Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Samenvatting

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Samenvatting

Weefselkweek is een waardevol instrument om de vele aspecten van de celfunctie te bestuderen, van de normale ontwikkeling van de ziekte van. Conventionele celcultuur methoden berusten op het vermogen van cellen hetzij te hechten aan een vast substraat van een weefselkweek schaal of groeien in suspensie in een vloeibaar medium. Meerdere onsterfelijke cellijnen zijn gemaakt en geteeld met behulp van dergelijke benaderingen, echter, deze methoden vaak mislukken als primaire cellen moeten worden gekweekt ex vivo. Deze mislukking is toegeschreven aan de afwezigheid van de geschikte extracellulaire matrixcomponenten van het weefsel micro van de standaard systemen waar weefselkweek kunststof wordt gebruikt als een oppervlak voor celgroei. Extracellulaire matrix is ​​een integraal onderdeel van het weefsel micro en zijn aanwezigheid is cruciaal voor het handhaven van de fysiologische functies zoals mobiele polarisatie, overleving en proliferatie. Hier presenteren wij een 3-dimensionale weefselkweek methode waarbij primaire beenmerg cells worden gekweekt in extracellulaire matrix geformuleerd om de micro-omgeving van het menselijk bot (RGB-systeem) recapituleren. Ingebed in de extracellulaire matrix worden cellen voorzien van voedingsstoffen door het medium aangevuld met humaan plasma, waardoor een uitgebreid systeem waarbij celoverleving en proliferatie kan worden voortgezet tot 30 dagen terwijl de cellulaire samenstelling van de primaire weefsel. Met behulp van het RGB-systeem hebben we met succes gegroeid primaire beenmergcellen van normale donoren en patiënten met amyloïdose, en diverse hematologische maligniteiten. De RGB-systeem zorgt voor directe, in-matrix real time visualisatie van de cel gedrag en de evaluatie van preklinische werkzaamheid van nieuwe therapieën. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd uit de rBM vervolgens gebruikt voor in vivo transplantatie, celsortering, stroomcytometrie en nucleïnezuur en eiwitanalyse. Samen genomen, de rBM methode biedt een betrouwbaar systeem voor de groei van de primaire bot Marrow cellen onder fysiologische omstandigheden.

Inleiding

Weefselkweek ontwikkeld om celgedrag studeren in een gecontroleerde omgeving om de systemische variabiliteit te minimaliseren bij het vergelijken van verschillende processen in intacte organismen. Deze methode werd voor het eerst opgericht in de vroege jaren 1900 ^1,2 en verwijst naar een techniek waarbij weefselexplantaten werden gekweekt ex vivo in een glazen schaal. In het midden van de jaren 1900 werd het systeem aangepast aan verspreide cellen in plaats van fragmenten van intacte weefsels groeien, en de begrippen 'weefselkweek' en 'celcultuur' werd synoniem ^3. In dergelijke conventionele celculturen cellen worden gekweekt op het oppervlak van de weefselkweek plastic bedekt met groeimedium aangevuld met verschillende groeifactoren. Twee soorten culturen ontstaan ​​op basis van de hechting aantal verschillende cellen: hechtende celkweek, waarbij cellen hechten en verspreiden van de weefselkweek plastic en hechtende culturen, waarbij cellen worden gekweekt in suspensie. Sinds de vroege dagen van de celcultuur, meerdere onsterfelijke cellijnen zijn gemaakt, zoals HeLa ^4, de eerste menselijke kanker cellijn. Deze cellijnen hebben het vermogen om oneindig prolifereren in celkweek en de meeste hebben geen speciale behandeling nodig levensvatbaarheid behouden.

De reductionistische benadering van de oorspronkelijke celcultuurmethoden ontworpen om het systeem zo veel mogelijk door alleen het absolute minimum onderdelen om levensvatbaarheid en celproliferatie ondersteunen vereenvoudigen. Echter, vereenvoudigde celkweek benaderingen niet ex vivo meest primaire menselijke celtypes met eindige levensduur te ondersteunen. Daarom zijn nieuwe kweeksystemen ontworpen om het weefsel micro zo dicht mogelijk benaderen, waardoor cel explantaten groeien onder fysiologische omstandigheden. In tegenstelling tot de conventionele / reductionistische celkweek benaderingen, 3-dimensionale (3-D) kweeksystemen worden nu een voorkeurswerkwijze efficiënt cultuur verschillendehumane cellijnen en primaire cellen vervolgens bestuderen mechanismen betrokken bij gezondheid en ziekte, in het kader van een ondersteunende micromilieu. Dergelijke 3-D systemen worden meestal opgezet met gereconstrueerde matrices en / of medium aangevuld met groeifactoren, teneinde het weefsel micro herhalen om celtypen plaats bestuderen. De eerste van deze 3-dimensionale (3-D) cultuurmodellen ontwikkeld borstklier ontwikkeling bestuderen. Om de cellen te voorzien van natuurlijke omstandigheden mamma-epitheliale cellen werden ingebed in Matrigel, collageen IV en laminine-rijke bron van extracellulaire matrix (ECM), en bedekt met groeimedium. Onder dergelijke omstandigheden, de mammaire epitheelcellen vormden clusters lijkt op de borstklier acini en na stimulatie met lactogenic hormonen, die acini afgescheiden caseïne en andere melk proteïnen, in de holle lumina van de acini structuren. Caseïne secretie werd niet waargenomen in standaard kweken zelfs na toevoeging van prolactine ⁵Verder met de nadruk op het behoud van het micro morfologische en fenotypische eigenschappen van cellen. Een andere demonstratie van het verlies van de normale cellulaire functie wanneer de cellen worden uit de context van hun fysiologische micro-omgeving is een demonstratie die zonder ondersteunende micromilieu, keratinocyten niet gelaagde epidermis ⁶ vormen. Een aantal andere 3-D-modellen zijn gemaakt om ex vivo vermeerdering van primaire cellen ^7,8 toestaan.

De cruciale rol van micromilieu in celgedrag is elegant aangetoond in een studie waarbij mammaire epitheelcellen vormden "binnenstebuiten" acini indien gekweekt in collageen matrix, in vergelijking met de juiste gepolariseerde acini dat Matrigel werden gevormd. Dit verlies van goede morfologie werd teruggezet wanneer laminine-producerende myo cellen werden toegevoegd aan de culturen collageen I ^9. Bovendien is juist micromilieu vereist nauwkeurigegenotype manifestatie. Gekweekt in een schotel, MCF7-borstkankercellen getransfecteerd met een cel-cel adhesie molecuul CEACAM1 zich precies hetzelfde als de getransfecteerde CEACAM negatieve cellen. Echter, indien gekweekt in Matrigel, in contact met ECM, wildtype MCF7 vorm tumor-achtige structuren, terwijl MCF7 cellen die met CEACAM1 terugkeren naar een normaal fenotype en vorm acini met holle Lumena, zoals is vastgesteld met nonmalignant mamma-epitheel ^10. Ook blokkeert β1-integrine in borstkankercellen ofwel hun gedrag veranderen onder standaard kweekomstandigheden, maar hetzelfde experiment uitgevoerd in 3-D culturen blijkt dat het blokkeren β1-integrine keert maligne cellen een normaal fenotype ^11. Daarom wordt weefsel micro niet alleen nodig om cellevensvatbaarheid te behouden, maar ook om goede celfunctie behouden.

Naast het verschaffen van een systeem waarbij celgedrag onder fysiologische omstandigheden kan worden bestudeerds, 3-D culturen functioneren als robuust en betrouwbaar medium voor preklinische testen van nieuwe therapieën ^8,12,13. Kweken van cellen in 3-D laat screenen van onderzoekssamenstellingen onder de voorwaarden van milieutechnische gemedieerde resistentie ^14, waarin de bijdrage van cel-cel en cel-ECM-adhesie kon worden beoordeeld. Bovendien kan off-target toxiciteit van nieuwe verbindingen worden vastgesteld door de combinatie van meerdere cellulaire compartimenten van verschillende weefsels. Dergelijke schermen kunnen sneller worden uitgevoerd en zijn meer kosten-effectiever dan de vergelijkbare studies in vivo ^8.

Hier presenteren we een opstelling van een 3-D model van gereconstrueerde beenmerg (rBM) waarin normale en kwaadaardige beenmerg (BM) cellen prolifereren ex vivo in een systeem nauw nabootsen het micromilieu van de menselijke BM. Vorige pogingen groeiende primaire humane BM cellen in 2-D culturen vloeibare of aanhangende hulpkweken met verschillende onderdelen van BM stromaOf 3-D, halfvast agar culturen hebben beperkt succes gehad als gevolg van hun onvermogen om de cellen te voorzien van de bestanddelen van weefsel micro ^15-18. In deze systemen hadden primaire BM cellen slechte levensvatbaarheid en mislukte ex vivo te woekeren. Een ander systeem waarbij humane BM progenitorcellen worden gekweekt in bolvormige hulpkweken met BM stromale cellen een 3-D systeem waarbij levensvatbaarheid en proliferatie van hematopoietische stamcellen werd gehandhaafd gedurende ten minste 96 uur ^19. Hoewel zeer gunstig voor het begrip van de hematopoïetische voorlopercellen biologie, dit systeem niet getrouw recapituleren het micromilieu van de BM door het ontbreken van ECM componenten, dus het nut beperken. De RBM model hier beschreven vormt een samenhangend systeem waar zowel cellulaire en extracellulaire compartimenten van het menselijk BM worden gereconstrueerd in vitro. We zien dat rBM culturen ex vivo groei van normale humane BM cellen ondersteunen, zoals well als cellen geïsoleerd uit patiënten met verschillende hematologische aandoeningen.

Protocol

1. Advance Voorbereiding

1. Houd steriele serologische pipetten en pipet tips bij 4 ° C.
   Problemen oplossen: Matrigel gels bij kamertemperatuur (RT), het gebruik van koude pipetten en tips zal voorkomen Matrigel van geleiachtige tijdens de cultuur setup.
2. Ontdooi een fles Matrigel bij 4 ° C gedurende de nacht.

2. Bereiding van reagentia

1. Voorbereiding van fibronectine voorraad oplossing: Maak een 1 mg / ml voorraad oplossing van fibronectine door het oplossen van 100 mg menselijk fibronectine in 100 ml gedestilleerd water. Zodra de fibronectine is opgelost, steriel filter, aliquot en bewaar bij 4 ° C tot 6 maanden.
   Problemen oplossen: Als fibronectine niet snel oplost incubeer de oplossing voor een paar minuten in een waterbad van 37 ° C.
2. Bereiding van 10x PBS: Los 80 g natriumchloride NaCl, 14,4 g Na ₂ HPO _4, 2 g KCl en 2,4 g KH _{2PO 4 in 1 L gedestilleerd water. Stel de pH op 7,4, steriel filter en bewaar bij 4 ° C tot 6 maanden.}
3. Bereiding van neutralisatie buffer ^20: Voeg een oplossing die 100 mM HEPES 2x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 M HEPES en 10x PBS voorraadoplossingen. Stel de pH van de oplossing 7,0. Bewaren bij 4 ° C gedurende 2-3 maanden.
4. Bereiding van 2 mg / ml oplossing van rattenstaart collageen type I: Voeg een 2 mg / ml collageen I oplossing in de neutralisatie buffer (stap 2.3). Geschud oplossing bij lage snelheid en meng voorzichtig door en neer te pipetteren. Aangezien dit collageen is zeer visceuze, vermijd generatie van luchtbellen tijdens het pipetteren. Het wordt aanbevolen om collageen I oplossing vers bereiden elke keer. Bewaar de oplossing op ijs tot gebruik.
5. Bereiding van endosteal coating (scheuren): Meng 1 mg / ml fibronectine leverbaar met 2 mg / ml collageen I voorraad (stappen 2.1 en 2.4) tot een uiteindelijke concentratie van 77 ug / ml en 29 ug / ml, in 1x &# 160; steriele PBS. Meng en bewaar bij 4 ° C gedurende 1 maand.
6. Voorbereiding van de gereconstrueerde bot matrix (RBM):
   1. Precool 1,5 ml microcentrifugebuizen op ijs. Houd alle matrix-oplossingen op het ijs te allen tijde.
   2. Meng 4 delen Matrigel (Matrigel concentratie varieert van veel-naar-veel, maar de variaties zijn te verwaarlozen), 2,5 delen van 1 mg / ml fibronectine en 1 deel 2 mg / ml collageen I op ijs door eerst pipetteren Matrigel in de buis met koud pipetpunten en voeg fibronectine en collageen I Matrigel begint stollen bij temperaturen boven 4 ° C, zo snel werken terwijl pipetteren Matrigel. Meng de matrix heel voorzichtig door en neer te pipetteren, voorkomen dat er bubbels. Houd de buizen op het ijs tijdens het mengen de RBM.
7. Voorbereiding van het beenmerg groeimedium (BMGM): Maak 500 ml BMGM met 6,2 x 10 ^-4 M _CaCl2, 10 ^-6 M natriumsuccinaat, 10 ^-6 M hydrocortison, 20% menselijk plasma (normale of kwaadaardige verzameld van gezonde donoren of patiënten), en 1% penicilline / streptomycine in RPMI-1640. _CaCl2, natriumsuccinaat, hydrocortison en supplementen kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende> 6 maanden 1000 x voorraadoplossingen. Bij groeiende cellijnen kan foetaal runderserum (FBS) gelezen humaan plasma.
8. Bereiding van 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) Voeg 37% formaldehyde voorraadoplossing 1x PBS bij 10% v / v. Meng goed en bewaar bij kamertemperatuur gedurende 2-3 weken beschermd tegen licht.
9. Bereiding van 1% runderserumalbumine (BSA): Weeg geschikte hoeveelheid BSA en oplossen in 1x PBS. Bewaar bij 4 ° C en binnen 1 week. BSA-oplossing neiging om besmet indien gekoeld voor een langere periode bewaard. Alternatief kan BSA oplossing in hoeveelheden verdeeld en bij -20 ° C ingevroren voor langdurige opslag. Vermijd vries-dooi cycli.
10. Voorbereiding van de cel recovery-oplossing (CRS): Maak 5 mM EDTA, 1 mM natriumvanadaat (Na _{3 VO 4) en 1,5 mM natriumfluoride (NaF) oplossing in 1x PBS. Filtreer steriel en bewaar bij 4 ° C tot 6 maanden.}

3. Embedded 3-D Cultuur van nonmalignant en Maligne Human BM cellen

1. Zuiver primaire BM mononucleaire cellen door Ficoll-Plaque gradiëntcentrifugering instructies van de fabrikant.
   Optionele stap: cellen met 0,25 uM carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester (CFSE) instructies van de fabrikant celproliferatie gedurende de kweekperiode volgt gelabeld.
   Problemen oplossen: Als cellen sterven na CFSE kleuring, titreer de hoeveelheid CFSE als de concentratie is afhankelijk van celtype; 0,25 uM werkt goed voor primaire BM mononucleaire cellen.
2. Voeg 65 ul van Rend oplossing in elk putje van een 48-well weefselkweek behandeld plaat. Verdeel de oplossing gelijkmatig op het gehele oppervlak van het putje bedekken en incubeer> 30minuten bij kamertemperatuur.
3. Bereid de celsuspensie bij een dichtheid van 0,5 x 10 ⁶ cellen in 10 ul van 1 x PBS per putje van een 48-wells plaat. In een 1,5 ml microcentrifugebuis meng de celsuspensie met 100 pl per putje rBM matrix. Meng de cellen en RBM matrix door zachtjes en neer te pipetteren; voorkomen dat er bubbels. Bewaar de cel / matrix mengsel op ijs geleren van de matrix voorkomen.
   Opmerking: het RGB-systeem is volledig schaalbaar, het opzetten van het systeem in een niet-48-well formaat, pas de hoeveelheden van alle reagentia (matrices en middelgrote) gebaseerd op de oppervlakte van de plaat gebruikt. Schaal het aantal cellen dienovereenkomstig worden uitgeplaat.
4. Zuig de resterende verscheuren en voeg de cel / matrix mengsel in het midden van een goed. Snel, verspreiden de cellen / matrix mengsel het gehele oppervlak van het putje gelijkmatig bedekken. Plaats de plaat gedurende 30-60 min bij 37 ° C, 5% CO ₂ weefselkweek incubator om de matrix te stollen. Niet schudden of disturb de plaat tijdens de incubatie.
   Problemen oplossen: Om ongelijke verdeling van de cellen te voorkomen in RBM, goed mengen voorafgaand aan plating. Meng na iedere ^5e goed vergulde cellen regelen de bodem van de buis te voorkomen. Eenmaal geplateerd, worden cellen niet zinken naar de bodem van de put als gevolg van spanningen oppervlak in de matrix.
   Problemen oplossen: Om ongelijke verdeling van de cellen te voorkomen in RBM, goed mengen voorafgaand aan plating. Meng na iedere ^5e goed vergulde cellen regelen de bodem van de buis te voorkomen. Eenmaal geplateerd, worden cellen niet zinken naar de bodem van de put als gevolg van spanningen oppervlak in de matrix.
5. Voorverwarmen BMGM in een waterbad tot 37 ° C.
6. Na 30 min, controleren om te zien dat de matrix correct is ingesteld, het zal een zachte gel-achtige laag die niet beweegt wanneer de plaat wordt gekanteld vormen. Overlay de cel / matrix laag met 1 ml warm BMGM. Om scheuren van de matrix pipet middellange vermijden zachtjes (afgeven drop-by-drop) meteen serologische pipet. Plaats de gemonteerde rBM cultuur in een 37 ° C, 5% CO ₂ weefselkweek incubator en cultuur voor de gewenste periode.
   Opmerking: cellevensvatbaarheid gedurende ten minste 30 dagen zonder dat medium, als mediumverversing is alleen vereist telkens veranderen 50% drager.
   Kritische stap: Het is cruciaal dat het medium niet koud als koude temperatuur de reeds matrix zou verstoren. Verzorgen het medium niet te spuiten op de top van de matrix bij het de zachte matrix laag zou kunnen breken.
   Problemen oplossen: Als levensvatbaarheid van de cellen in het RGB-systeem laag is, kan celdichtheid moeten experimenteel worden bepaald bij het ​​werken met andere dan primaire mononucleaire cellen uit BM aspiraten cellen. Bij het werken met cellijnen, verminderen het aantal cellen 10-voudige, als onsterfelijk cellijnen vermenigvuldigen sneller dan primaire cellen.

4. 'In-matrix' Imaging

1. Licht microscopie
   1. Afbeelding de gekweekte cellen direct rBM met helderveld, differentieel interferentie contrast (DIC), confocale of andere beeldvormingstechnieken die lange afstand beeldvorming mogelijk te maken wanneer de matrix ongeveer 1 mm dik. Gebruik de Z-stack functie die beschikbaar is op veel van de microscopen om het imago van de hele cultuur van boven naar beneden.
2. Immunofluorescentiekleuring
   Tip: Voor de immunobeeld protocol hieronder vermijden opzuigen kleuring / wassen oplossingen, in plaats tilt de plaat en oplossingen te verwijderen met behulp van een pipet.
   1. Verwijder de BMGM met een pipet en was 2-3x met 100 ul / was / putje RT 1x PBS. Zorg ervoor dat er voldoende PBS wordt gebruikt om het gehele oppervlak van het putdeksel.
   2. Fix cellen matrix door toevoeging van 100 ul / putje (voor een 48-well plaat) van 10% NBF gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder NBF en was cellen tweemaal met 100 ul / was / well RT 1x PBS.
      Noot: Vermijd het gebruik van koud NBF als het kan de matrix kan vloeibaar.
   3. Verwijder PBS, voeg 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende de nacht om te blokkeren specifieke binding van antilichamen.
   4. Bereid primaire antilichaam oplossing in 1% BSA op de gewenste verdunning. Verwatering zal variëren voor elk antilichaam, contact op met de fabrikant of titreren om de optimale concentratie antilichamen te bepalen. Voeg 100 ul / putje primair antilichaam oplossing en incubeer volgens de instructies van de fabrikant.
      Kritische stap: Alle incubaties waarbij antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen of fluorescente kleurstoffen moeten worden uitgevoerd in het donker.
   5. Verwijder primaire antilichaam oplossing en was 3x met 1x PBS gedurende 5 minuten.
   6. Voor indirecte immunofluorescentie kleuring, incuberen met een secundair antilichaam geconjugeerd aan fluorescente probe gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun de antilichamen in 1% BSA in een concentratie gesuggereerd door de fabrikant.
   7. Verwijder de secundaire eenntibody oplossing en was 3x met 1x PBS gedurende 5 minuten.
      Problemen oplossen: Om een hoge achtergrond te vermijden tijdens de beeldvorming, titreer de fluorescent geconjugeerde secundaire antilichamen en gebruik de laagste concentratie die voldoende signaal. Indien hoge achtergrond is nog steeds een probleem, het aantal en de duur van wasstappen, of gebruik direct geconjugeerd primaire antilichamen, en sla stap 4.2.6.
   8. Om vlekken de kernen commentaar 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring van kernen oplossing na verdunning gesuggereerd door de fabrikant, en incubeer gedurende 7-10 minuten bij kamertemperatuur.
   9. Verwijder kleuroplossing nucleaire en was 2x met 1x PBS gedurende 5 minuten.
   10. Verwijder de PBS uit de laatste wasbeurt en voeg een druppel montage medium (reguliere set), op het monster om fluorescentie te behouden. Beeld met behulp van geschikte excitatie / emissie instellingen op een fluorescerende of confocale microscoop.
       Opmerking: Imaging moet worden gedaan binnen 2 dagen na kleuringeen achteruitgang van de matrix en het verlies van rBM integriteit en verlies van fluorescent signaal te voorkomen. Als onmiddellijk afgebeeld moet gekleurd monsters bij 4 ° C bewaard, beschermd tegen licht, tot beeldvorming.

5. Isolatie van Cellen van rBM

1. Verwijder medium voorzichtig zonder de matrix laag. Niet aspireren.
2. Was cellen 2x met steriele 1x PBS. Niet aspireren.
3. Voeg 0,5 ml ijskoude CRS aan elk putje en compleet verwijderen matrixlaag met de cellen, door krachtig en neer te pipetteren. Verzamel de cellen matrix en CRS in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Plaats op ijs.
4. Voeg een extra 0,5 ml CRS aan dezelfde put en verzamel alle overgebleven materiaal. Transfer naar dezelfde microcentrifugebuis.
5. Vortex het mengsel van cellen, matrix, en CRS en incubeer op ijs gedurende 1 uur. Vortex cellen elke 15 minuten naar bevrijding uit de matrix te vergemakkelijken.
6. Controleer het mengsel na 1 uur, geen zichtbare klontenvan de matrix aanwezig zijn.
   Problemen oplossen: wanneer er klontjes of matrix zijn nog zichtbaar na 1 uur, overdracht cellen / matrix / CRS mengsel in een grotere buis, voeg extra 2-5 ml van CRS, en incubeer een extra 30-60 minuten.
7. Centrifugeer cellen bij CRS 1000 rpm gedurende 5-10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml koud 1x PBS.
8. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5-10 minuten en verwijder het supernatant. Herhaal de PBS wassen nog een keer.
9. De tweede PBS wassing maakt de terugwinning van cellen van matrix en geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals DNA / RNA / eiwit isolatie, flowcytometrie, in vivo transplantatie, enz.

Resultaten

Sinds primaire beenmergcellen niet woekeren onder standaard weefselkweek omstandigheden werd het RGB-systeem gemaakt om het bot micro-omgeving na te bootsen, het verstrekken van een systeem om de cultuur en uitbreiden BM cellen ex vivo. De belangrijkste componenten van de BM extracellulaire matrix, fibronectine, collageen I, collageen IV, laminine en ^21, zijn opgenomen in rBM matrix om de structurele steiger daartoe voorzien in 3-D cultuur. Endosteum, het raakvlak tussen het bot en de BM, rijk aan co...

Discussie

De RBM-model biedt een uitgebreid systeem waar de cellulaire samenstelling van de BM wordt gehandhaafd ex vivo voor maximaal 30 dagen. BM cellen gekweekt in rBM zelf stratify basis van hun functie nauwkeurig nabootsen van de BM architectuur in vivo. Bovendien is dit het eerste systeem dat zorgt voor de expansie van de veelvoudige myeloma kloon ^8. De meest kritische stappen voor het waarborgen van de krachtige groei van BM cellen en het succes van de cultuur zijn: 1) een gezonde populatie van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CellTrace CFSE proliferatiekit-voor flowcytometrie	Invitrogen/Life Technologies	C34554
Fibronectin uit menselijk plasma	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrigel basaalmembraanmatrix	BD Biosciences	354234
Rattenstaart collageen type I	BD Biosciences	354249	Collageen I van Millipore polymeriseert niet goed volgens dit protocol
VECTASHIELD montagemedium voor fluorescentie (standaardset)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tabletjes	Sigma-Aldrich	F4648	Voor TRAP-kleuring
SigmaFast BCIP/NBT tabletjes	Sigma-Aldrich	B5655	Voor alkalische fosfatasekleuring
Zeiss confocale LSM 510 microscoop	Carl Zeiss
Zeiss 510 software	Carl Zeiss		Beeldanalysesoftware voor confocale analyse
Zeiss Axiovert 200M omgekeerde microscoop	Carl Zeiss
MetaMorph software	Molecular Devices		Beeldanalysesoftware voor Axiovert 200M
FACSort flowcytometer	BD Biosciences
CellQuest Pro software	BD Biosciences		Software voor de analyse van flowcytometriegegevens