Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

Summary

Dit document beschrijft de vorming van sterk geordende peptide-gebaseerde structuren door het spontane proces van zelfassemblage. De werkwijze maakt gebruik van commercieel verkrijgbare peptiden en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Deze techniek kan worden toegepast op een grote verscheidenheid aan peptiden en kan leiden tot de ontdekking van nieuwe peptiden gebaseerde samenstellingen.

Abstract

In de natuur worden complexe functionele structuren gevormd door de zelf-assemblage van biomoleculen onder milde omstandigheden. Inzicht in de krachten die zelf-assemblage te controleren en na te bootsen dit proces in vitro zal aanzienlijke vooruitgang op het gebied van de materiaalkunde en nanotechnologie. Onder de beschikbare biologische bouwstenen, peptiden hebben verschillende voordelen omdat zij aanzienlijke diversiteit presenteren hun synthese op grote schaal is eenvoudig, en ze kunnen gemakkelijk worden gemodificeerd met biologische en chemische entiteiten ^1,2. Verschillende klassen ontworpen peptiden zoals cyclische peptiden, amfifiel peptides en peptide-conjugaten zichzelf assembleren tot geordende structuren in oplossing. Homoaromatic dipeptiden, zijn een klasse van korte zelf-geassembleerde peptiden die alle moleculaire informatie om geordende structuren zoals nanotubes, bollen en fibrillen ^3-8 vormen bevatten. Een grote verscheidenheid van deze peptiden is in de handel verkrijgbaar. 9 De gepresenteerde protocol kan mogelijk worden aangepast aan andere klassen van peptiden of biologische bouwstenen en kan leiden tot de ontdekking van nieuwe peptide gebaseerde structuren en betere controle van de assemblage.

Introduction

Natuur vormen besteld en functionele structuren door het proces van biomoleculaire zelfassemblage. Inzicht in de krachten die dit spontaan proces regeren kan leiden tot de mogelijkheid om zelf-assemblage in vitro na te bootsen en daarmee tot grote vooruitgang op het gebied van materiaalkunde ^10,11. Peptiden specifiek, zijn veelbelovend als een biomoleculaire bouwsteen, daar er grote structurele diversiteit, gemak van chemische synthese, en kan gemakkelijk worden gefunctionaliseerd met biologische en chemische entiteiten. Het gebied van peptide zelfassemblage is ontwikkeld door Ghadiri en zijn collega's, die de zelf-assemblage van peptide nanobuisjes aangetoond door cyclische peptiden met afwisselend D-en L-aminozuren ^12. Andere succesvolle benaderingen voor het ontwerpen van peptide samenstellingen omvatten lineaire bolaamphiphile peptiden ^5, amfifielen (AP) ^6, ongeconjugeerd zelf-complementaire peptiden ionische ¹³ oppervlakte-achtige peptiden ^{4,14 en diblok copolypeptides 15.}

Een meer recente benadering omvat de zelf-assemblage van korte aromatische peptiden, genoemd homoaromatic dipeptiden. Deze peptiden omvatten slechts twee aminozuren met aromatische aard (Phe-Phe, tert-butyldicarbonaat (Boc)-Phe-Phe) ^7,8,16-21. De structuren gevormd door deze homoaromatic peptiden omvatten buisvormige structuren, bollen, blad-achtige samenstellingen en vezels ^{6,8,15,21-32.} De vezels in sommige gevallen een fibril een mesh die een hydrogel ^33-37 oplevert. Deze vergaderingen zijn uitgebuit voor toepassingen van biosensoren, drug delivery, moleculaire elektronica, enz. ^38-45

Dit document beschrijft de experimentele stappen die nodig zijn om de spontane zelf-assemblage van homoaromatic peptiden beginnen. Bovendien geeft het proces van peptide coassembly. Dit proces omvat de zelf-assemblage van meer dan een type peptidemonomeer.

Onze demonstratie omvat de coassembly twee commercieel verkrijgbare peptiden: het peptide difenylalanine _{(NH2-Phe-Phe-COOH)} en de Boc beschermde analoog (Boc-Phe-Phe-OH). Elk van de peptiden zelf-assembleert een supermoleculaire structuur: de difenylalanine peptide vormen buisvormige samenstellen en Boc-Phe-Phe-OH peptide zelf-assembleert in hetzij bolletjes of vezels afhankelijk van het oplosmiddel ^7,17,46. We gemengd beide peptiden in bepaalde verhoudingen en gekarakteriseerd de resulterende samenstellingen van elektronenmicroscopie, kracht microscopie en FT-IR spectroscopie. De werkwijzen toonden de vorming van een peptide-gebaseerde structuur die bestaat uit sferische elementen met een diameter van enkele microns (1-4 um) die zijn verbonden door langwerpige constructies met een diameter van enkele honderden nanometer (~ 300-800 nm) . De configuraties lijken kralen strings in hun morfologie, de bolvormige structuren lijken schroefdraad op delangwerpige assemblages. Daarom noemde deze samenstellingen "biomoleculaire kettingen". De "biomoleculaire kettingen" zou kunnen dienen als een nieuw biomateriaal, als een drug delivery agent of als een steiger voor elektronische toepassingen. Voorts kan de procedure die leidt tot de zelf-assemblage van peptiden worden gebruikt met andere klassen van peptiden en biomoleculen. Het kan leiden tot een beter begrip van de bij zelf-assemblage en de vorming van nieuwe geordende structuren krachten.

Protocol

1. Zelf-assemblage van Homoaromatic Dipeptiden

1. Weeg het gewenste peptide in de gelyofiliseerde vorm (bijvoorbeeld _{NH2-Phe-Phe-OH,} Boc-Phe-Phe-COOH) en een voorraadoplossing bereid door oplossen van het peptide in 1,1,1,3,3,3-hexafluor -2-propanol (HFP) tot de geschikte concentratie (bijv. 100 mg / ml voor _{NH2-Phe-Phe-OH} en Boc-Phe-Phe-COOH) ^7,17,46.
2. Meng de oplossing om met vortex en plaats op de bank totdat het peptide volledig is opgelost en de oplossing lijkt duidelijk (een paar minuten).
3. Verdun het peptide voorraadoplossing met een geschikt oplosmiddel om de geschikte concentratie (bijv. 2 mg / ml _{NH2-Phe-Phe-OH} triple gedestilleerd water (tdw) voor de vorming van nanobuisjes door toevoeging van 2 ul van het peptide stockoplossing aan 98 gl TDW, 5 mg / ml van Boc-Phe-Phe-COOH in ethanol voor de vorming van bolvormige structuren).
4. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 24hr.
5. Om eventuele preaggregation voorkomen, bereiden verse voorraad oplossingen voor elk experiment.

2. Coassembly of Two Homoaromatic Dipeptiden

1. Bereid een oplossing van 50% ethanol door gelijke volumes van TDW en absolute ethanol. Gebruik vortex om de twee oplossingen te mengen.
2. Weeg 2 mg van het _{NH2-Phe-Phe-OH} peptide en 1 mg van het Boc-Phe-Phe-OH peptide. Los elk peptide in HFP tot een concentratie van 100 mg / ml.
3. Meng de peptiden voorraad oplossingen met behulp van vortex en leg ze op de bank tot de peptiden volledig zijn opgelost en de oplossingen lijken duidelijk.
4. Meng de peptiden voorraad oplossingen om de gewenste verhouding. In dit specifieke experiment mengen 10 ul van de _{NH2-Phe-Phe-OH} peptide met 6 pi van de Boc-Phe-Phe-OH peptide (tot een uiteindelijke verhouding van respectievelijk 05:03). Vanwege de hoge volatiliteit van de HFP oplosmiddel, is het raadzaam om een ​​grote hoeveelheid van deze voorraad oplossing te bereiden (op least 10 pi).
5. Gebruik vortex aan de gemengde peptiden voorraad oplossing te mengen.
6. Verdun de gemengde peptiden voorraadoplossing met 50% ethanol om de gewenste eindconcentratie. In dit specifieke experiment om een eindconcentratie van 5 mg / ml te verkrijgen voor _{NH2-Phe-Phe-OH} en 3 mg / ml voor Boc-Phe-Phe-OH, voeg 8 pi van de gemengde peptiden voorraadoplossing 92 pl van de 50% ethanoloplossing. Gebruik een pipet om voorzichtig de oplossing te mengen.
7. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
8. Opgemerkt wordt dat vanwege de zeer volatiele aard van het oplosmiddel, de experimenten zijn gevoelig voor kleine veranderingen in de concentratie van de peptiden. Daarom moet verse voorraad oplossingen worden voorbereid voor elk experiment.

3. Karakterisering van de Zelf-geassembleerde structuren met behulp van Scanning Electron Microscopy (SEM)

1. Na 24 uur incubatie, breng dan een 10 ul druppel van de peptiden oplossing op een glazen baair slip en droog bij kamertemperatuur.
2. Coat het monster op het glas met een laagje goud (enkele nanometers) met een sputter coater voor 90 sec.
3. Afbeelding de samenstellen met behulp van SEM werkt bij 10-20 kV.

4. Karakterisering van de Zelf-geassembleerde structuren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

1. Plaats een 10 ul druppel van de peptiden oplossing op een 200-mesh koperen rooster bedekt met koolstof en gestabiliseerd door een polymeerfilm ondersteuning.
2. Na 1 min verwijdert het overtollige vocht met behulp van filtreerpapier.
3. Bereid een oplossing van 2% uranylacetaat in TDW. Filter de oplossing met behulp van 0,22 urn filter.
4. Om het monster (negatieve kleuring) vlek, een druppel van 10 pl uranylacetaat oplossing op de grid.
5. Na 30 sec verwijderen overtollige vloeistof met behulp van filtreerpapier. Opgemerkt zij dat hoewel negatieve kleuring verbetert het contrast van de beelden, is niet in alle gevallen essentieel.
6. Het imago van de steekproef op the raster door TEM werkzaam bij 120 kV.

5. Drie-dimensionale karakterisatie van de Assemblies van Atomic Force Microscopy (AFM)

1. Bereid een monster voor de AFM-analyse met behulp van de in paragraaf 3.1 beschreven procedure.
2. Analyseer het monster op het glas met behulp van een AFM instrument werken in de AC modus. Gebruik silicium uitkragingen met een veerconstante van 3 N / m en een resonantiefrequentie van 75 kHz.
3. Begin met het scannen van een groot gebied van het raster, om de gewenste structuur te vinden. Dan richten op een specifiek kleiner gebied en scan (de grootte van de scan was 2,5 micrometer x 2,5 micrometer voor het beeld in dit manuscript).

6. Karakterisering van de secundaire structuur van FT-IR

1. Breng een 30 ul druppel van de oplossing peptiden een _{CaF2-venster.}
2. Laat de oplossing drogen bij kamertemperatuur.
3. De adsorptie van water in het IR-spectrum bij 1650 cm ^-1.Deze piek is in het centrum van de amide I band van de peptidebinding. Het is ook een typische piek voor α-helix structuren van peptiden en proteïnen ^47. Om dit probleem op te lossen en te voorkomen dat het signaal van water, moet een waterstof-tot-deuterium uitwisseling worden uitgevoerd. Breng een druppel deuteriumoxide _(D2O) op de gedroogde peptide monster. De daling moet groot genoeg zijn om volledig te bedekken de peptide storting op het raam zijn.
4. Laat het monster te drogen onder vacuüm.
5. Herhaal de stappen 6.3 en 6.4 2x tot maximale waterstof naar deuterium uitwisseling te waarborgen. Sla het monster onder vacuüm tot haar analyse.
6. Noteer de FT-IR spectra met behulp van een gedeuteriseerde triglycerinesulfaat (DTGS) detector. De FT-IR systeem een ​​spoelgas generator, om vochtigheid in de omgeving van het monster te voorkomen. Voor monsters van korte peptiden, is het het beste om het monster te scannen 2000 x op een resolutie van 4 cm ^-1. De transmissie minimale waarden kunnen worden vastgesteld via deftware geleverd met het instrument.

Results

Dit document beschrijft een werkwijze voor de vorming van geordende structuren op nano-en microscopische schaal van de zelf-assemblage van peptiden. Om dit eenvoudige proces presenteren we aantonen karakteriseren coassembly twee eenvoudige aromatische peptiden (figuur 1). Een van de peptiden is het _{NH2-Phe-Phe-OH} (difenylalanine) peptide, die zelf-assembleren in een waterige oplossing in holle buisvormige structuren met nanometrische afmetingen ^7. De andere peptide is de Boc besche...

Discussion

Kortom, dit document toont het gemak waarmee peptide-gebaseerde samenstellingen in vitro kunnen worden gevormd. Het proces omvat de handel verkrijgbare peptiden en oplosmiddelen, en spontaan onder omgevingsomstandigheden, na de toevoeging van een polair oplosmiddel aan de reageerbuis. Het is cruciaal om HFP als oplosmiddel van de peptiden, vanwege de lage oplosbaarheid van de peptiden in andere organische oplosmiddelen. Bovendien, vanwege de hoge vluchtigheid van HFP moet vers voorraadoplossing voor elk experim...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NH2-Phe-Phe-OH	Bachem	G-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OH	Bachem	A-3205.0005
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	52512-100ML
Ethanol absoluut (Gedehydrateerd) AR sterieel	Bio-Lab Ltd.	52555	Blenden met TDW voor de bereiding van 50% oplossing
Uranylacetaat	Sigma-Aldrich	73943	Voor negatieve kleuring. Het is mogelijk om zonder te werken.
Glasdeksel	Marienfeld Laboratory Glassware	110590
TEM rasters	Electron Microscopy Sciences	FCF200-Cu-50	Formvar/Carbon 200 Mesh, Cu
Kwantitatief filterpapier	Whatman	1001055
Deuteriumoxide (D2O)	Sigma-Aldrich	151882-100G	99,9 atoom % D
CaF2 venster	PIKE Technologies	160-1212	25 mm x 2 mm venster. Voor FT-IR metingen
AFM tips	NanoScience Instruments	CFMR	Aspire sondes, CFMR-25 serie
Filtereenheden	Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, gamma gesteriliseerd
SEM	FEI		Quanta 200 ESEM
TEM	FEI		Tecnai T12 G2 Spirit
AFM	JPK Instruments		Een JPK NanoWizard3
FT-IR	Thermo Fisher Scientific		Nicolet 6700 geavanceerd goudspectrometer
FT-IR purge	Parker		BALSTON FT-IR purge gasgenerator model 75-52
OMNIC (Nicolet) software	Thermo Nicolet Corporation		Voor FT-IR spectra analyse
Vortexmixer	Wisd Laboratory Equipment		ViseMix VM
Weegschaal	Mettler Toledo		NewClassic MS
Sputter coater	Polaron		SC7640 sputter coater