Methodenartikel

High-throughput Fluorometrische Meting van Potentiële Soil Extracellular Enzyme Activiteiten

51.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50961

⸱

15 november 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Natural Resource Ecology Laboratory, Colorado State University, 2Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering, University of Colorado

In dit artikel

Samenvatting

Om mogelijke tarieven van de bodem extracellulair enzym activiteiten te meten, zijn synthetische substraten die zijn gebonden aan een fluorescerende kleurstof toegevoegd aan bodemmonsters. De enzymactiviteit wordt gemeten als de fluorescerende kleurstof wordt vrijgemaakt uit het substraat door een enzym gekatalyseerde reactie, waarbij hoger fluorescentie geeft meer substraat afbraak.

Samenvatting

Microben in de bodem en andere omgevingen produceren extracellulaire enzymen depolymeriseren en hydrolyseren biologische macromoleculen zodat deze kan worden opgenomen energie en voedingsstoffen. Meten bodem microbiële enzymactiviteit is cruciaal in het begrijpen bodemecosysteem functionele dynamiek. Het algemene concept van de fluorescentie enzym assay is dat synthetische C-, N-of P-rijke substraten gebonden met een fluorescente kleurstof worden toegevoegd aan bodemmonsters. Wanneer intact, niet de gelabelde substraten niet fluoresceren. De enzymactiviteit wordt gemeten als de toename in fluorescentie als het fluorescente kleurstoffen zijn gesplitst van de substraten, waardoor ze fluoresceren. Enzym metingen kunnen worden uitgedrukt in eenheden van molariteit of activiteit. Om deze analyse uit te voeren, worden de bodem slurries bereid door aarde met een pH buffer. De pH buffer (gewoonlijk 50 mM natriumacetaat of 50 mM Tris-buffer), wordt gekozen voor bepaalde zure dissociatie constante (pKa) van de buffer te passen aan de bodem sample pH. De bodem slurries worden geïnoculeerd met een beperkende hoeveelheid van fluorescent gelabelde (bijvoorbeeld C-, N-of P-rijk) substraat. Bodem-slurries in de test dient om beperkingen enzym en substraat diffusie minimaliseren. Daarom is deze test controles voor verschillen in substraat beperking diffusiesnelheden en pH-omstandigheden, dus detecteren potentiële enzymactiviteit tarieven als functie van het verschil in enzymconcentraties (per monster).

Fluorescentie enzymassays zijn meestal gevoeliger dan spectrofotometrische (dwz colorimetrische) assays, maar kunnen last hebben van interferentie veroorzaakt door onzuiverheden en de instabiliteit van vele fluorescente verbindingen bij blootstelling aan licht, dus voorzichtigheid is geboden bij het ​​hanteren van fluorescerende substraten. Ook deze methode beoordeelt enige potentiële enzym activiteiten onder laboratoriumomstandigheden als substraten niet beperkend zijn. Voorzichtigheid moet worden betracht bij de interpretatie van de gegevens die kruisTer plaatse vergelijkingen met verschillende temperaturen of grondsoorten, zoals in situ grondsoort en temperatuur enzymkinetiek beïnvloeden.

Inleiding

Extracellulaire enzymen (EWS), geproduceerd door bodembacteriën, schimmels, en archaea zijn betrokken bij talloze biogeochemische processen, en staan ​​centraal in de verwerking, stabilisatie en destabilisatie van organische stof en nutriënten cycli in terrestrische ecosystemen 1. Door het produceren van EE, bodemmicroben ontleden en transformeren polymeer organisch materiaal in kleinere oplosbare moleculen, waardoor het bevrijden eerder gebonden micro-en macronutriënten, waardoor planten en microben beschikbare voedingsstoffen te assimileren uit de bodem. EE werden onderzocht voor tientallen jaren, voornamelijk door het meten van hun activiteiten laboratoriumbepalingen 2-4, omdat het zeer moeilijk direct te detecteren en te kwantificeren enzymen.

Extracellulaire enzymactiviteit (EEA) het sterkst geregeld door de concentratie van enzymen en overeenkomstige substraten. De overvloed van verschillende C-, N-en P-afbrekende enzymen in de bodem wordt bepaald door talrijke factoren including microbiële biomassa, gemeenschap, beschikbaarheid substraat, microklimaat en stoichiometrische eisen 5,6. Echter, in situ EEA in de bodem milieu worden ook beïnvloed door de temperatuur 7,8, de binding van enzymen om de bodem klei en humus eigenschappen 2 en diffusie beperkingen 9, die uiteindelijk regelen het actief enzym zwembad, in termen van grootte, beschikbaarheid substraat , en personeelsverloop 10-12. Daarom erkennen in situ bodemgesteldheid is van cruciaal belang bij het ​​gebruik van laboratorium enzymbepalingen naar bodem microbiële functie interpreteren over verschillende milieu-sites.

Veel verschillende klassen van de EER kan worden gekwantificeerd in het laboratorium testen met behulp van een verscheidenheid van synthetische substraten (zie "Lijst van reagentia Table" voor meer details). Sommige protocollen gebruiken substraten in testen die zijn gekoppeld met een colorimetrische reactie die kan worden gedetecteerd met een spectrofotometer, while anderen, met inbegrip van het protocol beschrijven we hier gebruik maken van substraten die zijn gebonden aan een fluorescerende groep. Fluorescentie EE assays zijn meestal gevoeliger (door een orde van grootte) dan colorimetrische assays (die een chromogene groep verbonden met een synthetisch substraat gebruikt) 12-14. Gevoeligheid van detectie EER omvat twee aspecten: is gecorreleerd met de hoeveelheid van de verbinding van belang gedetecteerd en de andere de laagst mogelijke detecteerbare enzymactiviteit. Methoden voor colorimetrische P-nitrofenol (PNP)-gebaseerde testen is te vinden in het verleden werkt 15,16. Kortom, de bodem (typisch gezeefd <2 mm en aan de lucht gedroogd) wordt geïncubeerd bij optimale of veld-relevante temperatuur en pH. De snelheid waarmee het reactieproduct model colorimetrisch bepaald met een spectrofotometer 14. De hogere gevoeligheid van de fluorescentie enzym assays is deels te wijten aan de meer gevoelige detectie van het fluorogene groep scheiding verbonden substrat afbraak plaats van opname absorptie na afscheiden van specifieke chromogene groep op een specifieke golflengte. De twee meest gebruikte synthetische fluorescente indicatoren 4-methylumbelliferon (MUB) 17 en 7-amino-4-methylcumarine (MUC) 18,19. MUC-gekoppelde substraten worden vaak geassocieerd met N-rijke synthetische substraten zoals eiwitten en / of aminozuren. Fluorescerende technieken werden voor het eerst ontwikkeld voor aquatische monsters 20,21, en ​​de toepassing ervan op de bodem vereist controles voor signaal afschrikken en interferentie 22,23. Testen kan zowel worden uitgevoerd met behulp van traditionele "bench top" chemie met grote volumes, of kan worden gebruikt in microplaat-protocollen, met verhoogde doorvoersnelheid maar mogelijk hogere meetfout. Terwijl er verscheidene veelvuldig geciteerd protocollen voor fluorescentiedetectie van EEA in de bodem 24 veel laboratoria gebruiken subtiele variaties op deze protocollen vaak per ongeluk of door verschils in het laboratorium apparatuur of reagentia. Ogenschijnlijk kleine verschillen in de details van de protocollen kan sterk van invloed zijn gemeten EEA 25,26 en het ontbreken van gestandaardiseerde enzymen maakt het een uitdaging om analyses tussen verschillende laboratoria te kalibreren. Er is dus een belangrijke behoefte voor de verspreiding van gedetailleerde protocollen aan de standaardisatie van de EER-testen aan te moedigen.

In ons protocol worden grondmonsters bereid door grondmonsters met een pH-buffer en homogeniseren met een blender. De suspensies worden vervolgens geïnoculeerd met een beperkende hoeveelheid van fluorescent gelabelde C-, N-of P-rijke substraat gekozen afhankelijk van de specifieke vraagstelling plaats. Bodem-slurries in de enzymtesten dient als controle diffusie beperkingen substraat te minimaliseren. De fluorescerende resten geblust totdat ze gesplitst van hun respectievelijke substraten en dus enzymactiviteit kan worden gedetecteerd als de fluorescerende kleurstof wordt vrijgemaakt uit het substraat by een enzym gekatalyseerde reactie. De toenemende fluorescentie-intensiteit door de tijd geeft de snelheid van de enzym-gekatalyseerde reactie.

Het algemene concept van de fluorescentie enzym assay is dat synthetische substraten gebonden met een fluorogene groep (fluorescente kleurstof), wordt toegevoegd aan bodemmonsters 27. Tijdens enzymgekatalyseerde substraat degradatie, de band breekt tussen de fluorescerende kleurstof en het substraat. De fluorescerende kleurstof vrijgemaakt uit het substraat wordt derhalve gebruikt als een indirecte evaluatie van enzymactiviteit en kan worden gekwantificeerd met behulp van een microplaat lezer naar de fluorescentie-intensiteit van de kleurstof te detecteren. In het kort wordt de fluorescentie kwantificering volbracht als de vrijgekomen kleurstof licht uitzendt van een golflengte na het absorberen van licht van een andere golflengte. De fluorescentie-intensiteit wordt geregistreerd door een plaatlezer staat om zowel excitatie en detectie. Enzymactiviteit kan vervolgens gekwantificeerd op basis van de bekende fluorescerende kleurstof concentrations van het substraat (dwz bekend hoeveelheden synthetisch substraat toegevoegd grondmonsters) met verwijzing naar een standaard verdunningscurve van fluorescentie-intensiteiten voor de specifieke fluorogene groep van het substraat in de test (bijvoorbeeld 4-methylumbelliferon (MUB) of 7-amino -4-methylcumarine (MUC)). (Zie de sectie protocol voor specifieke details over enzymactiviteit kwantificering).

Laboratorium bodem enzym assays zijn nuttig voor de beoordeling microbiële functie, maar er zijn verschillende technische beperkingen die gebruikers moeten erkennen 10. Fluorescentie-assays kunnen last hebben van interferentie veroorzaakt door onzuiverheden en / of instabiliteit van veel fluorescerende verbindingen bij blootstelling aan licht, dus voorzichtigheid is vereist bij het ​​hanteren fluorescerende substraten 25. Bodem deeltjes en / of organisch materiaal in de bodem suspensies kunnen ook interfereren met fluorescentie-intensiteiten, bekend als het quenching effect 26.Bovendien laboratorium enzymassays beoordeelt enige potentiële EEA onder laboratoriumomstandigheden. In vitro testen meten EEA onder omstandigheden waarbij substraat diffusie en overvloed is niet beperkend. Daarom kan de door deze assays gegevens geen goede proxy voor EDEO onder in situ bodemgesteldheid 10. Kortom, enzymactiviteit is zeer nuttig voor relatieve vergelijkingen waarbij bodemtypes soortgelijk. Echter, bij het gebruik van deze methode om activiteiten te vergelijken tussen verschillende bodems die verschillen in fysische of chemische eigenschappen, moet voorzichtigheid worden betracht. Dit komt door het feit dat verschillen in grondsoort en temperatuur drastisch de staat kan veranderen in situ enzymkinetiek. Een andere beperking is dat relatief weinig substraten zijn commercieel verkrijgbaar (vergeleken met de natuurlijke omgeving). Bovendien is de synthetische substraten gebruikt voor enzymbepalingen zijn relatief eenvoudig (gemakkelijk oplosbaar) kan niet nauwkeurig de bodem aanwezige substraten of beschik vertegenwoordigene in situ. Een andere factor die meespeelt is dat het gebruik van de bodem slurry zal de activiteit van sommige gestabiliseerde enzymen (dwz geïmmobiliseerd door organische stof of klei) die niet actief kunnen zijn onder in situ-omstandigheden 2 op te nemen. Laboratorium enzymassays ook geen informatie verstrekken over de persistentie van enzymen in de bodem (enzym omzet tarieven) of informatie over het specifieke microbiële soorten die produceren bodem enzymen.

Protocol

1. Assay Set-up

  1. Label 3 diepe putjes: "Voorbeeld", "MUB standaard", en "MUC standaard".
  2. Voor elk standaard (MUB van 0, 2.5, 5, 10, 25, 50 en 100 uM) en het substraat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) in afzonderlijke schoon, prelabeled reservoirs (georiënteerd in rijen) .
  3. Pipetteer de juiste MUB standaard in overeenkomstige putjes van MUB standaard plaat (Tabel 1).
    1. Pipetteer 200 ul van 0 uM MUB in rij A van MUB standaard plaat.
    2. Pipetteer 200 ul van 2,5 uM MUB in rij B van MUB standaard plaat.
    3. Pipetteer 200 ul van 5 uM MUB in rij C van MUB standaard plaat.
    4. Pipetteer 200 ul van 10 uM MUB in rij D van MUB standaard plaat.
    5. Pipetteer 200 ul van 25 uM MUB in rij E van MUB standaard plaat.
    6. Pipetteer 200 ul van 50 uM MUB in rij F van MUB standaard plaat.
    7. Pipetteer 200 ul van 100 μM MUB in rij G van MUB standaard plaat.
    8. Herhaal de stappen 1.3.1 - 1.3.8 voor MUC normen in overeenkomstige putjes van de MUC standaard plaat.
  4. Prep bodem slurries voor elk bodemmonster.
    1. Weeg 2,75 g van het veld vochtige grond in de blender.
    2. Voeg 91 ml van 50 mM buffer. Blend op hoog voor 1 min.
    3. Giet blender inhoud in een schone glazen schaal ten minste even breed als 8-kanaals pipet met een roerstaafje.
    4. Plaats op roerplaat, mix bodem drijfmest op laag.
    5. Pipetteer 800 ul van de bodem slurrie in de eerste kolom van het plaat van de steekproef (tabel 2).
    6. Herhaal in 1 ste kolom van MUB norm en MUC standaard platen (Tabel 1).
    7. Spoel blender, roerplaat en roerstaaf met DI-H 2 O of buffer tussen bodemmonsters.
    8. Herhaal de stappen 1.4.1 - 1.4.7) voor elk monster, verhuizen naar de volgende kolom bij elk volgend grondmonster (tabellen 1 en2).
  5. Pipetteer de juiste substraat (in dit voorbeeld 200 uM concentraties) in overeenkomstige putjes van de plaat van de steekproef (tabel 2).
    1. Pipetteer 200 ul van BG substraat in rij A van de plaat van de steekproef.
    2. Pipetteer 200 ul van CB substraat in rij B van de plaat van de steekproef.
    3. Pipetteer 200 ul van NAG substraat in rij C van de plaat van de steekproef.
    4. Pipetteer 200 ul van PHOS substraat in rij D van de plaat van de steekproef.
    5. Pipetteer 200 ul van XYL substraat in rij E van plaat van de steekproef.
    6. Pipetteer 200 ul van AG substraat in rij F van de plaat van de steekproef.
    7. Pipetteer 200 ul van LAP substraat in rij G van de plaat van de steekproef.
    8. Herhaal de stappen 1.5.1 - 1.5.7 voor elke incubatie temperatuur monster plaat.

2. Incubatie van assayplaten

  1. Dicht de deep-well platen ("Voorbeeld", "MUB standaard", en "MUC standaard4 ;) met plaat matten.
  2. Inverteren elk (verzegeld) plaat met de hand tot de oplossing goed gemengd (~ 10x).
  3. Plaats platen in geschikte incubator vereiste incubatietijd periode (Tabel 3).
  4. Noteer de eerste keer als Time 0. Nemen ook de geschikte incubatietijd, zodat je weet wanneer je de plaat uit de incubator (tabel 3) te verwijderen.
  5. Aan het einde van elke incubatieperiode gecentrifugeerd afgedichte platen gedurende 3 min bij ongeveer 2900 x g.
  6. Na certificering, transfer 250 ul van elk putje van de bebroede diepe putjes in overeenkomstige putten in zwarte platte bodem 96-well platen (een zwarte plaat zal worden gebruikt voor elke bebroede deep well plaat). Het is belangrijk om monsters te brengen van de geïncubeerde diepe putjes in dezelfde putjes (bijvoorbeeld A1 ... A12, enz.) in de zwarte platte bodem 96-putjes platen (Tabel 1, 2).

3. Fluorescerende Metingen aaneen Microplaat Fluorometer

  1. Na instructies van de fabrikant voor de fluorometrische plaat lezer gebruikt, stelt u de excitatie golflengte 365 nm en emissie golflengte van 450 nm (of gebruik de juiste filters).
  2. Lees de drie platen op de fluorometer. Belangrijk: samples en standaard platen (dwz MUB of MUC) moet worden gelezen met behulp van dezelfde winst.
    1. Stel de spectrofotometer om automatische versterking en lees de MUC en MUB Standaard platen.
    2. Set winst op handmatig, en de waarde te verlagen van optimaal naar de volgende laagste aantal, afgerond op de dichtstbijzijnde vijf, voor elke standaard plaat. Herhaal 2x voor elke plaat.
    3. Stel de gain automatisch en draaien de plaat van de steekproef. Voer de plaat van de steekproef handmatig naar de hoogste winst voor elk van de standaard platen (dwz MUB en MUC) overeenkomen.

4. Data Analysis

  1. Voer standaard curve fluorescentie gegevens in spreadsheet voor MUB (tabel 4a) En MUC standaard (tabel 4b)
    1. Converteren (uM) concentraties (umol) (tabellen 4a en 4b).
  2. Voor standaard curve fluorescentiegegevens elk monster, het berekenen van de helling, de y-as, en R2-waarden voor MUB en MUC (umol) standaard concentraties. Acceptabel R 2 waarden hoger mag zijn dan 0,98 voor elk monster (tabellen 4a en 4b). Het kan nuttig zijn standaard curves visualiseren in een scatterplot zijn, met fluorescentie leest uitgezet als afhankelijke variabele (y-as) en standaardconcentratie (umol) uitgezet als de onafhankelijke variabele (x-as) (figuur 1).
  3. U vindt de MUB en MUC standaard stooklijn en de y-as waarden gebruiken om het monster + substraat ruwe fluorescentie gegevens in potentiële EEA berekenen. U moet eerst het monster + substraat ruwe fluorescentie gegevens invoeren in een nieuwe spreadsheet (tabel 5a ). Je moet ook de incubatietijd (hr) en de bodem droog gewicht, voor elk monster (tabel 5b) in te voeren. Merk tijd-waarden in dit voorbeeld opgenomen zijn 3 uur, omdat de monsters werden geïncubeerd bij 25 ° C (tabel 3).
    1. Trek de standaard curve interceptwaarden van het overeenkomstige monster fluorescentie waarden en vervolgens delen door de helling van de overeenkomstige standaard curve (tabel 5c). Om dit te bereiken, herschikken standaard lijn vergelijking op te lossen voor het monster enzym concentratie (x), x = (yb) / m waarin: [y = monster fluorescentie rauwe lezen; b = onderscheppen van MUB of MUC Standard curve; m = helling van MUB of MUC Standard curve].
    2. Vermenigvuldig monster umol, uit stap 4.3.1 hierboven, met 91 ml (buffer volume gebruikt in de bodem suspensie) (tabel 5d).
    3. Waarde kloof in stap 4.3.2 verkregen door het monster-specifieke incubatietijd en droge grond massa (Tabel 5e): [enzym amt. (& #956; mol) x 91 ml x incubatie (hr) x droge grond (g) x 0,8 ml x 1.000]
      Opmerking: 0.8 ml = het volume van slurry in elk putje en 1000 corrigeert de eigenlijke bodem hoeveelheid in elk putje.
    4. Vermenigvuldig de in stap 4.3.3 verkregen door 1000 om de gewenste eenheden (nmol activiteit / g droge grond / uur) (tabel 5f) krijgen waarde.

Resultaten

Enzym assays kunnen worden gebruikt om potentiële EEA kwantificeren en kan vergelijken onder gelijkaardige monsters. Hier presenteren we representatieve resultaten van een experimentele klimaat studie waarbij bodems die omgevingsomstandigheden klimaatomstandigheden (ACN) ervaren om bodems die werden blootgesteld aan verhoogde CO2 en verwarming behandelingen (EHN) (figuren 2-6). Plantendek in alle percelen waren karakteristiek van een noordelijke gemengde grasprairie gedomineerd door de C4 gras Bouteloua gracilis (HBK) Lag. en twee C3 grassen, Hesperostipa comata Trin en Rupr. en Pascopyrum smithii (Rydb.); ongeveer 20% van de vegetatie bestaat uit zegge en forbs. Meer informatie over de site beschrijving en veld experimenteel design kan worden gevonden in de referenties 28-30. Bodems werden verzameld uit twee verschillende dieptes (0-5 cm en 5-15 cm) binnen elk van de behandeling percelen met behulp van een 1,5 cm diameter kern bodem EEA beoordelen in reactie op veranderde klimaat caarden. In onze voorbeelden (dwz figuren 2-6), de steekproefgrootte is (N = 3). Ongeacht deze minimale steekproefomvang, de variatie is relatief klein in de meeste gevallen (zoals aangetoond door de fout bars) en robuust weerspiegelt variabiliteit in potentiële EEA onder behandeling percelen. Variantie-analyse (ANOVA) en Tukey post hoc meerdere vergelijkingen werden gebruikt om significante verschuivingen in enzymactiviteit onder behandeling plots en bodemlagen te identificeren.

De volgende representatieve resultaten zijn verstrekt om aan te tonen hoe deze high-throughput, kan fluorometrische assay gebruikt worden om (1) de totale EER-testen in de bodem, (2) hoe EER stoichiometric indicatief van het ecosysteem-niveau processen kunnen zijn en (3) de relatie tussen incubatie temperatuur en de EER. Bodem EMA worden vaak bestudeerd om verschuivingen in de microbiële functie betreffen nutriëntverdeling fietsen; nuttige indicatoren voor microbiële voedingsstoffen eisen te beoordelen in antwoord op de klimaatverandering, plantengemeenschap shifts, en meer in het algemeen ecosysteemwerking 31-33. EER stoichiometric is recentelijk aangenomen als een index voor de bodem biochemische cycli van voedingsstoffen beoordelen door het kruisende ecologische stoichiometrische theorie en metabole theorie van ecologie aan potentiële onevenwichtigheden microbiële voedingsstoffen die overeenkomen met de omgevingsomstandigheden 5 beoordelen. Talrijke studies hebben gesuggereerd dat grote stoichiometrische verhoudingen zijn een indicatie van voedingsstoffen groei beperkingen 34-36, en als bodem voedingsstoffen worden beperkt, microben reageren door het toewijzen van metabolische middelen om specifieke enzymen te deficiënte voedingsstoffen 37 verwerven produceren. Ecoenzymatic C: N: P stoichiometrie verhoudingen zijn dus bruikbaar relatieve verschuivingen potentiële microbiële gemeenschap voedingsbehoefte in reactie op verschillende milieu verstoringen identificeren 5. Ten slotte kan de temperatuur gevoeligheden van het EDEO nuttig om te beoordelen hoe de bodem microbiële gemeenschap functionele diversiteit waarschijnlijk wordt beïnvloed door de temperatuur verschuivingen zijn 7,38. Enzym temperatuur gevoeligheden kunnen sterk variëren tussen bodems voor een enkel enzym klasse, en microbiële gemeenschappen produceren van enzymen hebben verschuivingen in enzymactiviteit overeenkomt met verschuivingen in het klimaat van de historische omstandigheden 7 aangetoond. Zo enzymactiviteit vragen over de thermische ecologie van EE kunnen een nuttige manier om microbiële functionele dynamiek en ondergrondse ecosysteem processen op reactie op het klimaat verandert 39,40 zijn.

In dit voorbeeld, mogelijke C-, N-en P-enzym verwerving en getest bij 0-5 cm bodemlagen niet verschillen experimentele behandeling (Figuur 2a). Echter, 5-15 cm bodemlagen, verscheidene potentiële EEA niet significant verschillend (Figuur 2b). Bijvoorbeeld, de C-afbrekende enzymen β-1 ,4-glucosidase en β-D-cellobiohydrolase lager in de EHN plots (p ≤ 0,038; figuur 2b) ten opzichte plaatsen ACN. De N-en P-mijnwerkeralizing enzymen (β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase en fosfatase, respectievelijk) waren lager in de EHN plots (p ≤ 0,012; figuur 2b) tegenover ACN 5-15 cm bodemlagen.

Berekenen en plotten van de som van alle C-, N-of-P fietsen potentiële EEA kan een nuttige aanpak voor bredere patronen observeren over mogelijke bodem-C-, N-, en / of P-cycli (figuur 3) zijn. In dit voorbeeld is de som van β-1 ,4-glucosidase, β-D-cellobiohydrolase, β-xylosidase en α-1 ,4-glucosidase potentieel EEA berekend potentiële C fietsactiviteiten vertegenwoordigen. De som van β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase en L-leucine aminopeptidase werd berekend potentiële N fietsactiviteiten vertegenwoordigen. Fosfatase werd gebruikt om potentiële P fietsactiviteiten vertegenwoordigen. In dit voorbeeld potentieel EEA voor de totale C-, N-en P-cycling lager trendparameters in EHN uitzet ten opzichte van de ACN percelen 5-15 cm bodemlagen (Figure 3). Echter, deze trend was alleen van belang voor de totale N en P fietsactiviteiten (p ≤ 0,046; figuur 3). Bodem EEA verschilde niet significant tussen de behandeling plots 0-5 cm bodemlagen (figuur 3). De resultaten van dit voorbeeld suggereren contrasterende trends enzymactiviteit functionele groep (bijvoorbeeld C-, N-of P-afbrekende enzymen) bij de behandeling plots (ACN versus EHN) in responsie op de diepte bodem. Bijvoorbeeld, C-, N-en P-degraderende EEA in de omgevingslucht plots (ACN) vertoonden een hoger bij lagere dieptes vergeleken met bodems blootgesteld aan verhoogde CO2 en verwarming (EHN), die een omgekeerd patroon (Figuur 3a-c aangetoond ).

Enzym stoichiometrie is een andere nuttige op mogelijke enzymactiviteiten in het milieu (figuur 4) te beoordelen. De microbiële vraag naar nutriënten wordt bepaald door de elementaire stoichiometrie van microbiële biomassa met betrekking tot milieubeschikbaarheid van voedingsstoffen 32. Evenzo microben specifieke enzymen (bijvoorbeeld C-, N-of P-afbrekende enzymen) naar voedingsbehoefte in hun bodemmilieus, ook wel ecologische stoichiometrie 41 voldoen. De verhouding van mogelijke EEA is een manier om microbiële voedingsbehoefte beoordelen. Bijvoorbeeld, een 1:1 verhouding tussen twee enzym functionele groepen (bijvoorbeeld in C: N overname voedingsstof) zou suggereren dat de vraag naar N is hoog ten opzichte van de vraag naar C bij het overwegen van microbiële biomassa C: N-verhoudingen op het communautaire niveau typisch 8:01 42. In dit voorbeeld bodem enzym stoichiometrie C: N, C: P of N: P aanzienlijk kunnen verschillen van de behandeling plots 0-5 cm bodemlagen (figuren 4a-c). Echter, potentiële enzym C: P en N: P ratio's waren hoger in de EHN plots in vergelijking met de ACN percelen bij de 5-15 cm bodemlagen (p = 0,05; figuren 4b en 4c). Deze observatie suggereert dat eris relatief hogere P mineralisatie EEA in vergelijking met C en N EER de ACN percelen (in vergelijking met EHN) bij de 5-15 cm bodemlagen. Enzym C: N overnames verhoudingen toonde een soortgelijke trend als aangetoond door totaal C EDEO hogere C: N als gevolg van hogere potentiële C EDEO met de percelen ACN bij de lagere diepte ten opzichte van EHN (Figuur 4a).

De temperatuur kan sterk beïnvloeden bodem EDEO. Maar in typische laboratorium testen bodem enzymen gemeten bij een temperatuur die niet overeenkomen met in situ temperatuur. Onze fluorescentie enzymtest methode stelt ons in staat om te overwegen in situ temperatuur effecten door de integratie van verschillende laboratorium incubatietemperaturen voor vergelijking. Met behulp van laboratorium incubaties op meerdere temperaturen stelt ons in staat om de temperatuur-afhankelijke enzym kinetiek gegevens te analyseren met behulp van Arrhenius plot en Q-10 berekeningen. Arrhenius plot worden gebruikt om activering energie te visualiseren, en zijn ons uitgezeting de logaritme van enzymactiviteit (y-as afhankelijke variabele) als functie van de inverse temperatuur omgezet in graden Kelvin (1 / K) op de x-as (dwz onafhankelijke variabele, figuren 5a-c). Activeringsenergie wordt doorgaans gedefinieerd als de nodig is om een chemische reactie (dwz degraderen een bepaald substraat in kleinere producten) katalyseren minimale energie. Voor ons doel, activatie-energie fungeert als een proxy voor de temperatuurgevoeligheid van enzym-gekatalyseerde reacties. Hogere activeringsenergie geeft enzym temperatuurgevoeligheid. Evenzo activeringsenergieën (dwz figuren 5d-f) rechtstreeks overeen met Q 10 waarden (dwz Figuren 6a-c). Een nadere toelichting op formules die worden gebruikt om de activering van energie en de praktische toepassing te berekenen kan gevonden worden in vele vroegere werkt 40,43-45. Arrhenius percelen, activatie-energie, en Q 10 percelen bieden redundante informatie en mag nietallemaal in dezelfde manuscript gegevens voor publicatie (Figuren 5 en 6). Daarom, wanneer deze technieken, is het noodzakelijk om de meest geschikte plot voor de enzym temperatuur kiezen - kinetische gegevens 10. Alle types perceel (Arrhenius en Q 10) werden hier gepresenteerd voor demonstratiedoeleinden; visuele voorbeelden van hoe enzym resultaten te presenteren bieden.

In ons voorbeeld hebben we onderzocht potentieel enzymkinetiek voor potentiële C-, N-en P-EEA onder zowel behandeling percelen beide bodemlagen (Figuur 5, figuur 6). De bevinding aangetoond dat de temperatuurgevoeligheid van EEA was niet significant verschillend tussen behandelingen percelen van beide bodemlagen voor activeringsenergie zoals aangetoond in de Arrhenius plots (Figuren 5a-c) en overeenkomstige activeringsenergie (figuur df) en (niet verrassend) Q 10 plots (in dit voorbeeld tussen 15 ° C en 25 ° C laboratorium incubaties, Figuren 6a-c). Dit suggereert dat enzymkinetiek niet werden beïnvloed door het veld experimentele behandelingen in dit onderzoek.

figure-results-1
Tabel 1. Diepe put plaat ontwerp voor fluorescentie standaard concentraties met bodemmonsters. Template voor het organiseren en het laden fluorescentie normen (MUB of MUC) met bodemmonsters in de diepe put plaat voorafgaand aan incubatie. Opmerking: De kolommen vertegenwoordigen dezelfde grondmonsters (800 ul van bodem drijfmest toevoegingen). Een gradiënt van fluorescentie standaard concentraties wordt geladen voor elke rij (200 ul toevoegingen). Elke cel vertegenwoordigt fluorescentie standaard concentratie plus bodem drijfmest toevoegingen. Bijvoorbeeld, S1 - S12 vertegenwoordigen bodemmonsters (800 ul van de bodem drijfmest); MUB 0-100 uM = 4-Methylumbelliferone concentraties (200 pl toevoegingen). In dit voorbeeld rij H is geopend, en derhalve beschikbaar om een ​​hogere fluorescentie standaardconcentratie omvatten indien nodig. Deze beslissing aan de standaard curve concentraties verhogen kan nodig zijn voor een hoger potentieel enzymactiviteit (en / of de ondergrond gebruikte concentraties) voor uw specifieke bodemmonsters zijn. Het potentieel enzymactiviteit voor de monsters dient binnen het bereik van de standaardkromme waarden vallen. Klik hier om een grotere tabelweergave .

figure-results-2
Tabel 2. Diepe put plaat ontwerp voor grondmonsters met substraat. Template voor het organiseren en het laden van grondmonsters en substraten in de diepe put plaat voorafgaand aan incubatie. Opmerking: De kolommen geven dezelfde grond monsters (800 pl zoil slurry toevoegingen). Verschillende substraten worden geladen over elke rij (200 ul toevoegingen). Elke cel vertegenwoordigt bodemmonsters plus substraat toevoeging. Bijvoorbeeld, S1 - S12 vertegenwoordigen unieke grondmonsters (800 ul van de bodem drijfmest). Substraten (200 pl toevoegingen) zijn: BG = 4-methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside; CB = 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside, NAG = 4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide; PHOS = 4-methylumbelliferyl fosfaat: XYL = 4-methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside, AG = 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside, en LAP = L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarine hydrochloride. In dit voorbeeld rij H is geopend, en derhalve aan een andere substraat aan andere potentiële enzymactiviteit beoordelen of gewenst zijn. Klik hier om een grotere tabelweergave .

Temperatuur Tijd
4 ° C ~ 23 uur
15 ° C 6 hr
25 ° C 3 hr
35 ° C 1.5 hr

Tabel 3. Incubator temperaturen vereist voor overeenkomstige periodes incubatietijd. Incubation temperaturen en bijbehorende termijnen voor het enzym assay procedure.

figure-results-3
Tabel 4. MUB en MUC standaard curve berekeningen. Laat zien hoe het organiseren van een) MUB en b) MUC ruwe fluorescentie gegevens (umol) om vervolgens te berekenen helling, de y-as, en R-kwadraat waarden. Om helling, de y-as, en R-kwadraat waarden berekenen op basis van uw standaard concentratiecurven, te selecteren (of perceel) deMUB en / of MUC ruwe fluorescentie gegevens als afhankelijke variabele (y-as) en standaardconcentratie (umol) als onafhankelijke variabele (x-as). Opmerking:. MUB = 4-methylumbelliferon; MUC = 7-Amino-4-methylcumarine Klik hier om een grotere tafel te bekijken .

figure-results-4
Tabel 5. . Enzymactiviteit berekeningen zien hoe u een) organiseren monster ruwe fluorescentie gegevens en vervolgens voert u de stappen die nodig zijn (bf) EDEO berekenen in: umol activiteit / g droge grond / uur. Opmerking: S1 - S12 vertegenwoordigen unieke bodemmonsters. Substraten omvatten: BG = 4-methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside; CB = 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside, NAG = 4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide; PHOS = 4-methylumbelliferyl phosphate: XYL = 4-methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside, AG = 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside, en LAP = L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarine hydrochloride. Klik hier om een grotere tabelweergave .

figure-results-5
Figuur 1. MUB standaardcurve plot. Scatterplot visualisatie standaardcurven met rauwe fluorescentie gegevens als afhankelijke variabele (y-as) en standaardconcentratie (umol) als onafhankelijke variabele (x-as).

figure-results-6
Figuur 2. C, N en P fietsen enzym activiteiten. Potentiële EEA op de Prairie Verwarming en verhoogde CO 2 Nlrichment (PHACE) site in controle percelen (ACN: blootgesteld aan omgevingsomstandigheden klimatologische omstandigheden) en de behandeling plots (EHN: blootgesteld aan verhoogde temperatuur en verhoogde CO 2). Bodem enzymen werden getest bij een) 0-5 cm bodemlagen en b) 5-15 cm bodemlagen. Verticale balken geven het gemiddelde ± SE Opmerking: ACN = ambient - klimaat percelen; EHN = verhoogde CO 2 en verwarming percelen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-7
Figuur 3. Totaal C, N en P fietsen enzym stoichiometrische verhoudingen De som van potentiële EEA betrokken zijn bij het ​​verwerven van een) C, b) N, en c) P-voor beide behandelingsgroepen in de PHACE experiment 0-5 cm en 5. - 15 cm bodemlagen. Vertical balken geven het gemiddelde ± SE Opmerking: ACN = ambient - klimaat percelen; EHN = verhoogde CO 2 en verwarming percelen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-8
Figuur 4. Enzym stoichiometrie voor totaal C, N en P fietsen enzym activiteiten Enzym overnames stoichiometrische verhoudingen op de Prairie Verwarming en verhoogde CO 2 Enrichment (PHACE) site in controle percelen. (ACN: blootgesteld aan klimaatomstandigheden ambient) en de behandeling plots (EHN: blootgesteld aan verhoogde temperatuur en verhoogde CO2). Totaal bodem a) C: N, b) C: P en c) N: P werd uitgezet in beide groepen bij 0-5 cm en 5-15 cm bodemlagen. Verticale balken geven gemiddelde ± SE Opmerking: ACN= Ambient - klimaat percelen; EHN = verhoogde CO 2 en verwarming percelen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-9
Figuur 5. . Totaal C, N en P fietsen enzym activeringsenergie Temperatuurgevoeligheid potentiële EEA getoond door middel Arrhenius percelen voor een totaal) C, b) N, en c) P afbrekende enzymen, alsmede de overeenkomstige activeringsenergie waarden voor totaal d) C , e) N, en f) P-afbrekende enzymen onder behandeling plots en diepte bodem op de Prairie Verwarming en verhoogde CO2 Enrichment (PHACE) terrein. Verticale balken voor de activatie-energie (dwz df) vertegenwoordigen gemiddelde ± SE Opmerking: ACN = ambient - klimaat percelen; EHN = verhoogde CO 2 en verwarming percelen. Voor publicatie, is het belangrijk op te merken dat de auteur doorgaans zou kiezen om ofwel Arrhenius percelen (dwz ac) of activering energiewaarden (dwz df), maar niet beide plot-types te presenteren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-10
Figuur 6. Totaal C, N en P fietsen enzym Q10 (15-25 ° C). Temperatuur gevoeligheid potentiële EEA gemeten als Q 10, gebaseerd op laboratorium incubaties bij 15 ° C en 25 ° C voor een) C N totaal, b), en c) P-afbrekende enzymen onder behandeling plots en diepte bodem op de Prairie Verwarming en verhoogde CO 2 </ Sub> Enrichment (PHACE) terrein. Verticale balken voor Q10 vertegenwoordigen gemiddelde ± SE Opmerking: ACN = ambient - klimaat percelen; EHN = verhoogde CO 2 en verwarming percelen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

Het laboratorium op basis van meting van de potentiële bodem EEA kan belangrijke inzichten in microbiële antwoorden op hun abiotische milieu, en de gevolgen daarvan voor het functioneren van ecosystemen leveren. De resultaten van dit voorbeeld dataset suggereren dat minimale verschillen bestaan ​​in de bodem enzymactiviteit of kinetiek tussen klimaat behandeling percelen. Echter, inverse trends onder standplaatsen stimuleren verder onderzoek van covariaten dat de productie van microbiële EEA zoals bodemvochtigheid, bodem-pH of plantengroei beïnvloeden. Over het algemeen, het beoordelen van EEA in termen van (1) de totale EER in de bodem, (2) EER stoichiometric (3) Arrhenius percelen / activatie-energie, en (4) Q 10 biedt een breed spectrum aan benaderingen die indicatief zijn voor het ecosysteem-niveau processen kunnen worden van waaruit robuust karakteriseren bodemecosysteem functionele dynamiek.

High-throughput-fluorescentie gebaseerde EER-testen zijn een nuttig instrument dat op grote schaal wordt gebruikt om potentiële EEA in de bodem te onderzoeken enandere omgevingen. Belangrijk, potentiële activiteiten weerspiegelen het enzym grootte van het zwembad, maar niet op zichzelf kwantificeren enzym productie of omzet tarieven 46. Hoewel de techniek is relatief eenvoudig, kunnen ogenschijnlijk kleine verschillen tussen laboratorium protocollen de vergelijkbaarheid van de resultaten 13 belemmeren. Helaas hebben we momenteel geen geschikte gestandaardiseerde positieve controles voor de EDEO. De stoichiometrische verhoudingen is een benadering voor het overwinnen van deze uitdagingen. Anders, de komst van high-throughput technieken gevorderd de studie van enzymen in de omgeving 4. Zorgvuldige interpretatie van de door deze assays gegevens kunnen belangrijke trends in microbiële activiteit helderen.

De robuustheid van het protocol voort uit de mogelijkheid om te selecteren voor specifieke omstandigheden van afzonderlijke monsters, maar dit kan ook leiden tot beperkingen. Een reeks van aanpassingen nodig zijn om te waarborgen monsters nauwkeurig gemeten afzonderlijk veld plaatsen:

Buffer

De geselecteerde buffer hangt af van de pH van de bodem. Buffering stabiliseert ook de fluorescentie-intensiteit van het fluorescerende normen, die sterk pH afhankelijk 27,47. De pH buffer die we gebruiken meestal de bodem slurry is een 50 mM natriumacetaat of Tris buffer die is gekozen voor de buffer bijzonder zuur dissociatie constante (pKa) naar beste match bodem - monster pH niveaus. Sodium acetate heeft een pKa van 4,76 en Tris heeft een pKa van 8,06, zodat de hoeveelheden van deze twee buffers variëren om de gewenste pKa bereiken voor de afzonderlijke monsters. Fosfaatbuffer (pKa = 7,2) is voorgesteld voor neutrale / licht basische bodems. Maar we waarschuwen om te testen op analytische variabiliteit in voorstudies voor het gebruik van deze buffer, zo hoog fosfaatgehalte kan interfereren met enzymactiviteit.

Behandeling en opslag van fluorescerende substraten

jove_content "> Fluorescentie assays kunnen last hebben van interferentie veroorzaakt door onzuiverheden en / of instabiliteit van veel fluorescerende verbindingen bij blootstelling aan licht, dus voorzichtigheid is vereist bij het hanteren fluorescerende substraten. We raden sterk aan het minimaliseren van eventuele blootstelling aan licht om fluorescent gelabelde substraten en MUB en MUC normen . behulp amberkleurige glazen flessen of afdekken van het glaswerk en containers gebruikt voor het maken en opslaan van fluorescerende substraten en normen wordt sterk aanbevolen; aluminiumfolie om glaswerk en containers wrap werkt goed Ook efficiënt inenten van borden en het overbrengen naar donker incubators is best practice Wij raden.. het opslaan van substraten en normen (-20 ° C) niet langer dan twee maanden (terwijl hen te beschermen tegen licht), en ontdooien substraten (5 ° C) ~ 24-48 uur voor het begin van het enzym assay (s).

Ontwerp en replicatie

Om zo goed mogelijk rekening te goed om goed monster variaties, implementeren negative assay controles en (indien mogelijk) test repliceert aanbevolen. Variatie is meestal het gevolg van verschillen in de hoeveelheid gronddeeltjes in elk putje en pipetteringsfouten. Daarom zal een sterke menging en goede pipetteertechniek substantieel goed minimaliseren om goed variatie. Verder raden we implementeren van een negatieve test controle (buffer + substraat oplossing) om substraat inconsistenties tijdig te signaleren. Dit kan gemakkelijk worden gevolgd bij het lezen van het enzym platen door vergelijking negatieve controle putjes (we meestal de laatste kolom van de 96-well platen). Negatieve controles substraat zijn meestal stabiel, dus het signaal stijgt ruim boven detectielimiet is indicatief voor verontreiniging of substraatinstabiliteit, die een vervanging van het substraat en / of standaardoplossingen.

Om de doorvoer te maximaliseren, ons protocol bevat een aantal potentiële EDEO met een diepe putsmicroplaat, hoewel andere protocollen uit te voeren een soort vanassay per plaat (dwz een substraat per plaat), aangezien verschillende EEA optreden tegen verschillende tarieven. Ongeacht, moet enzym optimalisatie worden uitgevoerd op de bodem voordat u deze hoog gedurende aanpak of de enkele plaat aanpak. Meerdere substraten kunnen worden gebruikt op een enkele plaat als de reactiesnelheden relatief consistent zijn voor elk enzym binnen de periode van incubatie.

Ons protocol raadt ~ 2,75 g bodem aan de suspensie oplossing te maken, terwijl ~ 1 gram wordt aanbevolen in andere protocollen 24. Wij stellen voor dat het gebruik van meer grond (indien mogelijk) is een effectieve aanpak van een betere weergave van binnen-monster bodem variatie in enzymactiviteit niveaus. In dit protocol incubeer we 800 ul bodem gesuspendeerd in 200 pi substraat, terwijl andere slechts incubeer 200 gl bodem gesuspendeerd in 50 ui substraten. Dit is gewoon een functie van schaalvergroting die uiteindelijk niet de gemeten activiteit veranderen. Er zijn ook praktische voordelenvoor het gebruik van grotere volumes. One, is het makkelijker om de bodem deeltjes te vermijden tijdens het pipetteren in corresponderende zwarte platte bodem 96-well platen voor de opname intensiteiten op de fluorometer. Ten tweede, het extra volume is nuttig in het geval van accidentele lozingen tijdens de overdracht van de zwarte platte bodem 96-well platen met de fluorometer vóór de opname-enzym gerelateerde fluorescentie-intensiteiten. Zelfs kleine afwijkingen in volume zal fluorescentie aanzienlijk dalen onder putten. Tenslotte vanwege de hoge doorvoer aard van dit protocol, we gewoonlijk verkiezen vertrouwen op experimentele replicatie variatie in enzymactiviteit niveaus plaats uitvoeren assay repliceert vertegenwoordigen. Het is altijd best practice analytische herhalingen omvatten, maar in de praktijk, voelen we ons protocol voorziet in een evenwichtige afweging tussen analytische en experimentele herhalingen gegeven beperkte middelen. Ook onze aanpak maakt gebruik van relatief meer goed gehomogeniseerd bodem (2,75 g) per test 25, die inherentntly vermindert binnen-bodemvariaties. De beslissing om analytische herhalingen te gebruiken moet zorgvuldig worden overwogen door het testen voor analytische fout in voorstudies 48. We raden echter aan dat experimentele ontwerpen met minder dan 4 behandeling-groep replica sterk moeten overwegen om assay replicaties.

Bodem, Buffer Volumes en substraatconcentratie optimalisatie

De bodem buffer: substraat concentratie ratio is een belangrijke variabele die sterk van invloed op de gemeten fluorescentie bij het uitvoeren enzymanalyses. De hoeveelheid grond in de suspensie toegevoegd assay of de concentratie van substraat moeten worden aangepast afhankelijk van de activiteit van enzymen in het bodemmonster. De voor dit voorbeeld bedragen waren gebaseerd op eerdere testen met deze gronden om ervoor te zorgen dat de beschikbaarheid van substraat werd beperkende, en dat we het meten van maximale potentieel tarieven onder de testomstandigheden (V max) 44,45. Voor grondmonsters die hoge concentraties van enzymen, de hoeveelheid grond of substraat concentratie moet worden verhoogd. We hebben gevonden dat stijgende concentraties substraat (en dienovereenkomstig aanpassend standaardcurve) beïnvloeden lineariteit van de curve. Daarom raden wij de bodem meer bedragen en / of proportioneel aanpassingen volumes als nodig bufferen. Ongeacht, is het belangrijk om substraatconcentratie optimaliseren voor elke grondsoort bepaald omdat gemeten EEA kunnen verschillen door een orde van grootte groter tussen verzadigde en sub-verzadigde concentraties substraat 26. Daarom verschillen tussen experimentele behandelingen (etc.) zijn gevoelig voor type II statistische fout en minder kans om te worden gedetecteerd op-sub verzadigende omstandigheden, en statistische fout 27,35. Om substraatconcentraties optimaliseren dient voorafgaande enzymbepalingen uitgevoerd op representatieve monsters met uiteenlopende substraatconcentraties. Naopnemen van de fluorescentie eenvoudig plotten de gegevens (vergelijkbaar met de standaardkromme voorbeeld, Figuur 1) op het substraat concentratie (x-as) die overeenkomt met de activiteit (y-as) enzym identificeren waar de helling vlakt (~ 0). Ook de substraatconcentratie overeenkomt met het punt waar de helling vlakt (~ 0) is een goede indicatie van de optimale substraatconcentratie voor die bodem.

Deze assay meet uiteindelijk fluorescentie gedurende een bepaalde tijd door het fluorogene groep die wordt afgesplitst van het substraat als gevolg van enzym gemedieerde substraat depolymerisatie. Derhalve stap 5 (substraat toevoeging) is kritisch en moet zo efficiënt mogelijk om de tijd tussen wanneer het substraat wordt toegevoegd aan de bodem en wanneer de testen worden geïncubeerd minimaliseren worden uitgevoerd. Ook wanneer het substraat in contact komt met het monster, zal enzymatische reacties gaan optreden. Wij raden het gebruik van een multi-channelpipet om deze reden. Het wordt sterk aangeraden om efficiënter te worden met behulp van de multi-channel pipet voorafgaand aan de dag dat u het uitvoeren van uw enzymanalyses. Om dit te bereiken, kunt u pipetteren oefenen met water tot je gemakkelijk volumes kunt overschrijven naar de 96-well platen met je pipet.

Bodem Quenching

Afschrikken verwijst naar afnemende fluorescentie-intensiteit als gevolg van deeltjes en / of organisch materiaal in de bodem slurries-incubaties 26. Afschrikken kan worden beïnvloed door aanpassing van de bodem: buffer verhoudingen 25. Door de achtergrond fluorescentie van afzonderlijke monsters, is het essentieel om normen uitgevoerd met monsters vertegenwoordigen achtergrond (quenching) van fluorescentie. Hoewel sommige protocollen gebruiken een enkele concentratie na het testen dat het signaal lineair is, raden wij de implementatie van een standaard afschrik controle voor elk monster de beste controle voor de effecten van blussen. Doet u dit niet zal resulteren in een standard curve niet van toepassing op het monster, en een verkeerde inschatting van de enzymatische activiteit. De toevoeging van normen bodem slurries niet tijdgevoelig, als standaard toevoeging laat de achtergrond fluorescentie van het monster.

NaOH toevoeging

De toevoeging van NaOH wordt gebruikt in sommige protocollen fluorometrische enzymactiviteit metingen te optimaliseren omdat de fluorescerende kleurstof vrijgemaakt uit de synthetische substraten vertoont piekfluorescentie bij pH> 9,0 26,49. Bij het ​​overwegen van dit voorstel wordt de NaOH-concentratie nodig om de bodem slurry pH (dwz tot pH> 9) variëren afhankelijk van de bodem en de pH 26 buffer gebruikt. Maar anderen beweren dat NaOH niet nodig zijn omdat de signaalintensiteit het algemeen zeer hoog, zelfs bij lagere pH en omdat introduceert een extra bron van meetfouten. Bijvoorbeeld, het effect van NaOH aanvullingen slurry pH en daarmee MUB of MUC fluorescence veranderingen in de tijd 25. MUB verbonden substraten altijd constante verhoogde fluorescentie gedurende 20 min na toevoeging NaOH voordat niveaus taps tonen, terwijl MUC steady aangetoond afgenomen fluorescentie tot 60 min. 26. Daarom is het belangrijk om de tijd tussen NaOH toevoeging en fluorescentiemeting standaardiseren. Als alternatief, als fluorescentie niveaus voldoende detecteerbaar zonder toevoeging, voeren de testen zonder toevoeging van NaOH is voorgesteld als een even aanvaardbaar alternatief 26.

Temperatuur

Temperatuurgevoeligheid moet rekening worden gehouden bij de beslissing incubatie temperatuur. Als de primair belang is begrip enzymkinetiek, met drie of meer temperaturen zoals geïllustreerd middels Arrhenius plots (in het resultaat) is een robuuste benadering. Als de steekproef site heeft karakteristieke lage temperatuur zoals permafrost bodem, dan is de DUURn incubatie moet worden verruimd om de enzymen in de koudere incubatie temperaturen reageren. Terwijl de traditionele enzymkinetiek suggereert dat een temperatuurverhoging moeten leiden enzymactiviteit hebben wij gevonden dat enzymen plaatsspecifieke qua temperatuurgevoeligheid 50 kan zijn. Daarom naar site-specifieke enzymactiviteit potentieel begrijpen is het essentieel dat incubatie temperatuur en de duur worden aangepast aan terreinsite waarden weerspiegelen.

Conclusie

EE zijn essentieel blijken voor de biogeochemische processen in de bodem, en dus moeten we in staat zijn om hun activiteiten te meten. Er zijn veel uitdagingen voor het meten van EEA in de bodem, met inbegrip van interferentie en remming. Ondanks deze problemen kunnen gestandaardiseerde protocollen (zoals hier beschreven) universeel toegepast EEA maat voor diverse enzymen. Hoewel het vrij eenvoudig om de kwaliteit van gegevens te genereren na deze protocollen, het ininterpretatie van deze gegevens in een ecologische context vereist een zorgvuldige afweging van wat deze testen zijn echt te meten, en hoe EEA onder testomstandigheden kunnen verschillen van die onder in situ-omstandigheden.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Deze publicatie werd gefinancierd door de enzymen in de Environment Research Coordination Network Research gesteund door de Amerikaanse National Science Foundation (DEB # 1021559). Dit onderzoek werd gesteund door de Amerikaanse National Science Foundation (DEB # 1021559), en de US Department of Energy's Office of Science (biologische en milieu-onderzoek). Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal zijn die van de auteurs en komen niet noodzakelijk overeen met de standpunten van de Amerikaanse NSF.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG)Sigma AldrichM9766Suikerafbraak
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG)Sigma AldrichM3633Suikerafbraak
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB)Sigma AldrichM6018Cellulose afbraak
L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarinehydrochloride (LAP)Sigma AldrichL2145Eiwitafbraak
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosamine (NAG)Sigma AldrichM2133Chitine afbraak
4-Methylumbelliferyl fosfaat (PHOS)Sigma AldrichM8883Fosformineralisatie
4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL)Sigma AldrichM7008Hemicellulose afbraak
4-Methylumbelliferoon (MUB)Sigma AldrichM1381
7-Amino-4-methylcoumarine (MUC)Sigma AldrichA9891
50 mM natriumacetaat droge bufferFisher ScientificS210-500zure en neutrale bodems
50 mM Tris-basisbufferFisher ScientificBP154-1basische bodems
Apparatuur
Bel-Art Scienceware wegwerppipetbekkensFisher Scientific14-512-65pipetbekken
Elektronisch; Eppendorf Xplorer; 8-kanaalsFisher Scientific13-684-2658-kanaals pipet, bereik: 50-1.200 μl
TipOne 101-1.250 μl verlengde lengte natuurlijke tipsUSA Scientific1112 - 172010 racks van 96 tips (960 tips)
Hotplate; verwarmingsoppervlak: 10 inch x 10 inchFisher Scientific11-100-100SHMagneetregelplaat voor labdisc
Waring blenderFisher Scientific14-509-7PTweesnelheden; 1 L (34 oz) roestvrijstalen container
BRAND Dispensette III flesdispensersFisher Scientific13-688-231Dispenser; bereik: 5-50 ml
Wheaton Unispense μP peristaltische pompenFisher Scientific13-683-7Optionele dispenser
Fisherbrand magneetroerblokFisher Scientific1451363SIXGebruikt om bodemslurry te roeren na het mixen
Pyrex glazen kommenWorld Kitchen5304218Pyrex 10 oz rand puddig kopje
Costar 96-wel zwarte solide platenFisher Scientific07-200-590Gebruikt voor de plate reader stap
Costar 96-wel assayblokkenFisher Scientific07-200-700V-bodem; 2 ml; steriele
Thermo Scientific Nunc 96-wel kapmatjesFisher Scientific14-387-93Steriele 96-wel kapmat voor vierkante putjes
Centrifuge uitgerust met houders voor deep-well platenThermo Scientific3121Centra-GP8 (dit model is niet langer beschikbaar)
Tecan Infinite 200 series multifunctionele microplaatlezerTecan30016058Plate reader (dit model is niet langer beschikbaar)

Referenties

  1. Burns, R. G., Dick, R. P. Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, CRC. (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O. Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. , Oxford University Press. (1999).
  15. Tabatabai, M. A. Methods of Soil Analysis. Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. 2, American Society of Agronomy, Inc. 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER - MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151(2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis - Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. Sterner, R. W., Elser, J. J. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279(1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79(1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bodemenzymanalyseextracellulaire enzymactiviteitdeep wellplatenfluorescerende substratenbereiding van bodemslurryincubatie en centrifugatiefluorescentiedetectiestandaardcurve analysepotenti le enzymactiviteiten

Gerelateerde artikelen