Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Summary

Bij standaard kweekmethoden cellen uit hun fysiologische omgeving en gekweekt op het plastic oppervlak van een schotel. Om het gedrag van primaire humane beenmergcellen bestuderen we een 3-D kweeksysteem waarbij cellen worden gekweekt onder omstandigheden indient de natieve micro van het weefsel.

Abstract

Weefselkweek is een waardevol instrument om de vele aspecten van de celfunctie te bestuderen, van de normale ontwikkeling van de ziekte van. Conventionele celcultuur methoden berusten op het vermogen van cellen hetzij te hechten aan een vast substraat van een weefselkweek schaal of groeien in suspensie in een vloeibaar medium. Meerdere onsterfelijke cellijnen zijn gemaakt en geteeld met behulp van dergelijke benaderingen, echter, deze methoden vaak mislukken als primaire cellen moeten worden gekweekt ex vivo. Deze mislukking is toegeschreven aan de afwezigheid van de geschikte extracellulaire matrixcomponenten van het weefsel micro van de standaard systemen waar weefselkweek kunststof wordt gebruikt als een oppervlak voor celgroei. Extracellulaire matrix is ​​een integraal onderdeel van het weefsel micro en zijn aanwezigheid is cruciaal voor het handhaven van de fysiologische functies zoals mobiele polarisatie, overleving en proliferatie. Hier presenteren wij een 3-dimensionale weefselkweek methode waarbij primaire beenmerg cells worden gekweekt in extracellulaire matrix geformuleerd om de micro-omgeving van het menselijk bot (RGB-systeem) recapituleren. Ingebed in de extracellulaire matrix worden cellen voorzien van voedingsstoffen door het medium aangevuld met humaan plasma, waardoor een uitgebreid systeem waarbij celoverleving en proliferatie kan worden voortgezet tot 30 dagen terwijl de cellulaire samenstelling van de primaire weefsel. Met behulp van het RGB-systeem hebben we met succes gegroeid primaire beenmergcellen van normale donoren en patiënten met amyloïdose, en diverse hematologische maligniteiten. De RGB-systeem zorgt voor directe, in-matrix real time visualisatie van de cel gedrag en de evaluatie van preklinische werkzaamheid van nieuwe therapieën. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd uit de rBM vervolgens gebruikt voor in vivo transplantatie, celsortering, stroomcytometrie en nucleïnezuur en eiwitanalyse. Samen genomen, de rBM methode biedt een betrouwbaar systeem voor de groei van de primaire bot Marrow cellen onder fysiologische omstandigheden.

Introduction

Weefselkweek ontwikkeld om celgedrag studeren in een gecontroleerde omgeving om de systemische variabiliteit te minimaliseren bij het vergelijken van verschillende processen in intacte organismen. Deze methode werd voor het eerst opgericht in de vroege jaren 1900 ^1,2 en verwijst naar een techniek waarbij weefselexplantaten werden gekweekt ex vivo in een glazen schaal. In het midden van de jaren 1900 werd het systeem aangepast aan verspreide cellen in plaats van fragmenten van intacte weefsels groeien, en de begrippen 'weefselkweek' en 'celcultuur' werd synoniem ^3. In dergelijke conventionele celculturen cellen worden gek....

Protocol

1. Advance Voorbereiding

1. Houd steriele serologische pipetten en pipet tips bij 4 ° C.
   Problemen oplossen: Matrigel gels bij kamertemperatuur (RT), het gebruik van koude pipetten en tips zal voorkomen Matrigel van geleiachtige tijdens de cultuur setup.
2. Ontdooi een fles Matrigel bij 4 ° C gedurende de nacht.

2. Bereiding van reagentia

1. Voorbereiding van fibronectine voorraad oplossing: Maak een 1 mg / ml voorraad oplossing van fibronectine door het oplossen van 100 mg menselijk fibronectine in 100 ml gedestilleerd water. Zodra de fibronectine is opgelost, steriel filter, aliquot e....

Results

Sinds primaire beenmergcellen niet woekeren onder standaard weefselkweek omstandigheden werd het RGB-systeem gemaakt om het bot micro-omgeving na te bootsen, het verstrekken van een systeem om de cultuur en uitbreiden BM cellen ex vivo. De belangrijkste componenten van de BM extracellulaire matrix, fibronectine, collageen I, collageen IV, laminine en ^21, zijn opgenomen in rBM matrix om de structurele steiger daartoe voorzien in 3-D cultuur. Endosteum, het raakvlak tussen het bot en de BM, rijk aan co.......

Discussion

De RBM-model biedt een uitgebreid systeem waar de cellulaire samenstelling van de BM wordt gehandhaafd ex vivo voor maximaal 30 dagen. BM cellen gekweekt in rBM zelf stratify basis van hun functie nauwkeurig nabootsen van de BM architectuur in vivo. Bovendien is dit het eerste systeem dat zorgt voor de expansie van de veelvoudige myeloma kloon ^8. De meest kritische stappen voor het waarborgen van de krachtige groei van BM cellen en het succes van de cultuur zijn: 1) een gezonde populatie van.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry	Invitrogen/Life Technologies	C34554
Fibronectin from human plasma	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrigel basement membrane matrix	BD Biosciences	354234
Rat tail collagen type I	BD Biosciences	354249	Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol
VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets	Sigma-Aldrich	F4648	For TRAP staining
SigmaFast BCIP/NBT tablets	Sigma-Aldrich	B5655	For alkaline phosphatase staining
Zeiss confocal LSM 510 microscope	Carl Zeiss
Zeiss 510 software	Carl Zeiss		Image analysis software for confocal analysis
Zeiss Axiovert 200M inverted microscope	Carl Zeiss
MetaMorph software	Molecular Devices		Image analysis software for Axiovert 200M
FACSort flow cytometer	BD Biosciences
CellQuest Pro software	BD Biosciences		Software for the analysis of flow cytometry data