Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In dit protocol bieden wij een methode om dendritische cellen (DC) en epitheelcellen (TEC) isoleren van de humane thymus. DC en TEC zijn de belangrijkste antigeen presenterende cel (APC) soorten gevonden in een normale thymus en het is bekend dat ze verschillende rollen spelen tijdens de thymus selectie. Deze cellen zijn gelokaliseerd in verschillende micro-omgevingen in de thymus en elke soort APC maakt slechts een kleine populatie van cellen. Om verder inzicht in de biologie van deze celtypen karakterisatie van deze celpopulaties is zeer wenselijk maar door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen vereist een efficiënte en reproduceerbare werkwijze. Dit protocol detailleert een methode die geschikt zijn voor karakterisatie van diverse cellulaire eigenschappen te verkrijgen. Thymusweefsel mechanisch verstoord en na verschillende stappen van enzymatische digestie, wordt het resulterende celsuspensie verrijkt met een Percoll dichtheid centrifugatie stap. Voor isolatie van myeloïde DC (CD 11 c <sup> +), cellen van de lage-dichtheid-fractie (LDF) worden immunoselected door magnetische celsortering. Verrijking van TEC populaties (MTES, Ctec) wordt bereikt door depletie van hematopoietische (CD45 hi cellen) van de lage-dichtheid Percoll celfractie waardoor hun verdere isolering via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met specifieke cel markers. De geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen.
Inleiding
De thymus is het orgaan waarin T cel ontwikkeling optreedt. De relatieve en absolute omvang afneemt met de leeftijd als het achtereenvolgens wordt vervangen door vet hoewel thymus activiteit nog kan worden gedetecteerd in de ouderdom. Het belang van de immuunrespons aangetoond in de vroege jaren 1960 1.
De T-cel repertoire wordt gevormd door de interactie van T-celreceptoren met peptide-MHC complexen op verschillende soorten thymus APC, die leven of dood cues de ontwikkeling T-cellen, wat resulteert in een functioneel en grotendeels zelfverdraagzaam T cel repertoire 2.
Ongeveer 98% van de cellen in de humane thymus ontwikkelen T genoemd thymocyten cellen. De resterende 2% bestaat uit een aantal verschillende celtypen, waaronder een verscheidenheid van TEC (corticale, medullair, subcapsulaire), myeloïde en plasmacytoïde DC (mDC PDC), macrofagen, B cellen, volwassen re-circulerende T-cellen, granulocyten, fibroblasts, endotheelcellen en zeer zeldzame epitheliale cellen met een expressie fenotype lijkt op die van cellen van andere weefsels zoals spieren, neuronen en respiratoire epitheel (figuur 1). Van deze, TEC en DC zijn de belangrijkste APC soorten gevonden in een normale thymus. In de afgelopen jaren is de zuivering van deze APC types voor cultuur en moleculaire profiel kreeg meer en meer belangstelling. Door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen voor gedetailleerde analyse vereist een efficiënt, reproduceerbaar en kosten-effectieve procedure. De hier gepresenteerde methode is een wijziging van eerder gepubliceerde studies 3,4.
Zoals bij andere weefsels, kunnen cellen extractie uit de thymus worden bereikt door enzymatisch opsplitsing van de cel-cel en cel-matrix interacties netwerken, om een suspensie van afzonderlijke cellen te verkrijgen. Er zijn bepaalde parameters, zoals goede dissociatie efficiëntie, celopbrengst, leefbaarheid en behoud van cellen en celurface markers die cruciaal zijn en moeten worden geoptimaliseerd voor de succesvolle isolatie van deze zeldzame celpopulaties.
In dit protocol wordt isolatie van DC en TEC subsets uitgevoerd door een enkele celsuspensie van weefsel door mechanische verbreking en enzymatische digestie. We gebruiken Collagenase Een van Clostridium histolyticum, die een uitgebalanceerde verhouding van verschillende enzym activiteiten heeft, af te breken de inheemse collageen, dat het weefsel bij elkaar houdt. DNase I is in de enzymoplossing naar cel aggregatie te verminderen door vrij DNA van dode cellen (thymocyten zijn zeer gevoelig). We hebben bovendien een alternatieve benadering van de typische enzymatische digestie weefsel met mechanische en enzymatische weefselbehandelelektrode bijgestaan door een weefsel Dissociator. De celsuspensie wordt dan onderworpen aan een Percoll dichtheid centrifugatie voor verrijking van lage dichtheid fractie (LDF) cellen. Van deze fractie van de cellen, kan DC door kleuring f worden geïsoleerdof DC-oppervlaktemerkers (bijvoorbeeld CD 11 c +) en met behulp van magnetische scheiding of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). In tegenstelling tot de lymfoïde cellen die de meeste cellen in de thymus, hoeft TEC CD45 niet tot expressie op een hoog niveau, maar positief voor de epitheliale cel adhesie molecuul EpCAM. CTEC kunnen worden onderscheiden van medullaire TEC door de expressie van een toch ongedefinieerde antigeen herkend door de CDR-2 (corticale dendritische reticulocyten-2) antilichaam 4,5 en iets lager EpCAM-expressie. De differentiële co-expressie van EpCAM en CDR2 maakt de efficiënte isolatie van deze TEC subsets via high-speed celsortering 6.
De hier gepresenteerde protocol geoptimaliseerd voor menselijke thymus weefsel. De duur van de procedure is gebaseerd op de hoeveelheid weefsel en het vermogen van de experimentator en de snelheid van de cel sorteerder als FACS sortering wordt gebruikt. Normaal gesproken kan het protocol voor de isolatie van DC binnen 5-6 Uur en voor de isolatie van VEG 8-10 uur. De isolatie van DC en TEC subsets van thymusweefsel is tijd gevoelig. Hoe sneller de isolatieprocedure, hoe beter de toestand van de cellen. Tenslotte kunnen de geïsoleerde cellen worden voor verder onderzoek als vergelijkende studies van mRNA en eiwitexpressie PCR experimenten eiwitisolatie, moleculaire profiel (dwz transcriptomics, micro RNA-analyse) en celkweek 6.
Ethiek Verklaring
Om te kunnen werken met menselijke thymus weefsel moet de onderzoeker om goedkeuring te verkrijgen van de lokale ethische commissie of de verantwoordelijke overheden als een geïnformeerde schriftelijke toestemming van de donor (of meestal zijn of haar ouders, omdat weefsel wordt meestal verkregen uit minderjarig kinderen). Bovendien moeten alle menselijke weefsels worden behandeld als potentieel infectieus en passende maatregelen moeten worden genomen, zoals het werken met handschoenen, etc.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van gereedschap, Enzyme Solutions, en Buffers
Voer de volgende voorbereidende stappen voor het begin van het protocol.
- Gereedschap
Schone, droge en autoclaaf de volgende hulpprogramma's en bewaar ze in een steriele verpakking tot het gebruik.- Kleine scherpe schaar met ofwel gebogen of rechte tips voor het snijden van de thymus weefsel. Kleine gebogen pincet met gekartelde tips voor het omgaan met het weefsel.
- 50 ml Oak Ridge Centrifugeglazen, PC, voor de Percoll dichtheid centrifugeren stap.
- Enzymoplossingen
Bereid de collagenase / DNase I enzym mix (2 mg collagenase / ml en 0,1 mg DNase I / ml) als volgt:- Los 500 mg gelyofiliseerd collagenase A (Roche) in 250 ml RPMI 1640 effen (zonder FCS) een 2 mg / ml collagenase oplossing. Collagenase is heel moeilijk op te lossen, dus het is aangeraden om het te verlaten enige tijd op een roller-shaker bij kamertemperatuur.
- Los 100 mg DNase I (Roche) in10 ml steriel gedistilleerd water. 2,5 ml porties kunnen bij -20 ° C worden bewaard Voeg 2,5 ml van de 10 mg DNase I oplossing in de 2 mg collagenase A oplossing.
- Steriel filter de Collagenase / DNase mix met een Stericup filtereenheid (0,22 pm). Bewaren in 10-20 ml porties bij -20 ° C tot gebruik.
- Buffers en oplossingen
- 1,5 M NaCl stockoplossing: Los NaCl in steriel gedestilleerd water tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 M. Filtreer de oplossing door een 0,22 urn filter en opslag bij kamertemperatuur.
- 10x MACS buffer: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-vrij) met 5% BSA en 20 mM EDTA. Filtreer steriel de oplossing met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C. Voorafgaand aan het gebruik bereiden een 1x oplossing door verdunning van de 10x voorraad om 1x in koude steriele 1x PBS.
- FACS buffer: 1x PBS (Ca2 + / Mg2 +-vrij) bevattende 1% BSA en 0,02% NaN3.
- FACS buffer voor celsortering: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 +-vrij) met 2% BSA. Steriliseer met een 0,22 urn spuitfilter en bewaren bij 4 ° C.
2. Bereiding van de Tissue
De verwerking van het weefsel moet worden uitgevoerd met steriele reagentia en werken in een laminaire flowkast. Voordat de procedure begint, bereiden de volgende reagentia en apparatuur:
- Verwarm de volgende RT: RPMI 1640 compleet medium (RPMI 1640, 10% foetaal kalf serum, 1% pen / strep), RPMI 1640 vlakte, Ca 2 + / Mg 2 +-vrij PBS en 2x Collagenase / DNase enzym oplossing.
- Warme thermische incubator met rotatie-eenheid 37 ° C en koel vaste hoek rotor centrifuge bij 4 ° C.
- Bereid een doos met ijs.
Opmerking: de duur van deze stap hangt af van de conditie en grootte van het weefsel. Ongeveer 20-30 min is redelijke termijn nodig is voor een middelgrote stuk tissue in goede staat (~ 5 cm breed).
- Plaats weefsel in een petrischaal met steriele PBS en afspoelen eventueel resterende bloed.
- Voeg verse PBS om weefsel te voorkomen drogen en behulp van een tang en schaar schoon het weefsel van bloedstolsels, bindweefsel en vetweefsel en een deel dat niet gezond uitziet.
- Zorg ervoor necrotisch weefsel dat het enig vuil zal toenemen verwijderen.
- Na het reinigen, wegen weefsel ter referentie.
- Snijd het weefsel in ongeveer 1 cm 3 stuks / blokken. Voeg genoeg PBS om het weefsel te dekken.
Opmerking: Voor de reproduceerbaarheid van de resultaten, moet het weefsel in stukken van gelijke grootte worden gesneden.
- De achterkant van een steriele injectiespuit (10-20 ml) druk uitoefenen (niet te hard of langdurige) op de thymusweefsel stukken. Deze procedure zal het grootste deel van thymocyten verwijderen, waardoor het volume weefsel verminderen later worden verteerd. Voer deze stap uit op ijs en werken snel.
- De oplossing zal zichtbaar troebel als thymocytes worden vrijgegeven. Roer het gerecht zachtjes en vervolgens met behulp van een pipet 5 ml of een glas afzuiger verwijder het supernatant dat de thymocytes zorg niet aan het weefsel stukken per ongeluk te zuigen.
Tip: Een steriele celkweek schraper kan worden gebruikt om alle weefselstukken concentreren aan een zijde van de schotel kantelt de schaal (45 ° angle) en zuig de supernatant. Vervangen met verse PBS en herhaal deze procedure tot de bovenste is relatief transparant. Voer laatste wassen met RPMI vlakte.
- Hak weefsel stukken met behulp van een scherpe schaar (zo fijn mogelijk, moeten fragmenten tenminste 2-4 mm). De fragmenten klein genoeg om een pipet 5 ml te betreden.
3. Voorbereiding van enkele celsuspensie van Thymus Tissue
Hiertwee alternatieve benaderingen voor deze stap worden beschreven. De eerste aanpak beschrijft een typische enzymatische weefsel spijsvertering (paragraaf 3.1), terwijl de tweede behelst mechanische en enzymatische weefsel behandeling bijgestaan door een tissue Dissociator (paragraaf 3.2).
Dit protocol is geoptimaliseerd voor de behandeling van weefsel monsters van 5 g. Voor grotere of kleinere weefselmonsters, dienovereenkomstig aan enzym volumes.
3.1 Typische enzymatische digestie weefsel een enkele celsuspensie te vinden
- Plaats puree weefsel in 50 ml buizen met 10 ml collagenase / DNase oplossing per 5 g weefsel. Voeg RPMI duidelijk tot een totaal volume van 20 ml.
Opmerking: in een 50 ml buisje verteren tot 10 g weefsel. Pas enzym volume dienovereenkomstig.
- Incubeer het weefsel suspensie 40 minuten bij 37 ° C onder langzame rotatie in een thermische incubator.
Opmerking: incubatie stappen kunnen worden uitgevoerd in een thermische incubator met een rotatie-eenheid, of in een 37 ° C incubator met een bacteriële shaker.
- Het enzym oplossing zal troebel worden als cellen vrijkomen in het. Aan het einde van de digestie, centrifugebuis van 110 g gedurende 2 minuten om weefsel fragmenten sedimenteren.
- Verzamel supernatant van deze vertering ronde. Pellet de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 400 x g. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in 10-50 ml RPMI volledig afhankelijk van de grootte van de cel pellet.
- Houd celsuspensie in 37 ° C incubator met de dop los.
- Bij grotere aantallen cellen gewenst zijn, kan de vertering stap worden herhaald met de resterende weefsel fragmenten en de eerste en de tweede gepoolde verteren. Ook als TEC worden geïsoleerd, twee rondes van digesties worden uitgevoerd.
- Verdun een aliquot van de celsuspensie in trypan blauw (1:10-1:100) en tel levensvatbare cellen met een hemocytometer.
- Houd cellen bij 37 ° C in de incubator tot klaar om verder te gaan naar de Percoll dichtheid centrifugeren (paragraaf 4). Daaropvolgende isolatie van DC subsets (paragraaf 5) zal worden uitgevoerd uit deze cellen.
Opmerking: thymus weefsels kunnen variëren in samenstelling, in het bijzonder met de leeftijd, waarbij de vertering efficiëntie en het genereren van een enkele-celsuspensie beïnvloedt.
- Voor de verdere isolatie van thymus epitheelcellen (TEC) een derde ronde van enzymatische afbraak is vereist. Hersuspenderen weefsel resten in 10 ml vers Collagenase / DNase oplossing plus 10 ml RPMI vlakte en voeg trypsine / EDTA (01:50 van 2,5% voorraad) in de oplossing.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 40 minuten onder zacht rotatie. Gedurende de laatste 10 - 15 minuten van de incubatie commentaar FCS (01:05) om de activiteit van trypsine te neutraliseren.
- Centrifugeer bij 110 xg gedurende 2 min bij RT om het weefsel fragmenten sedimenteren.
Opmerking: Het weefsel niet volledig verteerd nadat deze drie rondes van ontsluitingen. Leeftijd en algehele conditie van het weefsel zijn twee parameters die de dissociatie efficiëntie van de thymus weefsel beïnvloeden.
- Verzamel de celsupernatant en gooi de gesedimenteerde weefselfragmenten.
- Centrifugeer de cel supernatant bij 400 xg gedurende 10 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer celpellet in RPMI compleet.
Tip: Celpellets zijn vrij los, dus zorg bij inlevering / aspireren supernatant.
- Telling levensvatbare cellen met een hemocytometer. Plaats de cellen in een 37 ° C incubator totdat gaan tot scheiding (deel 4) Percoll. Latere pre-verrijking van TEC cellen door uitputting van CD45 hi cellen zullen worden uitgevoerd vanuit deze cellen (hoofdstuk 6).
3.2 Mechanische en enzymatische weefsel behandeling bijgestaan door een tissue Dissociator
Het weefsel Dissociator benaderen het weefsel spijsvertering stappen kunnen worden teruggebracht tot de helft van de tijd die nodig is met de hierboven (punt 3.1) beschreven aanpak. Het volgende protocol is een gemodificeerde versie van die vroeger muis thymus weefsel voor de isolatie van VEG 7,8 dissociëren.
- Overdracht 5 g gehakt weefsel stukken (stap 2.5) in een C Tube met 10 ml collagenase / DNase oplossing.
- Adapt C buis op het weefsel Dissociator and run programma m_spleen_02 (10 sec). Herhaal dit programma 4-5x (40-50 sec).
- Incubeer met zachte rotatie gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
- Centrifugeer bij 110 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Verzamel supernatant en ga als in stap 3.1.4. Voeg 10 ml vers Collagenase / DNase oplossing.
- Adapt C buis op het weefsel Dissociator and run programma m_spleen_01 (56 sec).
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten onder zacht rotatie.
- Centrifugeer bij 110 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- CollecT-cel supernatant en pellet de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 400 x g. Ga als in stap 3.1.4.
- Zoals beschreven in 3.1.9 een derde ronde van digestie is nodig voor de daaropvolgende isolatie van thymus epitheelcellen (TEC). Hiervoor resuspendeer weefsel resten in 10 ml vers collagenase / DNase oplossing plus trypsine / EDTA (1:50 verdunning leverbaar 2,5%)
- Incubeer bij 37 ° C gedurende nog 20 minuten onder zacht rotatie. Voeg FCS (01:05) en incubeer verdere 10 minuten.
Opmerking: Met deze aanpak, na deze laatste digestiestap het weefsel wordt meestal volledig gescheiden en geen onverteerd weefsel fragmenten worden waargenomen.
- Ga als in stappen 3.1.11-3.1.14.
4. Verrijking van LDF van cellen met behulp Percoll dichtheid Scheiding
Na enzymatische digestie van het weefsel, worden totale thymus cel suspensies onderworpen aan een Percoll dichtheid centrifugation stap te verrijken voor de LDF cellen. De LDF van cellen wordt sterk verrijkt voor APC. Zowel DC en TEC worden gedetecteerd in deze fractie van de cellen.
- Gebruik enkele celsuspensie verkregen uit de 1 e en 2 e verteert voor mDC isolatie (samengevoegde cellen, zie stap 3.1.8) of 3e digest (voor TEC isolatie) (3.1.14). Centrifugeer celsuspensie verkregen uit digestie stap 400 xg gedurende 10 minuten.
- Bereid een Percoll oplossing met een uiteindelijke dichtheid van 1,07 g / ml tijdens de wasstap (zie voorbeeld in onderstaande tabel).
Bereiding van Percoll oplossing tot een uiteindelijke dichtheid van 1,07 g / ml (ρ = 1,07) Buis Nee 1 2 3 4 Onverdund Percoll (ρ = 1,130) (ml) 2.96 5.92 8.88 11.84 1,5 M NaCl (ml) 0.6 1.20 1.8 2.4 gedestilleerd H2 O (ml) 2.44 4.88 7.32 9.76 Volume van de uiteindelijke werken verdunning 6 ml 12 ml 18 ml 24 ml - Het aantal Percoll buizen afhankelijk van het aantal cellen bepaald in stap 3.1.8 en / of 3.1.14. Combineer de steriele oplossingen en meng. Voor een optimale isolatie, kan 0.6-1 x 10 9 cellen per buis van Percoll worden geladen. Combineer de steriele oplossingen en meng.
Tip: Percoll is lichtgevoelig en bovendien koud moet worden bewaard. Maak eerst het mengsel dat het NaCl en H2O (RT) en voeg onverdund Percoll duur, net voor het resuspenderen van de cellen in de Percoll oplossing.
tent "> NB: Percoll dichtheid kan variëren tussen de verschillende leveranciers en batches Als de dichtheid van de onverdunde Percoll oplossing is niet gelijk aan 1,130 g / ml, gebruik dan de instructies van de fabrikant om de exacte bedragen van Percoll en H 2 O te berekenen vereist om een uiteindelijke dichtheid van 1,07 g / ml te krijgen.- Resuspendeer tot 1 x 10 9 cellen in 6 ml van de bereide Percoll oplossing (ρ = 1.07), meng voldoende om een homogene suspensie te krijgen, en transfer naar een 50 ml Oak Ridge polycarbonaat schroefdop centrifugebuis.
- Layer voorzichtig 30 ml RPMI compleet per buis met een pipet bovenop de Percoll oplossing / celsuspensie. Laad het medium langzaam, zodat het blijft bovenop de suspensie en verzorgen de laag niet te verstoren.
- Weeg de buizen om ervoor te zorgen dat zij dezelfde gewichten, zodat ze in balans tijdens het centrifugeren. Als ze niet voorzichtig meer medium toe te voegen aan de lichtere buis (onder sterile voorwaarden).
- Breng zorgvuldig de buizen naar een vooraf gekoelde centrifuge met vaste hoek rotor en centrifugeren bij 3.500 g gedurende 35 min bij 4 ° C met de rem uit. Zorg ervoor dat de temperatuur van de centrifuge niet hoger dan 4 ° C.
- Verwijder buizen uit de centrifuge en voorzichtig verzamel de verrijkte APC, gevonden op interfase tussen Percoll midden (lage-dichtheid-fractie) van elke buis met behulp van een steriele Pasteur pipet. Overdracht cellen in een 50 ml buis met koud RPMI compleet. Vul de buis om te verdunnen de resterende Percoll.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. Gooi supernatant en herhaal wassen.
- Resuspendeer de celpellet in middelgrote en bepaalt het aantal cellen (met trypan blauw en een hemocytometer). In onze ervaring, het percentage van de cellen LDF ongeveer 2-20% van de totale enkelvoudige celsuspensie verkregen na enzymdigestie. Een typische yfield van de lage dichtheid verrijkte cellen (van een jonge thymus, bereik 1 dag-2 jaar) is 1x10 8 cellen per 1 x 10 9, wat neerkomt op een 10% van de alleenstaande totale celsuspensie cellen.
NB: In dit stadium kunt u zien dat cellen geaggregeerd in de suspensie (vooral met monsters van kinderen van oudere leeftijd). Celklonten zijn indicatie van celdood en resultaat van de introductie van DNA van de stervende cellen die cellen aan elkaar kunnen plakken. In dat geval voegt DNase I in het monster (50 ug / ml) en incubeer voor maximaal 20 minuten bij kamertemperatuur (voorzichtig omkeren elke 5 minuten) het vrije DNA-moleculen verteren.
5. Isolatie van Thymic mDC
Na APC verrijking (via Percoll scheiding) kan mDC efficiënt worden geïsoleerd van de LDF na de eerste en tweede ronde van enzymatische ontsluitingen. Het volgende protocol is een aangepaste versie van magnetische celscheiding voor de isolatie van mDC (CD11c +).
- Centrifugeer APC verrijkte cellen geisoleerd uit de enkele celsuspensie verkregen uit de samengevoegde eerste en tweede enzymatische digestie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer celpellet in 100 pl MACS buffer per 10 7 cellen.
- Voeg 5 ul van CD11c-PE antilichaam per 10 7 cellen.
Opmerking: Titratie-experimenten worden aanbevolen voor optimale resultaten.
- Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
- Was de cellen door toevoeging van 1-2 ml MACS buffer per 10 7 cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten.
- Zuig supernatant volledig Resuspendeer maximaal 10 7 cellen in 80 ui MACS-buffer.
- Voeg 20 ul anti-PE microbolletjes per 10 7 cellen.
- Meng goed (Do Not Vortex) en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht.
- Herhalen als in stap 5.4.
- Resuspendeer tot 10 8 cellen in 500 pi buffer.
- Eventueel filter celsuspensie met een 40 um cel zeef om vuil en celaggregaten die de stroom van de kolom kan belemmeren te verwijderen.
- Gebruik een LS kolom sinds thymus celsuspensies stromen beter door de LS kolommen. Bereid LS kolom volgens de instructies van de fabrikant. Pipet celsuspensie langzaam in de kolom vermijden genereren bubbels. Gebruik een kolom voor elk 1 x 10 8 cellen.
- Waskolom volgens de instructies van de fabrikant. Verwijder kolom magneet en plaats deze in een steriele 12 ml ronde bodem polypropyleen buis. Voeg 3 ml MACS buffer op de kolom en verzamel magnetisch gemerkte cellen door het plaatsen en stevig de zuiger in de kolom.
- Verzamel de geëlueerde fractie die de CD11c + mDC en centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 minuten.
- Bepaal het aantal cellen en bevestig zuiverheid van de geselecteerde cel populatiesdoor flowcytometrische analyse. Stelde merkers omvatten CD45, CD11c en HLA-DR.
Opmerking: CD 11 c + mDC kunnen ook worden geïsoleerd met behulp van een FACS sorter.
6. Verrijking van CD45 lo / neg Cellen voor Cell Sorting van TEC
Voor isolatie van TEC, de cellen kunnen vooraf worden verrijkt door uitputting van CD45 hi cellen met behulp van CD45 microbeads, om te versnellen hun isolement via cel sortering.
Gebruik enkele celsuspensie verkregen uit de 3e digestiestap (3.1.14) en vervolgens gescheiden op Percoll centrifugeren.
- Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer celpellet in 80 ui MACS buffer per 10 7 cellen.
- Gebruik CD45 microkorrels 1/3 van de aanbevolen hoeveelheid (6,7 pl) per 10 7 cellen.
Opmerking: Door het gebruik van een lager bedragvan de microbolletjes we vooraf verrijken cellen voor zowel CD45 lo en CD45 negatieve cellen. Titratie wordt aanbevolen voor een optimaal resultaat.
- Meng goed door voorzichtig flicking de buis (Do Not Vortex) en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Wash ongebonden microkorrels door toevoeging van 10 ml MACS-buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 xg bij 4 ° C. Aspireren supernatans volledig.
- Resuspendeer tot 10 8 cellen in 500 pi buffer.
- Eventueel filter celsuspensie met een 70 um cel zeef om vuil en celaggregaten die de stroom van de kolom kan belemmeren te verwijderen.
- Gebruik een LS kolom sinds thymus celsuspensies stromen beter door de LS kolommen. Bereid LS kolom volgens de instructies van de fabrikant. Pipet celsuspensie langzaam in de kolom vermijden genereren bubbels. Gebruik een kolom voor elke 10 8 cellen.
- Verzamel ongelabelde cellen (doorstroom en wassingen) bevattendede CD45 lo / neg celfractie en wassen kolom volgens de instructies van de fabrikant.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer celpellet in steriele FACS buffer om het aantal cellen te bepalen en verder met kleuring op celsortering.
7. Stain Cellen voor fluorescentie geactiveerde celsortering
- Voer de FcR blokkeren vóór cel kleuring, om niet-specifiek antilichaam binding reduceren. Incubeer celsuspensie met gepoolde humane immunoglobulinen oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Deze reagentia zijn commercieel verkrijgbaar (bijvoorbeeld Gammunex 10% oplossing).
- Was de cellen door toevoeging van koude steriele FACS-buffer. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C.
- Gooi supernatant en resuspendeer cellen in koude steriele FACS buffer. Bereid 5 monsters volgens het volgende voorbeeld:
Monster Monstertype Antilichaam Aantal cellen Totale volume 1. onbevlekt controle 1 x 10 6 50 gl 2.scc *-Pacific Blue controle CD45-Pacific Blue 1 x 10 6 50 gl 3. scc-APC controle CD3-APC 1 x 10 6 50 gl 4.scc-Alexa 488 controle CD8-Alexa 488 1 x 10 6 50 gl 5. Celsortering analyt CD45-Pacific Blue
EpCAM-APC
CDR2-Alexa 48810 x 10 6 - 50 x 10 6 500 pi
10 x 10 6 cellen/100 pi* Scc; enkele kleur controle
- Incubeer de cellen met antilichamen gedurende 30 min op ijs in het donker.
- Tweemaal wassen met FACS-buffer cellen door centrifugeren bij 400 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C.
- Stel de celconcentratie van het monster wordt gesorteerd tot 1 x10 7 cellen / ml (of de concentratie aanbevolen door celsortering faciliteit) met steriele FACS buffer voor celsortering (dwz zonder NaN3).
- Passeren cel monster door een 70 um cel zeef om elke cel klonten die de cytometer kunnen verstoppen tijdens het sorteren te verwijderen.
- Resuspendeer controlemonsters 200-400 gl buffer. Houd buizen op ijs en beschermd tegen licht.
- Bereid collectie buizen met medium.
Opmerkingen:
- Voer titratie van antilichamen voor optimale kleuring.
- In een monster sorteren, kan tot 50 x 10 6 cellen worden gekleurd in een totaal reactievolume van500 pi.
- Voer kleuring van het monster te sorteren in 5 ml Falcon polystyreen ronde bodem buizen. De uniforme kleur controles kan worden gekleurd in afzonderlijke putjes van een 96-well plaat.
- Omdat TEC subsets zijn zeldzaam bevolking, is het raadzaam om een ander positief marker (van hoge frequentie) gebruiken voor elke fluorochroom om de bepaling van de juiste FACS instellingen te vergemakkelijken en ervoor te zorgen dat u de juiste vergoeding indien de keuze van fluorochromen vereist compensatie. Cellen van de CD45 + fractie kan worden gekleurd met merkers zoals CD45, CD3 en CD8 voor verschillende fluorochromen en na kleuren ongekleurde CD45 + cellen kunnen worden toegevoegd aan het monster.
8. Isolatie van TEC door Fluorescence Activated Cell Sorting
TEC subsets kan worden gesorteerd van de CD45 lo / negatieve fractie als EpCAM hi CDR2 - (MTES) of EpCAM lo CDR2 + (CTEC).
- Laat het monster with de ongekleurde cellen en de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing om de bevolking van belang in schaal plaatsen aanpassen. Regel de spanning op elke detector zodat de cellen zichtbaar maar ligt in het meest linker deel van het histogram.
- Run elke afzonderlijke lood monster en compensatie voor elke kleur aan te passen.
- Na het aanpassen van de spanning en de compensatie voor de ongekleurde en enkele gebrandschilderde controles uitvoeren van de steekproef te worden gesorteerd en gebruik gating tools om de bevolking van belang te definiëren. Gebruik een brede voorwaartse en zijwaartse verstrooiing poort naar inclusie van alle stromale cel maten zorgen, terwijl exclusief cel puin.
- Op de stip perceel met CD45-Pacific Blue versus Forward Scatter hek aan de CD45 lage en CD45 negatieve cellen.
- Pas deze poort naar een EpCAM versus CDR2 dot plot en bepalen door gating de bevolking te sorteren.
- Zodra poorten zijn bepaald, selecteert u de poorten die de bevolking van belang en beginnen te sorteren.
- heb Zodra gesorteerde cellen zijn verzameld, centrifuge de celsuspensie en resuspendeer cellen in medium of buffer van keuze, afhankelijk van de beoogde toepassing stroomafwaarts.
Opmerking: Bij sortering om cellen te voorkomen dat aan de wanden van de verzamelbuis, de buis kan vooraf worden bekleed met vullen met 50% FCS in PBS en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Gooi de coating oplossing voor het toevoegen collectie media.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Als uitgangsmateriaal in dit protocol gebruiken wij thymus weefsel verwijderd uit kinderen die corrigerende cardiovasculaire chirurgie (Ministerie van Borst en Cardiovasculaire Chirurgie, universiteitskliniek Tübingen) verkregen na geïnformeerde toestemming en onder institutionele richtlijnen. Deze afgedankte materiaal kan sterk variëren in grootte 2-30 g of meer. Het aantal mDC en TEC subsets (Ctec en MTES) die worden verkregen afhankelijk van de grootte en de leeftijd van de thymus weefselmonster gebruikt voor isolati...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven protocol is een modificatie van het protocol gepubliceerd door Gotter c.s. 4. Kritische stappen in het protocol zijn de initiële toestand en voorbereiding van de weefsels alsmede de Percoll dichtheid scheiding. We raden aan het weefsel zo snel mogelijk na verzameling te verwerken. Het is belangrijk om snel maar grondig werken bij het schoonmaken en snijden van het weefsel. Tijdens de thymocyt wassen in stap 2.3 beschreven, is het cruciaal om de juiste balans te vinden bij het uitoe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflict verklaard.
Dankbetuigingen
Wij zijn dankbaar voor de chirurgen van de afdeling Thorax-en Cardiovasculaire Chirurgie, Universiteitskliniek Tübingen voor het verstrekken van ons met de thymus monsters en Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Duitsland) voor het verstrekken van de CDR2 antilichaam. We willen ook graag Hans-Jörg Bühring en Sabrina Grimm bedanken van de sorteerinrichting (Universiteit van Tübingen). Dit werk werd ondersteund door de SFB 685 en de Hertie Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagenten en materialen | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal bovien serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovien serum albumine | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, graad II bovien pancreatisch | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Proteïnelabeling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-menselijk CDR2 (gezuiverd) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Duitsland | gelabeld met Alexa Fluor 488 | |
| anti-menselijk CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-menselijk EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-menselijk CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, menselijk | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS kolommen | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | voor weefsel dissociator |
| Percoll (dichtheid 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Steriele gedestilleerd water (DNAse/ RNAse vrij) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 voorverdunning, gebruik 20 μl/1 x 106cellen |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Spuitgedreven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pompgedreven |
| 50 ml PC oak ridge centrifugebuizen | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conische buizen | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml testbuizen | Becton Dickinson | 352058 | FACS kleuringen |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTEN | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | weefsel dissociator |
Referenties
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
- Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
- Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
- Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
- Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
- Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
- Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
- Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
- Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
- Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
