Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Samenvatting

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Samenvatting

De bloed-hersenbarrière (BBB) ​​bestaat uit ondoordringbare maar aanpasbare hersenen haarvaten die streng te controleren, de hersenen milieu. Niet de BBB is geïmpliceerd in de etiologie van vele hersenen pathologieën, noopt tot de ontwikkeling van humane in vitro modellen BBB helpt bij klinisch relevante onderzoek. Onder de talrijke BBB modellen dusver beschreven, een statische (zonder stroom), contact BBB model, waarbij astrocyten en de hersenen endotheelcellen (BEC) worden gekweekt samen aan weerszijden van een poreus membraan, ontwikkeld tot een vereenvoudigde, doch authentieke systeem het simuleren BBB met high throughput screening capaciteit. Toch is de generatie van dergelijk model geeft weinig technische uitdagingen. Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van een contact menselijk BBB model gebruik te maken van een nieuwe combinatie van primaire menselijke Becs en onsterfelijke, menselijke astrocyten. Concreet, we detail een innovatieve methode voor cel-zaaien op omgekeerde inserts evenals specificeren insertiet kleurtechnieken en illustreren hoe we ons model voor BBB-gerelateerd onderzoek.

Inleiding

De BBB is een gespecialiseerde interface tussen de perifere bloedsomloop en het centrale zenuwstelsel, cruciaal verantwoordelijk voor het onderhoud van hersenen hemostase. Het bestaat uit verschillende hersenen microvasculaire endotheelcellen (BEC) die functioneel worden beïnvloed door enkele cellulaire en acellulaire componenten (hieronder) om een ​​strakke en dynamische gateway in de hersenen vormen. Onder fysiologische omstandigheden de BBB beperkt de doorgang van bloedcellen, plasma componenten en schadelijke stoffen, alle potentieel neurotoxische, in de hersenen. Tegelijkertijd heeft de BBB wisselt selectief sleutel ionen en voedingsstoffen (glucose en aminozuren) en metabolische afvalproducten tussen de hersenen en de circulatie naar de hersenen milieu ^1,2 nauwkeurig te behouden. De laatste jaren is het steeds duidelijk dat de mislukking van BBB voorkomt in een verscheidenheid van chronische hersen aandoeningen zoals neurodegeneratieve en inflammatoire ziekten (Alzheimer en multiple sclerose, respectievelijk) ^3, en bij acute aandoeningen zoals ischemische beroerte ^4.

De unieke eigenschappen BBB hersenen endotheelcellen (BEC) worden grotendeels veroorzaakt door de omgeving cerebrale ^5, en met name door astrocyten ^6,7. Er is een groeiend besef dat andere celtypen, zoals pericyten ^8, neuronen en microglia ^1,3, en de basale membraan ^9, ondersteunt BEC en samen een functionele eenheid zogenaamde "neurovasculaire eenheid" (NVU) die tegelijkertijd koppels neuronale metabole eisen aan hen leveren, haarvaten ^10.

De betrokkenheid van de BBB in pathologische situaties ten grondslag talrijke pogingen om de ontwikkeling van in vitro BBB-modellen ten behoeve van BBB-gerelateerd onderzoek ^11,12. Deze modellen doel zo dicht mogelijk na te bootsen in vivo BBB kenmerken volgens het beginsel NVU. In vitro BBB-modellen over het algemeen rekenen op een monolaag van-tight-junction vormen Becs (vooral van runderen ^13, menselijk ^{14, 15} rat, muis ^16, en varkens ^17,18 afkomst), gekweekt op een poreus membraan alsmede ondersteunend astrocyten (uitgebreid beoordeeld door Deli et al.. 2005 ^11).

Astrocyten kunnen worden gekweekt in contactloze omstandigheden op de bodem van een weefselkweek goed gescheiden van BEC (gekweekt op het bovenoppervlak van het membraan) van het kweekmedium Nog communiceren met BEC via oplosbare factoren ^16. In meer geavanceerde modellen die beter te lijken de anatomische structuur van de BBB in vivo worden astrocyten in contact gehouden omstandigheden gekweekt en direct aan de andere zijde van het membraan dicht bij BEC ^13,15,17 (figuur 1). Deze configuratie maakt het mogelijk fysiek contact tussen Becs en astrocyten, opgericht als astrocyten projecthun processen door het poreuze membraan. Belangrijk, voor een echt contact te komen de poriën dient ≥ 1 urn in diameter, omdat astrocytaire end-voeten niet kan passeren kleinere poriën (dwz 0,4 micrometer) ^14,15. Met name worden contact BBB systemen aangetoond in sommige studies superieur aan hun contactloze tegenhangers over hun trans endotheliale elektrische weerstand (TEER) en endotheliale permeabiliteit van verschillende tracers ^13,17,18 te zijn. Een extra dimensie van doorstroming werd onlangs toegevoegd in een aantal in vitro BBB modellen afschuifkrachten toepassing op het endotheel nauwere simulatie van de hersenen vasculatuur ^12,19.

Een technische hindernis te overwinnen bij het genereren van een contact BBB model is het zaaien van astrocyten tegen de zwaartekracht op het abluminale oppervlak van het poreuze membraan. Eerdere protocollen ^13,20, waar astrocyten eenvoudigweg werden gezaaid in een druppel media bovenop een inomgezet insert, alleen toegestaan ​​korte zaaien tijden (dwz 10 min ¹³ of 2 uur ^20), die werden gevonden in onze handen onvoldoende voor een goede hechting van cellen te zijn. Uitgaande van deze eerste methode, een langer astrocyten bevestiging vereist constante monitoring van de inserts door frequent openen van de incubator (waardoor schommelingen in temperatuur, pH en vocht) en is ook gevoelig voor ongelijkmatige zaaien van cellen door lekkage van media door de poriën, met name indien poriën groter dan 1 micrometer in dienst zijn.

We beschrijven hier een algemeen protocol voor de bereiding van een contact BBB-model. Onze werkwijze omvat een alternatieve werkwijze voor cel-enten op omgekeerde inserts, welke de bovenvermelde beperkingen richt. De werkwijze maakt ongestoorde hechting van astrocyten op het abluminale membraanoppervlak, per evenwicht incubator voor langere tijd. Hierdoor wordt een gelijkmatige zaaien van astrocyten bereikt die barrière kwaliteit toeneemten minimaliseert basale doorlaatbaarheid verschillen tussen de inserts.

Aangezien het gebruik van menselijke cellen is belangrijk voor het menselijk-relevant onderzoek ^21, we bovendien aantonen in dit artikel het specifieke gebruik van een nieuwe combinatie van primaire menselijke Becs en onsterfelijke, menselijke astrocyten voor de oprichting van een contact menselijk BBB-model met een high throughput screening capaciteit . Sinds het bekijken van cellen op poreuze membranen kan moeilijk zijn, we ook detail kleuring technieken die kunnen helpen bij het bepalen van samenloop en cel morfologie op de poreuze membranen. Tenslotte hebben we een voorbeeld hoe onze menselijke BBB model kan worden gebruikt om het effect van weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) onderzoeken - een stolsel busting enzym dat als enige behandelingsoptie voor acute ischemische beroerte - de BBB.

Protocol

1. Cell Culture (3-7 dagen voor BBB Vergadering)

1.1. Primaire Human Brain microvasculaire endotheelcellen (Becs)

Becs werden commercieel verkregen. De cellen werden door Dispase dissociatie van normale menselijke hersenen cortex weefsel en ontvangen van doorgang 3 (<12 populatie verdubbelingen) bevroren.

1. Substratum: Jas weefselkweek schepen met "Attachment Factor" volgens de instructies van de fabrikant.
2. Onderhoudscel: Handhaaf Becs in serumbevattend compleet medium. Voor experimenten, cultuur Becs in volledige serum-vrij medium. Houd de cellen in een bevochtigde 5% _CO2, 21% _O2 incubator bij 37 ° C
   Opmerking: Als alternatief voor gespecialiseerde reagentia, 0,1% (w / v) gelatine oplossing kan dienen als een bekleding reagens tijdens DMEM/F-12 aangevuld met 15 mM HEPES, 10% (v / v) foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine, 50 ug/ Ml gentamycine, 20 ug / ml heparine en 20 pg / ml endotheelcellen groei supplement kan worden gebruikt voor BEC onderhoud.
3. Sub-kweken voor experimenten: Split confluente BEC in een verhouding van 1:03-01:06, afhankelijk van het beoogde tijd gebruiken (3-7 dagen). Verander het onderhoud medium om de 3 dagen. Gebruik Becs tot 15 passages.

1.2. SVG foetale astrogliale Cell-lijn

SVG humane foetale astroglial cellen ²² werden oorspronkelijk afkomstig van primaire, humane foetale hersenen getransformeerd met replicatie-deficiënte simianvirus 40.

1. Onderhoud: Culture SVG-cellen in minimaal essentieel medium met Earle's gebalanceerde zoutoplossing, aangevuld met 20% (v / v) FCS (zelfde serum percentage dat hun ouderlijke primaire cellen ²² te handhaven), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine. Houd de cellen in een bevochtigde 5% _CO2, 21% _O2 incubator bij 37 ° C.
2. Sub-kweken voor experimenten: Split confluente SVGs in een verhouding 1:5 tot 1:10, bij afhankelijk van de beoogde tijd gebruiken (3-7 dagen). Verwijdering van trypsine is niet vereist vanwege het hoge gehalte aan serum in het medium. Verander het medium om de 3 dagen. Gebruik SVGs tot 20 passages.

2. Montage en Coculturing van de mensenrechten in vitro BBB Model (dag 0)

Commentaar: Het menselijke in vitro contact BBB model wordt bereid volgens de gepubliceerde protocollen ^13,23, met wijzigingen.

2.1. Coating van Inserts

1. Plaats weefselkweek inserts (6,5 mm in diameter met polyester poreus membraan, 3 urn poriegrootte) in de putjes van de geleverde 24-wells plaat. Smeer het luminale oppervlak van de inserts overnacht in een bevochtigde 37 ° C incubator met rat collageen I (20 ug / cm ^2, 50 pi 132 pg/ Ml collageen I in 0,02% azijnzuur in Milli-Q water (MQH ₂ O)). Was de inserts een keer (zowel uit de abluminale en luminale zijde) met MQH ₂ O om de resterende zuur te verwijderen.
   Opmerking: basale membraan van de hersenen haarvaten bevat geen collageen I, maar vooral lamininen, collageen type IV isovormen, nidogens en heparansulfaatproteoglycanen ^9. Daarom sommige onderzoekers gebruiken bekledingsmiddelen zoals collageen IV, fibronectine ¹³ of Matrigel (BD Biosciences) ¹⁶ voor een authentieke BBB modellering.

2.2. Zaaien SVGs aan de onderzijde (abluminale) membraanoppervlak

1. Keren de insert en zachtjes passen rond de rand van het poreuze membraan een kort stuk van elastische siliconen slang ("externe slang"; ~ 10 mm lang, 8 mm inwendige diameter, 1,6 mm wand), waardoor in wezen een nieuw ruim boven de abluminale oppervlak (Figuur 2A).
2. De onderkant van het inzetstuk needs te dichten media lekkage te voorkomen. Maak eerst een plug (figuur 2A en 2B) uit een siliconenslang (zogenaamde "interne tubing"; ~ 8 mm lang, 3,2 mm inwendige diameter, 1,6 mm wand; Figuur 2B), afgedicht aan een einde met een kunststof afdichtconus (~ 3 mm lang, bereid door het snijden van de bodem van een 0,2 ml polymerasekettingreactie (PCR) buis; Figuur 2B). Deze conus sluit niet alleen de interne buis lumen, maar breidt de rand strakkere passend in het inzetstuk. Vervolgens wordt met behulp van een steriele pincet, steek de siliconen plug in de luminale holte en vooraf het tot het up-to ~ 1-2 mm van het membraan (Figuur 2A) bereikt.
3. Vervolgens zaad 4 x 10 ⁴ SVG-cellen in 200 pi SVG onderhoud medium (sectie 1.2.2 hierboven) direct in de siliconen ruim boven de abluminale membraanoppervlak (Figuur 2A). Laat SVGs te houden gedurende ten minste 4 uur in de incubator.
   Opmerking: Om de steriliteit te handhaven transporteren geassembleerd inzetstukken tussen twee 6-well platen (een plaat omgekeerd via andere, figuur 2C) blootstelling aan ongefilterde lucht tijdens de procedure te minimaliseren. Silicone buisjes en pluggen worden gewassen in ethanol en geautoclaveerd voor later gebruik.
   Opmerking: Gebruik pluggen (paragraaf 2.2.2) alleen voor wisselplaten met membraanporie maten groter dan 1 micrometer. Membranen met poriën met een diameter ≤ 1 micrometer zelden lekken en vereisen slechts de montage van de externe siliconenslangen (paragraaf 2.2.1). Bovendien hebben sommige andere dan collageen coating agents I (zie toelichting paragraaf 2.1) kunnen lekkage te voorkomen, zelfs door 3 um poriën. Bepaal deze empirisch.
4. Om de hechting staat van uw astrocyten bewaken, zaad in parallel ineen standaard 96-well een identiek volume van de astrocyten cel-suspensie. Deze goed heeft dezelfde oppervlakte als de 6,5 mm inzetstuk (0,33 ^cm2) en maakt gemakkelijker visualisatie van cellen door fase-contrast microscopie dan de insert membraan. Wanneer u voldoende hechting van de astrocyten nemen in de controlegroep 96-well, de astrocyten hebben adequaat ook gehandeld op grond van de insert membraan.
5. Wanneer astrocyten voldoende in de controlegroep 96-goed hebben gehandeld, de overdracht van de insert vergaderingen om de weefselkweek kap (zie opmerking hierboven) en verwijder voorzichtig de externe silicone slangen en stekkers. Terug inzetstukken aan de normale (dus rechtop) oriëntatie in de meegeleverde putjes die 800 ul / putje van BEC onderhoud medium (punt 1.1.2 hierboven).

2.3. Zaaien van Becs in de Luminal kamer boven de Astrocytes

Zaad 2x10 ⁴ Becs in 200 ul op de collageen gecoate luminale oppervlak en de terugkeer van de inserts in de incubator.

2.4. Coculturing

Coculture de SVG / BEC-geplaatste inserts voor 3 dagen in BEC medium zonder wisselen van materiaal voor experimenten.

3. Experimenteren met de Human BBB Model (dag 3)

1. Om de in vitro BBB eerste wasbeurt cellen te stimuleren door het vervangen van de luminale en abluminale media met 600 ul en 100 ul serumvrij medium BEC, respectievelijk.
2. Zuig het medium luminale telkens vervangen door 100 ul serumvrij medium met stimulerende middelen.
   Opmerking: als stimulatie van de abluminale kamer wordt vereist (de in vitro BBB activeren van de astrocytaire compartiment), zuig het abluminale medium en vervangen door 600 ul serumvrij medium met stimulerende middelen.
3. Test elke experimentele groep in drievoud (vandaar, indien luminaal stimulatie wordt uitgevoerd, waarvan 3 x 100 ul vereist, raden we het verdunnen van de re middelen hun eindconcentraties in 350 gl serumvrij medium per groep pipetteerfouten tussen putjes minimaliseren).
4. Voer standaard paracellulaire en / of transcellulair permeabiliteit testen van gelabelde tracers ^16,24 (de laatste we fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd albumine) en / of meting van TEER ^13,16,25 zoals eerder beschreven.

Doorlaatbaarheid (% van max) = (: Ter compensatie van schommelingen in uitgangswaarde tussen permeabiliteit experimenten, veranderingen in permeabiliteit ten opzichte van een beklede insert zonder cellen (die dient als referentie voor maximale permeabiliteit) en de met drager behandelde groep met de formule analyseren permeabiliteit waarde van experimentele insert - gemiddelde permeabiliteit waarde van het voertuig groep) / (permeabiliteit waarde van de blanco insert - gemiddelde permeabiliteit waarde van de groep voertuig) X 100.

4. Visualisatie van cellen op poreuze membranen

nt "> Reactie: ongekleurde cellen op insert membranen zijn moeilijk waar te nemen door fase-contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie, omdat het membraan is vrij ondoorzichtig en interfereert met lichttransmissie Om te gaan met dit probleem ontwikkelden we verschillende kleuringen van cellen op. inserts, die sterk verbeteren cel verschijning op het membraan. algemeen vlekken het inzetstuk membranen terwijl nog aan het inzetstuk in de putjes. De membranen mag alleen worden verwijderd aan het einde van de kleuring procedure voor montage doeleinden.

4.1. Hematoxylin kleuring

1. Bevestig inzetstukken met ijskoude 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 130 mM NaCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH _{2PO 4,} pH 7,2) gedurende 20 minuten. Was eenmaal in PBS.
2. Dompel het inzetstuk in 0,1% Mayer's hematoxyline oplossing gedurende 2 minuten.
3. Voorzichtig wassen de insert met kraanwater (door onderdompeling de insert in een bekerglas met kraanwater en de pipet voorzichtig het overtollige water uit). Breng de insert Scott's kraanwater oplossing (2 g / L _NaHCO3, 20 g / L _MgSO4) voor ~ 20 seconden totdat de gewenste blauwe kleur ontstaat. Was het inzetstuk opnieuw met kraanwater (paragraaf 4.1.3). Een optionele eosinekleuring kan hier worden ingevoerd door dompelen van de insert in 1% eosine-oplossing gedurende 10 seconden gevolgd door een kraan water wassen.
4. Lucht-drogen de insert membraan. Met behulp van een scalpel (snijden rond het membraan rand) verwijder het membraan en monteer het op een glasplaatje voor bright-field imaging
   Opmerking: Als di-N-butylphthalateinxylene (DPX) fixeermiddel wordt gebruikt was het inzetstuk 100% ethanol gevolgd door xyleen alvorens en monteren membraan.

4.2. Scanning Electron Microscope (SEM)

1. Bevestig inzetstukken met ijskoude 4% (gew / vol) PFA in PBS gedurende 20 minuten. Was drie keer in PBS.
2. Post-fix de membranen gedurende 30 min in 1% (w / v) Osmiumtetroxide in MQH ₂ O.
3. Was inserts in water (paragraaf 4.1.3) en dehydrateren in een escalerende ethanol gradiënt (50%, 70%, 90% gedurende 5 min elk, vervolgens 3x met 100% ethanol gedurende 10 min per interval).
4. Behandel gedehydrateerd inzetstukken met een mengsel van hexamethyldisilazaan (HMDS): ethanol (01:02 daarna 02:01 gedurende 5 min).
5. Behandel inzetstukken 100% HMDS gedurende 5 min, drogen en opslag onder gedroogde omstandigheden.
6. Verwijder het membraan met behulp van een scalpel (snijden in het membraan rand). Onderzoek membranen door scanning elektronenmicroscopie.

4.3. Immunofluorescentie

1. Bevestig inzetstukken met ijskoude 4% (gew / vol) PFA in PBS gedurende 20 minuten, eenmaal wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 urn gefiltreerd).
2. Voer immunokleuring van de cellen in het insert membraan zoals eerder beschreven ^26.
3. Verwijder het membraan met behulp van een scalpel (snijden rond het membraan rand) en plak hem op aglass dia met fluorescentie montage medium. Onderzoek membraan door fluorescentie microscopie.

Resultaten

Om menselijk contact BBB model moesten we SVGs en BEC op poreuze membranen cultiveren met een 3 micrometer poriegrootte, aangetoond passage van astrocyten end-voeten mogelijk voor contact met endotheelcellen ^14,15,27,28 stellen. Een schematische weergave van de volledige contactmodel wordt geïllustreerd in figuur 1 (linker afbeelding). De belangrijkste technische uitdaging van een contactsysteem is de noodzaak om astrocyten zaad tegen de zwaartekracht op het abluminale oppervlak van het membr...

Discussie

Medisch onderzoek naar hersenen pathologieën lijdt veel translationeel moeite. Op het gebied van acute ischemische beroerte, bijvoorbeeld veel geneesmiddelen die grote belofte in diermodellen bleek niet in de kliniek ^38,39. De redenen voor deze teleurstellende resultaten zijn divers en omvatten ontrouw van de preklinische testsystemen om de menselijke beroerte scenario en overwaardering van de resultaten verkregen uit dierproeven ^21. Een strategie om de voorspellende waarde van preklinische bevindi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Attachment Factor	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Complete medium	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Supplemented with CSC JetFuel
Complete serum-free medium	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Supplemented with CSC RocketFuel
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
External silicone tubing	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil merk, 8 mm interne diameter, 1,6 mm wand
Foetal calf serum	Lonza	14-501F
Gentamycin sulfate	Life Technologies	15750-060
Heparin sodium	Pfizer		1.000 U/ml
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Human brain microvascular endothelial cells	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Internal silicone tubing	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil merk, 3,2 mm interne diameter, 1,6 mm wand
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Mayer’s hematoxylin solution	Amber Scientific	MH
Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Rat collagen I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex merk
Tissue culture inserts	Corning Life Sciences	3472	Transwell merk, 6,5 mm in diameter, met polyester poreuze membraan, 3 µm poriëngrootte