te vergelijken. Dit is mogelijk door gebruik te maken van de klepblaadjes als een anatomisch herkenningspunt, samen met een zorgvuldige aanpassing van de snijshoek. We beschrijven ook basiskleuringsmethoden die kunnen worden gebruikt om atherosclerotische progressie te beginnen te karakteriseren. Deze kunnen verder worden aangepast om antigenen van specifiek belang voor de onderzoeker te onderzoeken. De beschreven technieken zijn over het algemeen toepasbaar op een breed scala van bestaande en nieuw gecreëerde voedings- en genetisch-geïnduceerde modellen van atherogenese.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen twee decennia hebben de ontwikkeling en het gebruik van atherosclerose-gevoelige muismodellen door middel van voedings- en/of genetische manipulatie onze kennis van de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van atherosclerotische laesies aanzienlijk verbeterd1-3. Een groot deel van onze kennis en begrip van atherogenese komt uit studies die zijn uitgevoerd bij apolipoproteïne (Apo)-E-deficiënte4 muizen, waarbij atherosclerotische laesies spontaan ontwikkelen en bij lagedichtheids-lipoproteïne-receptor (LDLR)-deficiënte5 muizen, waarbij atherosclerose door voeding wordt veroorzaakt. Een belangrijk voordeel van deze modellen is dat ze de studie van relatief grote aantallen genetisch gedefinieerde dieren onder gecontroleerde voedings- en omgevingsomstandigheden mogelijk maken. Bovendien lijken de gevorderde atherosclerotische laesies die zich in sommige van deze muisstammen ontwikkelen sterk op die welke bij mensen worden waargenomen, met lipidengevulde necrotische kernen en fibreuze kapsels. Atherosclerose ontwikkelt zich snel in deze muismodellen, waardoor het zeer haalbaar is om de laesieontwikkeling, van vetstrepen tot gevorderde plaque, in kwestie van weken te bestuderen. Bovendien is aangetoond dat bekende risicofactoren voor hart- en vaatziekten bij mensen, waaronder diabetes6, dyslipidemie7, obesitas8, hypertensie9, sigarettenrook10 en een sedentaire omgeving11, de laesieontwikkeling verder versnellen.

In de meeste, zo niet alle atherosclerose-gevoelige muismodellen, kan laesieontwikkeling voor het eerst worden gedetecteerd in de aortasinus. Het tijdstip van begin hangt af van de muisstam en het dieet. Naarmate de laesies groter worden, hebben ze de neiging om omhoog te groeien in de opgaande aorta. Bij ApoE-/- en LDLR-/- muizen kan de verdere ontwikkeling van laesies worden gedetecteerd bij aortabifurcaties in de aortaboog, in de afdalende aorta en in andere grotere slagaders12-14. Dr. Beverly Paigen en collega's hebben, naast het ontwikkelen van enkele van de vroegste modellen van door voeding veroorzaakte atherosclerose, ook een assay ontwikkeld voor de kwantificering van atherosclerotische laesies in de aortasinus, die de standaard is geworden voor laesiemeting in muismodellen15. In de loop der jaren is deze techniek verfijnd en in detail beschreven16. Hier presenteren we een aangepaste versie van de "Paigen-methode" voor de kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies bij een muis. De analyse van seriële aorta-dwarsdoorsneden uit een specifiek vaatgebied en in een gedefinieerde en vaste oriëntatie, vergemakkelijkt nauwkeurige gegevensverzameling en maakt nauwkeurige detectie van variaties in laesieontwikkeling in verschillende behandelingsgroepen mogelijk. De hier gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op de vorige technieken. Specifiek beschrijven we hoe de karakterisering van laesies in termen van oppervlakte, volume, necrotisch en cellulair materiaal mogelijk is door de onderzoek van seriële secties met behulp van een combinatie van histochemie en immunohistochemie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Animal Research Ethics Board van McMaster University heeft alle hierin beschreven procedures vooraf goedgekeurd.

1. Hart en aorta verzamelen

  1. Verdoofd de muis en open voorzichtig de borstholte om het hart en de proximale aorta zichtbaar te maken.
    1. Extracteer het bloed uit de muis door directe punctie van de rechter ventrikel van het hart.
      Opmerking: Het bloed kan worden opgeslagen en gebruikt voor de analyse van plasmalipiden en andere bloedfactoren.
  2. Dode de muis door cervicale dislocatie.
  3. Spoel de vaatbundel met 5 ml zoutoplossing.
    Opmerking: Dit wordt bereikt door zwaartekrachtperfusie door een naaldpunctie in de linker ventrikel. Om drainage mogelijk te maken, wordt een kleine insnijding gemaakt in het rechter atrium. Na het spoelen van de vaatbundel, kunnen weefselmonsters van lever, spier en vetweefsel worden verzameld, snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ºC voor toekomstige analyse.
  4. De vaatbundel wordt gefixeerd door zwaartekrachtperfusie in de linker ventrikel met 10% neutraal gebufferde formaline.
    Opmerking: Zodra de perfusie is gestart, wordt de stroom van 10% neutraal gebufferde formaline aangepast tot een langzame druppel zodat het proces 1-2 minuten duurt. Organen en weefsels die zijn geperfundeerd, kunnen worden gebruikt voor de studie van eiwitexpressie door immunofluorescentie of histochemie, maar ze kunnen over het algemeen niet worden gebruikt als monsters voor western blotting of voor de studie van genexpressie.
  5. Extracteer voorzichtig het hart en ongeveer 2 mm van de proximale aorta uit het karkas. Andere weefsels, inclusief de aflopende aorta, kunnen worden verzameld en opgeslagen voor latere analyse.
    Opmerking: De aflopende aorta (tot de iliacale bifurcatie) kan ook worden gebruikt om atherosclerose te onderzoeken.
  6. Maak een transversale snede met een scalpel op het verwijderde hart op een manier die loodrecht staat op de opgaande aorta.
    Opmerking: Dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van een dissectiemicroscoop en kan effectief worden gedaan door te snijden langs een rechte lijn die de onderste uiteinden van de rechter en linker atria verbindt (Figuur 1).
  7. Bewaar het apicale (bovenste) deel van het hart in een inbeddingscassette en dompel het onder in neutraal gebufferde formaline voor verwerking.

2. Voorbereiding van de aorta

  1. Plaats de cassette met het gedissekteerde weefsel in de weefselprocessor.
  2. Verwerk weefselmonsters.
    Opmerking: Over het algemeen zijn weefselprocessoren geprogrammeerd om 's nachts te werken vanwege de lengte van de operatie en de oplossingen die bij dit proces betrokken zijn. De monsters worden verwerkt volgens een vast protocol:
    1. 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 1 uur bij 42 ºC.
    2. 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 1 uur bij 42 ºC.
    3. 70% ethanol gedurende 30 minuten bij 40 ºC.
    4. 85% ethanol gedurende 30 minuten bij 40 ºC.
    5. 100% ethanol gedurende 45 minuten bij 40 ºC.
    6. 100% ethanol gedurende 45 minuten bij 40 ºC.
    7. 100% ethanol gedurende 45 minuten bij 40 ºC.
    8. Xyleen gedurende 1 uur bij 40 ºC.
    9. Xyleen gedurende 1 uur bij 40 ºC.
    10. Xyleen gedurende 1 uur bij 40 ºC.
    11. Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.
    12. Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.
    13. Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.
    14. Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.
  3. Smelt de paraffinewas 's nachts bij 62 ºC (Figuur 1D-E). Schat de totale hoeveelheid paraffinewas die moet worden gebruikt op basis van de gram paraffinewas die nodig is om een histologievorm te vullen en het aantal blokken dat moet worden bereid.
    Opmerking: Een diepe histologievorm heeft de voorkeur boven een ondiepe vorm omdat deze een breder potentieel rotatiehoek biedt bij het snijden. Een enkele diepe histologievorm vereist 11 g paraffinewas.
  4. Plaats elk verwerkt weefsel in een diepe histologievorm en giet vervolgens gesmolten paraffinewas om de vorm volledig te vullen (Figuur 1F). Bedek de vorm met een gelabelde plastic cassette (Figuur 1G).
  5. Koel de gevulde vorm op ijs of op een koude oppervlakte (Figuur 1H) om de vaste blok te creëren en de blok van de vorm te scheiden (Figuur 1I-J).
    Opmerking: Wanneer het gedissekteerde hart in de vorm wordt geplaatst, zorg ervoor dat het binnenoppervlak van het hart de basis van de vorm raakt en ga dan verder met het vullen van de blok met gesmolten paraffine. Een gelabelde plastic cassette bedekt de vorm voordat deze stolt om een basis te bieden om de blok te hanteren. Eenmaal afgekoeld, wordt de vorm verwijderd en kunnen de paraffineblokjes voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard.

3. Het snijden van de aorta

  1. Plaats de blok met het hart in de monstershouder van de microtoom zodat het van binnen naar de bovenkant van het hart kan worden gesneden (Figuur 2)
  2. Stel de microtoom in om een sectie dikte van 10 µm te snijden en ga door met het snijden van het hart.
  3. Verzamel secties op een glazen plaat en onderzoek onder een lichtmicroscoop om de positie

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 Vijf weken oude LDLR-/- muizen kregen gedurende tien weken een standaarddieet of een vetrijk dieet. De muizen werden geofferd en geperfuseerd met formaline zoals hierboven beschreven. Er werden dwarsdoorsneden van de aortasinus geprepareerd en gekleurd met hematoxyline en eosine om het oppervlak en het volume van de laesies te bepalen (Figuur 4). Wanneer muizen een standaardvoerdieet krijgen, is de atherosclerotische ontwikkeling zeer beperkt en mogelijk niet detecteerbaar op 15-weekse leeftijd. Een vet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atherosclerose is een complexe chronische ziekte van de grote spierarteries die een belangrijke onderliggende oorzaak is van myocardinfarct en beroerte. De progressie van de ziekte omvat de interactie van vele verschillende celtypen binnen de arteriële wand, met circulerende bloedcellen, lipoproteïne deeltjes en andere bloed-dragende factoren die we pas beginnen te begrijpen. Veel van onze huidige kennis over de ontwikkeling en progressie van atherosclerose is afkomstig uit studies die zijn uitgevoerd in speciaal ontworp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door een exploitatiesubsidie van de Canadian Institutes of Health Sciences en de Canadian Diabetes Association. DEV wordt ondersteund door een beurs van de Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chili).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LDLR-deficient mice (D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)The Jackson Laboratorystock #002207
FormalinSigma-AldrichHT5011
Histology MoldsTed Pella Inc27195
ParaffinParamat19286-10
Coated slidesFisher12-550-15
Solvent containersTissue Tek II4457
MicrotomeLeicaRM22S5
Water bathVWR80086-982
MicroscopeOlympusBX41TF
CameraOlympusDP72
ImageJNIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
ProcessorSakura FinetekVIP6-A1
Processing cassettesVWR18000-134
Preassure CookerNordic Ware
CoverslipFisher12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
Microtome bladeThermo Scientific30-518-35
Antifade mounting mediumSigma-AldrichF-4680
Xylene mounting medium Sigma-Aldrich44581
Aquous mounting mediumSigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4/80 antibodyAbcamAb6640
Alpha actin antibodySanta Cruz BiotechnologySC-32251
Mayer’s HematoxylinSigma-AldrichE4382
Eosin YSigma-AldrichMHS16
DAB (3,3'-Diaminobenzidine)DakoK3468

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).
  2. Daugherty, A., Rateri, D. L. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36, 129-138 (2005).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Diet and murine atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).
  4. Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  5. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  6. Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice. J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).
  7. Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).
  8. King, V. L., Hatch, N. W., et al. A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis. Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).
  9. Taylor Weiss, D. &, R, W. Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II. Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).
  10. Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice. Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).
  11. Pynn, M., Schäfer, K., et al. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice. Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).
  12. Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  13. Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).
  14. Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice. J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).
  15. Paigen, B., Morrow, A., et al. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  16. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root. Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).
  17. Lee, T. Y., Muschal, S., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  18. Ballon, G., Chen, K., et al. Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice. J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).
  19. Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis. PLoS One. 5 (1), e8852(2010).
  20. Rotzius, P., Thams, S., et al. Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice. Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).
  21. Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).
  22. Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. Observations on localization of arterial plaques. Circ. Res. 11, 63-73 (1962).
  23. Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  24. Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).
  25. McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).
  26. Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice. Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).
  27. Kirkby, N. S., Low, L., et al. Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography. PLoS One. 6 (2), e16906(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Histologisch snijdenParaffine inbeddingHematoxyline eosin kleuringImmunohistochemische analyseKwantificering van laesiesLDLR muismodellVetrijk dieet

Gerelateerde artikelen