High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Samenvatting

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

Samenvatting

De afgelopen jaren hebben antilichamen tegen oppervlak en conformationele proteïnen betrokken bij neurotransmissie waargenomen bij auto CNS aandoeningen bij kinderen en volwassenen. Deze antilichamen zijn gebruikt om te leiden diagnose en behandeling. Cel-gebaseerde testen hebben de detectie van antilichamen in het serum patiënt verbeterd. Ze zijn gebaseerd op de oppervlakte expressie van hersenantigenen op eukaryotische cellen, die vervolgens geïncubeerd met verdunde sera gevolgd door fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen. Na wassen wordt voortgezet antilichaambinding vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Onze groep heeft een high-throughput flowcytometrie levende cellen gebaseerde test ontwikkeld om betrouwbaar te detecteren antilichamen tegen specifieke neurotransmitter receptoren. Deze stroom cytometrie methode is eenvoudig, kwantitatief, efficiënt en het gebruik van een high-throughput sampler systeem maakt grote patientencohorten gemakkelijk worden getest in een korte tijd. Bovendien, deze cel-gebaseerde alszegt kan gemakkelijk worden aangepast aan antilichamen vele verschillende antigene doelen, zowel het centrale zenuwstelsel en de periferie. Het ontdekken van extra nieuwe afweerstoffen zal een snelle en nauwkeurige diagnose mogelijk te maken en het verbeteren van de behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

Inleiding

In de afgelopen jaren hebben auto-vormen van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten geïdentificeerd. Aangetoond is dat deze ziekten geassocieerd zijn gedefinieerd door de aanwezigheid van autoantilichamen. Deze antilichamen binden aan receptoren neuronale en synaptische proteïnen betrokken bij neurotransmissie ^1,2. Verschillende antigenen werden gedetecteerd, zoals N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDAR) ^3-5, γ-aminoboterzuur B receptor (GABA _B) receptor ^6, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptor ^7, voltage-gated kalium kanaal (VGKC) geassocieerde eiwitten: leucine-rich-glioom geactiveerd 1 eiwit (LGL-1) en-contactine geassocieerd proteïne 2 (capsr2) ^8,9, glutamaat receptor ^5,10 en dopamine-2-receptor (D2R) ^11. In het verleden zijn deze auto in het centraal zenuwstelsel (vooral genoemd encefalitis) waren vaak niet gediagnosticeerd en onbehandeld. Deze nieuwe afweerstoffen, bijv.NMDAR antilichaam of D2R antilichaam, zijn aanzienlijk verbeterd diagnose en bewustzijn, en hebben behandelingsopties voor patiënten geopend. Inderdaad, is vroege behandeling met immuuntherapie geassocieerd met een verbeterde uitkomst ^11,12.

Traditionele methoden om antilichamen, zoals enzym-gebonden immunosorbent assay (ELISA) en Western blot detectie zijn gebruikt voor de detectie van antilichamen in sera. Echter, ze niet gemakkelijk in staat de erkenning van extracellulaire of oppervlakte-epitopen en, in plaats daarvan kan immunoreactiviteit naar een intracellulaire epitoop onthullen. Bovendien antilichamen die binden aan het extracellulaire domein van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij neurotransmissie waarschijnlijk pathogeen ^2,3,7,13,14 zijn. Daarom is de ontwikkeling van nauwkeurige en gevoelige assays om relevante celoppervlak of extracellulaire targets voor antilichamen bij patiënten ontdekken staat voorop. De gouden standaard methode het gebied is gebaseerd op het gebruik van levende cellen in de zogenaamde "cel-based assays ". Deze werkwijze omvat de expressie van een antigeen op het oppervlak van zoogdiercellen (meest humane embryonische nier 293 (HEK293) cellen) in zijn natieve vorm door transfectie van vectoren die de volledige cDNA-sequentie van het antigeen van belang. Nonpermeabilized levende cellen worden vervolgens geïncubeerd met verdund patiënt serum en vervolgens fluorochroom-geconjugeerde anti-humaan immunoglobuline (Ig) secundair antilichaam. De intensiteit of het niveau van fluorescentie wordt vervolgens gedetecteerd en is gekoppeld aan het niveau van auto-antilichaam binding. Deze techniek is specifiek, aangezien slechts een antigeen tot overexpressie wordt gebracht in cellen. De meest gebruikte "read-out" heeft confocale microscopie analyse geweest na immunocytochemie ^4,5,8-10. Echter, flowcytometrie celgebaseerde proeven zijn met succes gebruikt om antilichamen te detecteren bij patiënten met demyelineringsziekten ^15-17. Vooral Waters et al.. ¹⁵ vergeleek de opsporing van antilichamen met een panel antilichaam detectietechnieken zoals celgebaseerde proeven gevolgd door microscopie of flowcytometrie geanalyseerd en blijkt flowcytometrie celgebaseerde analyse de meest gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare methode. Daarom flowcytometrie celgebaseerde analyse is voordelig omdat het kwantitatief, niet onderzoeker afhankelijk, en het gebruik van radioactieve stoffen geen sprake. Het is ook handig omdat hiermee grote patientencohorten worden getest in een korte tijd.

Meer recent hebben wij een high-throughput doorstroomcytometrie celgebaseerde assay NMDAR antilichaam en D2R opsporing van antilichamen bij patiënten met auto centrale zenuwstelsel ¹¹ geoptimaliseerd. Heeft onze groep recent ontdekt NMDAR antilichaam in sera van patiënten met behulp van flowcytometrie-cel-gebaseerde test. Deze NMDAR antilichaam-positieve sera waren eerder geanalyseerd met confocale microscopie en bleken ook positief te zijn ^11. Dit protocol beschrijft een doorstroomcytometrie-cellen gebaseerde assay voor de detectie van conformation-gevoelige CNS antilichaam in serum van de patiënt met behulp van een geautomatiseerde high-throughput sampler.

Protocol

1. Subkloning strategie om Construct pIRES2-EGFP vector Encoding D2R of NMDAR

1. Verkrijgen volle lengte cDNA kloon van humaan D2R of NMDAR subunit 1 (NR1).
2. Kies een expressievector, zoals pIRES2-EGFP, die geschikt is voor expressie van transmembraan eiwitten met een versterkt groen fluorescent eiwit (GFP) reporter onder controle van een interne ribosoom toegangsplaats (IRES), zodat beide antigenen en GFP te coexpressed in cellen afzonderlijk.
3. Subkloon humane cDNA in pIRES2-EGFP vector.
   1. Om cDNA subkloneren, gebruik dan geschikte restrictie-enzymen (bijvoorbeeld Nhel en Xhol voor menselijke D2R cDNA).
   2. Ligeer cut cDNA te voegen binnen de beperkte pIRES2-EGFP vector.
   3. Sequentie geligeerd pIRES2-EGFP D2R of NMDAR vector te controleren of de vector bevat de juiste volgorde.
   4. Zuiveren en versterken pIRES2-EGFP D2R of NMDAR vector voor later gebruik in transfectie.

TITEL "> 2. HEK293 celtransfectie voor Expressie van Neuronale Antigen

1. Cultuur HEK293 cellen in weefselkweek kolven met verse Dulbecco's Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) compleet met 4,5 g / L D-glucose, L-glutamine en 110 mg / l natriumpyruvaat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM GlutaMAX en 50 ug / ml Gentamicine.
2. Los HEK293 cellen met behulp van trypsine en overbrengen in een conische buis.
   1. Was cellen door centrifugeren bij 250 g gedurende 6 minuten en resuspendeer de celpellet in vers compleet DMEM.
3. Tel de cellen en zaden 6 putjes op ongeveer 8 x 10 ⁵ cellen / putje en cultuur overnacht in 2 ml DMEM bij 37 ° C en 5% _CO2 in een incubator.
4. Zodra ze ongeveer 70% confluentie bereikt, transfecteren de HEK293 cellen met pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^{NMDAR +} cellen), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} cellen) en pIRES2-EGFP (HEK293 ^CTL cellen; vectorbesturing) als volgt.Houd enkele ongetransfecteerde HEK293 cellen tot schadevergoeding later.
   1. Bereid het vereiste volume transfectiemengsel omvattende 2,5 ug DNA, 200 gl 0,9% natriumchloride en 4 ug / ml polyethyleenimine / putje (elk 2 ml vers compleet DMEM).
   2. Onmiddellijk geschud mix voor 10 seconden en geïncubeerd bij kamertemperatuur (KT) gedurende 10 minuten, voor het toevoegen volume transfectiemengsel aan de geschikte putjes.
   3. Bedek de plaat, wikkel de zijkanten met Parafilm, en centrifugeer bij 280 xg gedurende 5 minuten tot celtransfectie helpen.
   4. Verwijder de Parafilm en plaats in de incubator om de cultuur bij 37 ° C.
   5. Vervang voedingsbodems 18 uur later met verse volledige DMEM, en in cultuur te behouden voor een ander 72 uur.
   6. Optioneel: 72 uur na transfectie, kan getransfecteerde cellen door kweek worden geselecteerd compleet DMEM gesupplementeerd met 250 ug / ml Geneticine, teneinde een polyklonaal stabiele transfectant verkrijgen.

3. Flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor de opsporing van RNA van Surface neuronale antigenen

1. Maak HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +} en HEK293 ^CTL-cellen door incubatie met 500 ul / putje Versene gedurende ongeveer 5 minuten bij 37 ° C.
   1. Resuspendeer in 2ml/well PBS (-Ca ^{2 +} /-Mg ^{2 +)} aangevuld met 2% FBS (PBS / FBS) en overbrengen in een 15 ml of 50 ml conische buis.
   2. Was de cellen door centrifugeren bij 250 g gedurende 6 minuten en resuspendeer de celpellet in 15-50 ml PBS / FBS. Herhaal wassen 2x.
   3. Tel de cellen en resuspendeer in PBS / FBS 1 x 10 ⁶ cellen / ml.
2. Ontwerp van de 96-well template voor flowcytometrie verkrijgen, aangezien HEK293 ^{D2R +} en HEK293 ^{NMDAR +} cellen, evenals ^CTL HEK293 cellen moeten worden geïncubeerd met elke patiënt monster of primaire antilichaam.
3. Zaadcellen in een V-bodem 96-well plaat bij 50.000 cellen / weII volgens de flowcytometrie acquisitie sjabloon.
4. Pellet de cellen door centrifugeren van het 96-well plaat bij 450 xg gedurende 5 minuten en verwijder voorzichtig de supernatant met behulp van elektronische of handmatige multichannel pipet, kantelen van de plaat op een hoek en verzorgen de celpellet niet te zuigen.
5. Incubeer HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +} en HEK293 ^CTL cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker met:
   1. Seriële verdunningen van het primaire antilichaam om antigeen oppervlakte-expressie beoordelen.
   2. Patiëntmonsters om antilichamen te detecteren.
6. Gebruik de juiste flowcytometrie compensatie controles, bijvoorbeeld. ongekleurde getransfecteerde HEK293 cellen, GFP ⁺ HEK293 cellen (AF647 ^-) en getransfecteerde AF647 ⁺ HEK293 cellen (GFP).
7. Was de cellen door centrifugeren bij 450 g gedurende 5 minuten en resuspendeer de celpellet in 170 ul PBS / FBS. Herhaal wasstap twee keer.
8. Incubeer cellen gedurende 1 uurr bij kamertemperatuur in het donker met 1:100 verdunning van AF647-geconjugeerd secundair antilichaam (anti-humaan IgG patiënt serum en anti-muis IgG voor anti-NR1 of anti-D2R primaire antilichamen).
9. Was de cellen drie keer, zoals in stap 3.7 en resuspendeer in 35 ul PBS / FBS voor flowcytometrie cel acquisitie.
10. Stel de high-throughput sampler (HTS) op de flowcytometer (BDLSRII).
11. Verwerven 10.000 evenementen / goed volgens de flowcytometrie overname sjabloon.
12. Export en vervolgens analyseren van gegevens voor analyse met behulp van een flowcytometrie softwarepakket, zoals FlowJo v7.5:
    1. Ten eerste, de poort van de live-HEK293 cellen op basis van forward (grootte) en zijkant (granulariteit) verstrooit.
    2. Verder poort levende HEK293 cellen op basis van hoge GFP-positiviteit alleen de getransfecteerde cellen te analyseren.
    3. Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de AF647 kanaal binnen de live GFP-positieve cellen.
    4. Gegevens exporteren naar Excel of Prism voor analyse:
       1. Perceel concentrations primaire antilichaam (anti-NMDAR of anti-D2R antilichaam) ten opzichte van de MFI verkregen uit de cellen geïncubeerd met deze antilichamen.
       2. Voor elke patiënt en controle monster bepalen ΔMFI door van de MFI van de ^CTL HEK293 cellen van de MFI van de HEK293 ^{D2R +} en HEK293 ^{NMDAR +} cellen.
       3. Bereken de drempel van antilichaam positiviteit door toevoeging van drie standaardafwijkingen boven de gemiddelde ΔMFI van de controle cohort.
       4. Plot individuele monsters gegroepeerd volgens hun serum tekst op een grafiek en vertegenwoordigen de drempel als een lijn.

Resultaten

Wonen HEK293 ^{D2R +} en HEK293 ^CTL-cellen werden verkregen bij de flowcytometer behulp van een high-throughput sampler. Tijdens de analyse werden de cellen gated gebaseerd op voorwaartse verstrooiing (grootte) en zijwaartse verstrooiing (granulariteit) parameters (figuren 1A en 1D). Getransfecteerde HEK293 cellen brachten het reportermolecuul, GFP in het cytoplasma en niet-getransfecteerde cellen werden uitgesloten van de analyse (figuren 1B en

Discussie

Dit document beschrijft een nieuwe toepassing van flowcytometrie levende cellen gebaseerde test om antilichamen gericht op specifieke celoppervlak neuronale eiwitten met behulp van een high-throughput sampler detecteren. Met behulp van deze techniek, we melden dat een subgroep van patiënten die lijden met auto CNS ziekten hebben serum antilichamen tegen NMDAR oppervlak of aan de oppervlakte D2R.

Essentiële stappen voor optimale detectie-antilichaam met deze high-throughput doorstroomcytometr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift van Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine en 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetaal bovien serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicine	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicilline-streptomycine	Invitrogen	15140-122
Geneticine	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) met Fenol Rood	Invitrogen	12605-028
0.9% Natriumchloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Naam van apparatuur/software	Bedrijf	Catalogusnummer	Model/Versie
Flow cytometer met high-throughput sampler systeem	BD Biosciences		BDLSRII met HTS
Omgekeerd microscoop	Olympus		CKX41 (met kwiklamp en U-RFLT50 voeding)
Elektronische multikanaalspipet (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-kanaals Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropyleen conische buizen	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Weefselkweekkolf (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bodem 96-well plate	Corning	651180