High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Mazen Amatoury; Vera Merheb; Jessica Langer; Xin Maggie Wang; Russell Clive Dale; Fabienne Brilot

doi:10.3791/50935

Methodenartikel

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

DOI:

10.3791/50935

⸱

23 november 2013

Mazen Amatoury¹ , Vera Merheb¹ , Jessica Langer¹ , Xin Maggie Wang² , Russell Clive Dale¹ , Fabienne Brilot¹

¹Institute for Neuroscience and Muscle Research, The Kids Research Institute at the Children's Hospital at Westmead, The University of Sydney, ²Flow Cytometry Centre, Westmead Millennium Institute for Medical Research

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afgelopen jaren hebben antilichamen tegen oppervlak en conformationele proteïnen betrokken bij neurotransmissie waargenomen bij auto CNS aandoeningen bij kinderen en volwassenen. Deze antilichamen zijn gebruikt om te leiden diagnose en behandeling. Cel-gebaseerde testen hebben de detectie van antilichamen in het serum patiënt verbeterd. Ze zijn gebaseerd op de oppervlakte expressie van hersenantigenen op eukaryotische cellen, die vervolgens geïncubeerd met verdunde sera gevolgd door fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen. Na wassen wordt voortgezet antilichaambinding vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Onze groep heeft een high-throughput flowcytometrie levende cellen gebaseerde test ontwikkeld om betrouwbaar te detecteren antilichamen tegen specifieke neurotransmitter receptoren. Deze stroom cytometrie methode is eenvoudig, kwantitatief, efficiënt en het gebruik van een high-throughput sampler systeem maakt grote patientencohorten gemakkelijk worden getest in een korte tijd. Bovendien, deze cel-gebaseerde alszegt kan gemakkelijk worden aangepast aan antilichamen vele verschillende antigene doelen, zowel het centrale zenuwstelsel en de periferie. Het ontdekken van extra nieuwe afweerstoffen zal een snelle en nauwkeurige diagnose mogelijk te maken en het verbeteren van de behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren hebben auto-vormen van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten geïdentificeerd. Aangetoond is dat deze ziekten geassocieerd zijn gedefinieerd door de aanwezigheid van autoantilichamen. Deze antilichamen binden aan receptoren neuronale en synaptische proteïnen betrokken bij neurotransmissie ^1,2. Verschillende antigenen werden gedetecteerd, zoals N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDAR) ^3-5, γ-aminoboterzuur B receptor (GABA _B) receptor ^6, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptor ^7, voltage-gated kalium kanaal (VGKC) geassocieerde eiwitten: leucine-rich-glioom geactiv....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Subkloning strategie om Construct pIRES2-EGFP vector Encoding D2R of NMDAR

Verkrijgen volle lengte cDNA kloon van humaan D2R of NMDAR subunit 1 (NR1).
Kies een expressievector, zoals pIRES2-EGFP, die geschikt is voor expressie van transmembraan eiwitten met een versterkt groen fluorescent eiwit (GFP) reporter onder controle van een interne ribosoom toegangsplaats (IRES), zodat beide antigenen en GFP te coexpressed in cellen afzonderlijk.
Subkloon humane cDNA in pIRES2-EGFP vector.
1. Om cDNA subkloneren, gebruik dan geschikte restrictie-enzymen (bijvoorbeeld Nhel en Xhol voor menselijke D2R cDNA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wonen HEK293 ^{D2R +} en HEK293 ^CTL-cellen werden verkregen bij de flowcytometer behulp van een high-throughput sampler. Tijdens de analyse werden de cellen gated gebaseerd op voorwaartse verstrooiing (grootte) en zijwaartse verstrooiing (granulariteit) parameters (figuren 1A en 1D). Getransfecteerde HEK293 cellen brachten het reportermolecuul, GFP in het cytoplasma en niet-getransfecteerde cellen werden uitgesloten van de analyse (figuren 1B en

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit document beschrijft een nieuwe toepassing van flowcytometrie levende cellen gebaseerde test om antilichamen gericht op specifieke celoppervlak neuronale eiwitten met behulp van een high-throughput sampler detecteren. Met behulp van deze techniek, we melden dat een subgroep van patiënten die lijden met auto CNS ziekten hebben serum antilichamen tegen NMDAR oppervlak of aan de oppervlakte D2R.

Essentiële stappen voor optimale detectie-antilichaam met deze high-throughput doorstroomcytometr.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belangenconflict: Een octrooi is ingediend door FB en RCD (Universiteit van Sydney) claimen D2R als doelwit voor auto-antilichamen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Australische National Health en Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australië), Gilles de la Tourette syndroom Association (USA), De Trish Multiple Sclerose Research Foundation en Multiple Sclerose Research Australië, Petre Foundation (Australië), de Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australië). Wij danken alle patiënten en familieleden die monsters voor onze studie verstrekt.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift van Prof A. Vincent (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine en 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetaal bovien serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicine	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140-122
Geneticine	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca²⁺/-Mg²⁺)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) met Fenol Rood	Invitrogen	12605-028
0.9% Natriumchloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963

Naam van apparatuur/software	Bedrijf	Catalogusnummer	Model/Versie
Flow cytometer met high-throughput sampler systeem	BD Biosciences		BDLSRII met HTS
Omgekeerd microscoop	Olympus		CKX41 (met kwiklamp en U-RFLT50 voeding)
Elektronische multikanaalspipet (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-kanaals Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropyleen conische buizen	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Weefselkweekkolf (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bodem 96-well plate	Corning	651180

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS:....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antilichaemsdetectie High throughput Sampler HEK 293 cellen GFP reporter gemiddelde fluorescentie intensiteit secundair antilichaam

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen