Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in

13.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50968

⸱

5 december 2013

 ,  ,  , 
1Neuroscience Center of Excellence, Louisiana State University Health Sciences Center

In dit artikel

Samenvatting

Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.

Samenvatting

Genetische screens uitgevoerd met behulp van Drosophila melanogaster (fruitvlieg) hebben talloze mijlpaal ontdekkingen gedaan in de opmars van de biologische wetenschappen. Echter, het gebruik van biochemische schermen gericht op uitbreiding van de kennis die uit de genetische analyse werd pas onlangs ontdekt. Hier een methode beschrijven we aan het eiwitcomplex te zuiveren dat associeert met een eiwit van interesse van volwassen vlieg hoofden. Deze methode maakt gebruik van het Drosophila GAL4/UAS systeem lokaas eiwit gefuseerd met een Tandem Affinity Purification (TAP) tag in vlieg neuronen in vivo expressie en vervolgens worden twee ronden van zuivering met gebruik van een TAP werkwijze gelijk aan die oorspronkelijk vastgesteld gist 1 om de interacties eiwitcomplex zuiveren. Aan het einde van deze procedure wordt een mengsel van verschillende eiwitcomplexen verkregen waarvan de moleculaire identiteit kan worden bepaald door massaspectrometrie. Validatie van de kandidaat-eiwitten zullen profiteren van de resource en het gemak van het uitvoeren van verlies-van-functie studies in vliegen. Soortgelijke benaderingen kunnen worden toegepast op andere vliegen weefsels. Wij geloven dat de combinatie van genetische manipulaties en dit proteomics aanpak in de vlieg modelsysteem bezit een enorm potentieel voor de aanpak van fundamentele problemen op het gebied van de neurobiologie en daarbuiten.

Inleiding

Het definiëren van de moleculaire pathways of netwerken die een bepaald biologisch proces bemiddelen is een van de uiteindelijke doelen van het biomedisch onderzoek. Vlieg genetici hebben zwaar afhankelijk van forward genetics, vooral modifier genetische screens (zowel enhancer en suppressor-schermen), factoren die samenwerken, parallel met, of stroomopwaarts of stroomafwaarts van een gen van belang te identificeren. Echter, forward genetics schermen vaak niet om essentiële genen te identificeren die, wanneer gemuteerd, veroorzaken dodelijkheid in vroege ontwikkelingsstadia, of genen met functionele redundantie en compensatie waarvan het verlies van de functie alleen leiden tot subtiele defecten die moeilijk om te scoren zijn. Een manier om deze moeilijkheid te overwinnen is het screenen op directe eiwit-eiwit interacties. Voor meer dan een decennium, een groeiende lijst van biochemische methoden, waaronder gist two-hybrid, faag display, chemische cross-linking, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), enz. zijn gebruikt om eiwitten te onderzoeken-Eiwit interacties. Elk van deze benaderingen heeft zijn eigen set van sterke en zwakke punten met betrekking tot de gevoeligheid en specificiteit. Onder hen, kan de TAP detectiemethode voor fysieke interactie onder nagenoeg fysiologische omstandigheden, behouden specificiteit en samenhang 2 en omvat de mogelijkheid om uit te breiden tot hoog-analyses 3,4.

TAP methode werd oorspronkelijk ontwikkeld in gist door Rigautand collega 1. Bij deze werkwijze wordt een eiwit van interesse tot expressie met een TAP-tag. De TAP-label herbergt twee onafhankelijke affiniteit bindende domeinen: een eiwit Een domein dat bindt aan IgG en een-calmoduline bindend domein. De twee domeinen worden gescheiden door een TEV (Tobacco Etch Virus) splitsingsplaats. Een dergelijke combinatie zorgt voor twee onafhankelijke rondes van affiniteit zuiveringen voldoende niet-specifieke bindingen te verminderen en te verrijken specifieke bindingen 1. Voor dit geval, de TAP methode is een zeer krachtige methodiekd identificeren in vivo interactie van een bepaalde proteïne, hoewel overexpressie het exogene proteïne kan meer vatbaar voor koppelen met eiwitten die normaal niet complex met zijn endogene tegenhanger maken. Sinds de ontwikkeling, heeft de TAP methode is toegepast in vele andere systemen, waaronder cel-cultuur-gebaseerde systemen 5,6 en andere in vivo modellen voor de 6-9. Hier beschrijven we de aanpassing van de TAP methode in Drosophila. We hebben eerst genereren pUAST-NTAP en pUAST-CTAP vectoren klonering en fusie van de TAP-tag aan de N-of C-uiteinde van het gen van belang te vergemakkelijken. De UAS-TAP gelabeld transgen wordt vervolgens uitgedrukt in het zenuwstelsel onder controle van een neuronale GAL4 driver 10. Vervolgens zal een groot aantal volwassen vlieg koppen worden verzameld, die hoog gehalte aan neurale cellen en zijn gemakkelijk te scheiden van andere lichaamsdelen na bevriezing basis van grootte verschillen. De volwassen hoofden zijn gehomogeniseerd en opgeruimd by sequentiële centrifugeren, en het supernatant is onderworpen aan een hieronder beschreven TAP procedure.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Genereer UAS-TAP gelabeld Transgene Flies

  1. Genereer pUAST-TAP-gelabeld DNA-constructen.
    1. Bepaal welke zijde (N-of C-terminus) van het aas eiwit de TAP tag moet worden gefuseerd, op basis van de proteïne structuur / functie. Zie de bespreking voor meer details.
    2. Subkloneren van het cDNA coderende gebied van het gen van belang in de meervoudige kloneringsplaatsen (MCS) van de pUAST-NTAP of pUAST-CTAP vectoren N-of C-eindstandige-gemerkte UAS-transgenen TAP respectievelijk genereren. Zie Figuur 1 voor gedetailleerde kaarten en bruikbare restrictie sites en reading frames.
  2. Genereer UAS-TAP gelabeld transgene vliegen.
    1. Genereer transgene vliegen volgende standaardprotocollen met P-element bemiddelde inbrengen 11. Een aantal injectie services zijn commercieel verkrijgbaar.
    2. Steek neuronale GAL4 driver (dwz BG380-GAL4) om elke afzonderlijke transgene lijn en bepalen de eiwitexpressieniveausIedere regel door Western blot (met peroxidase Anti-peroxidase-antilichaam) en / of immunokleuring (met anti-TAP-antilichaam). In het algemeen wordt een transgene lijn met een niveau van eiwitexpressie die dicht bij het endogene eiwit aanbevolen voor TAP procedures. Zie de bespreking voor meer details.
    3. PerformGAL4/UAS-based rescue experimenten om de functionaliteit van de TAP-gelabeld transgenen bevestigen als verlies-van-functie mutanten van de genen van belang zijn beschikbaar. Kies een transgen dat nagenoeg mutantfenotypes voor volgende TAP experimenten redden.

2. Bereid Monsters voor TAP Procedure

  1. Genereer een vlieg voorraad die zowel een neuronale GAL4 driver (bijv. BG380-Gal4) en de gekozen-TAP gelabeld transgen om uitbreiding van vliegen monsters gemak draagt. Verzamel de F1 nakomelingen van de GAL4 bestuurder en de UAS-transgen kruis in zeldzame gevallen waarin de bovenstaande combinatie veroorzaakt overleving en groei nadeel.
  2. Verzamel kleine schaal monsters en optimaliseren lysis voorwaarde voor het oplosbaar maken van de TAP-gelabeld eiwit.
    1. Wordt reeks lysis buffers een combinatie van niet-ionogene detergentia NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) en Triton X-100 (0,05-0,5%). Zie Tabel 1 en discussie voor meer gegevens.
    2. Op de top van een CO2-pad, gebruik # 5 tang te ontleden 20 volwassen hoofden van de TAP transgen uitdrukken vliegen en verzamelen ze in een 1,5 ml buis aan elkaar lysebuffer conditie te testen.
    3. Voeg 100 ul lysisbuffer testen aan de buis en homogeniseer de hoofden van strijken op en neer met een plastic stamper, voeg nog eens 100 ul buffer testen.
    4. Draai de kop lysaat bij 21.500 xg gedurende 10 min (4 ° C), en scheiden het supernatant en pellet na centrifugeren. Voeg 25 ul 2x SDS beladingsbuffer respectievelijk de pellet en 10 ul 4x SDS laadbuffer tot 30 ul van supernatant.
    5. Kook beide monsters gedurende 5 min en analyseren naast-Side met SDS-PAGE en daaropvolgende Western Blot met PAP antilichaam. Bepaal de oplosbaarheid van de verhouding van TAP-eiwitniveaus in supernatant vs de pellet.
  3. Bereid monster in grootschalige
    1. Openen en verzamel volwassen vliegen.
      1. Vouw de neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene voorraad in flessen en flip de flessen om de 3 dagen tot accumulerend 250 flessen worden gebruikt voor het verzamelen.
      2. Verzamel 1-3 dagen oude volwassen vliegt in 50 ml conische buizen, zet de tube in vloeibare stikstof onmiddellijk diepvries de vliegen. Bewaar het vliegen in een -80 ° C vriezer. Merk op dat het volume van de vliegen niet hoger zijn dan 2/3 van de 50 ml buis.
    2. Verzamel fly hoofden (het uitvoeren van deze stap op de top van gepoederde droogijs).
      1. Haal de voorgekoeld zeven en de vijzel en stamper van de -80 ° C vriezer en leg ze op droog ijs, idealiter in een grote ijsemmer. Stapel twee VS standaard test zeven met een nr. 25 op the top en nr. 40 onderaan.
      2. Neem de bevroren vliegt uit en drop ze in vloeibare stikstof en houden de vliegen daar voor ongeveer 10 minuten. Vortex of schud de buizen krachtig om de koppen, poten en vleugels breken met de lichamen.
      3. Giet het mengsel op de bovenste zeef en schud de zeven krachtig terwijl elk van de zeven bij elkaar. Na zeven, zullen de lichamen blijven op de bovenste zeef, vliegen hoofden zal op de onderste zeef worden behouden, en poten, vleugels en ander vuil zal om het droogijs vallen. Scheid de twee zeven en zorgvuldig over te dragen de vlieg hoofden aan de koude mortel.
    3. Meng de vlieg hoofden
      1. Op de top van droog ijs, slijp de hoofden met de mortier en de stamper om poederachtige deeltjes, breng de poeder om een ​​15 ml glazen Dounce Tissue Grinder dat was voorgekoeld op ijs.
      2. Meet de gewichten van de molen voor en na de kop monster erin werd gegoten, en bereken dan hoeveel het hoofd sample weegt. Een totaal van 6-15 gram vlieg koppen volstaat voor elke TAP experiment dienovereenkomstig aanpassend aan de expressieniveaus van het eiwit. Voeg 15 ml ijskoude homogenisatiebuffer (lysisbuffer geoptimaliseerd in stap 2.2) om het poeder en wrijf vervolgens met de grote ruimte stamper totdat het is gemakkelijk voor de stamper te gaan op en neer. Houd het glas molen op het ijs te allen tijde.
    4. Bereid de supernatant voor TAP
      1. Breng de homogenaat een snelle centrifugebuis en centrifugeren gedurende 20 min bij 50.000 xg ~ (4 ° C). Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe high-speed centrifuge buis en herhaal het centrifugeren nog een keer.
      2. Breng de bovenstaande om een ​​ultracentrifuge buis en het uitvoeren van een 40 min ~ 250.000 xg spin om het supernatant verder te wissen. De supernatant is klaar voor de tandem affiniteitszuivering procedures na ultracentrifugatie.

3. TAP Zuivering

De volgende secties werden afgeleid van de Seraphin lab TAP protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

  1. Voer IgG kraal affiniteitzuivering
    1. Bereid IgG sepharose kralen terwijl de monsters worden gecentrifugeerd. Was 400 ul IgG kraal 3x in een 15 ml Falcon buis met 10 ml koud IgG wassen buffer. Voor elke wasbeurt, rock de buis zachtjes gedurende 2 minuten, en dan spin down de kralen aan 1000 xg gedurende 2 minuten. Aan het einde van de derde maal, verwijdert de buffer en slechts de korrels in de buis.
    2. Breng zorgvuldig de heldere supernatant (~ 15 ml) in de 15 ml buis met de IgG kralen. Incubeer de kralen en hersenen lysaat mix bij 4 º C op een nutator gedurende 2 uur.
    3. Opzetten van een schone en lege micro kolom met ongeveer 15 ml totaal volume in de koude kamer. Laad de IgG kraal mengsel door gestaag te gieten het mengsel in de kolom, probeer niet te vangen elkeluchtbellen in de kolom. Laat de kralen om zich te vestigen in de kolom en de buffer langzaam leeglopen door zwaartekracht.
    4. Was de kolom grondig met 10 ml koud IgG wasbuffer na alle van de hersenen lysaat heeft stroomde door de vaste IgG kolom. Herhaal het wassen 2x. Opmerking: laat nooit de kraal aan de lucht in.
  2. Voer TEV decollete
    1. Na de derde wassen, spoel de kolom weer met 10 ml TEV decollete buffer. Deze stap bereidt de IgG kraal die het aas complex voor TEV decollete sequestrates.
    2. Vlak voordat de laatste druppel TEV buffer over te druppelen uit, zet een cap op de bodem van de kolom om de stroom te blokkeren, voeg 1,3 ml TEV buffer die 130 eenheden TEV enzym aan de kolom en vervolgens veilig dop boven de kolom. Controleer de kolom goed afgedicht aan beide uiteinden.
    3. Draai de kolom bij 18 º C gedurende 2 uur om de TEV enzym aan het peptide te splitsen op de TEV-site en laat het eiwitcomplex while achterlating van het proteïne A-domein peptide gebonden aan de IgG sepharose korrels.
  3. Voer Calmoduline kraal affiniteitzuivering
    1. Bereid de Calmodulin korrels terwijl de IgG korrels geïncubeerd met TEV enzym. Was 200 ul Calmodulin parels in een 15 ml Falcon buis 3x met telkens 10 ml koud Calmodulin binding buffer. Voor elke wasbeurt, schud de buis gedurende 2 minuten op een nutator, en dan spin down de kralen aan 1000 xg gedurende 2 minuten. Aan het einde van de derde maal, neem alles uit de buffer en laat alleen de kralen in de buis.
    2. Aan het einde van de TEV incubatie (stap 3.2.3), de terugkeer van de kolom IgG terug naar de koude kamer en zet deze recht omhoog. Laat de kralen na gedurende 10 minuten.
    3. Verwijder de dop en dan de onderste dop en verzamelen de 1,3 ml TEV decollete product in een 15 ml Falcon buis. Laat de buffer uitlekken volledig. Voeg een extra 200 ul TEV buffer om de kolom naar het dode volume van de kolom duwen, het verzamelen van de flow-out in dezelfde buis.
    4. Voeg 4,5 ml van Calmodulin binding buffer en 4,5 ul 1 M CaCl2 aan de 1,5 ml TEV splitsingsproduct boven verzameld. De CaCl2 dient om de EDTA titreren van de TEV buffer. Breng de 6 ml mengsel aan de buis met de Calmodulin kralen en draai de buis bij 4 ° C op een nutator 1 uur.
    5. Opgezet andere schone en lege micro kolom met ongeveer 10 ml totaal volume in de koude kamer. Laad de Calmoduline kraal mengsel aan de kolom en laat het uitlekken door de zwaartekracht.
    6. Wanneer alle oplossing stroomde door vaste Calmodulin kolom, spoel de kolom tweemaal met elk 10 ml koud Calmodulin binding buffer. Opmerking: vermijd het verstoren van de Calmoduline kralen en proberen om het oppervlak van de bolletjes zo plat mogelijk tijdens het wassen te houden.
  4. Elueer het aas complex van Calmoduline kolom.
    Direct na het wassen, elueren de kolom Calmoduline met vijf fracties van 200 pi koude Calmodulin elutiebuffer. Voor elke fractie zachtjes voeg 200 ul elutiebuffer aan de kolom en verzamel het eluaat gemarkeerd met een 1,5 ml Eppendorf buis. Herhaal dit 4x.
  5. Analyseer het eiwitcomplex door SDS-PAGE
    1. Neem een ​​kleine hoeveelheid van elk van de vijf fracties (ongeveer 30 ui) en voeg SDS laadbuffer. Kook de monsters gedurende 5 minuten en plaats de monsters side-by-side met eiwitten moleculaire merkers in een gradiënt (4-15%) SDS-PAGE gel.
    2. Nadat de monsters volledig zijn opgelost in de gel, stop de elektroforese en vlekken op de gel met geen G-250-gebaseerde gevoelige colloïdale Coomassie kleuringen zoals 'blue zilver' kleuring 13. Zilverkleuring is optioneel, maar niet de voorkeur omdat het niet volledig compatibel met de volgende massaspectrometrie. Bewaar de rest van het eluaat in een -80 ° C vriezer voor verdere analyse zoals massaspectrometrie voor het blootleggen van de moleculaire identiteit van het gezuiverde eiwit complex. See discussie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier laten we onze inspanningen in het identificeren Highwire-interagerende eiwitten in de vlieg hersenen. Highwire (Hiw) en de gewervelde en ongewervelde homologen zijn enorm ubiquitine ligasen die de ontwikkeling en reparatie van het zenuwstelsel 14 reguleren. Ze delen een aantal zeer geconserveerde functionele domeinen. Echter, hun moleculaire acties niet geheel duidelijk. Werk in worm, vliegen en muizen leidde tot de huidige werkmodel dat Hiw functioneert als een E3 ligase en als een steiger eiwit om de v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) heeft een dubbele zuiveringsprotocol dat de isolatie en verrijking van eiwitcomplexen via twee onafhankelijke affiniteit zuiveringsstappen maakt. Het ontwerp van de TAP-tag is niet beperkt tot wat in dit protocol, andere proteïne bindende domeinen en motieven zijn ook van toepassing als bufferomstandigheden dienovereenkomstig aangepast. Een goed voorbeeld van andere TAP tags is het GS-TAP tag, een combinatie van een G-eiwit en een streptavidine-bindende motief, gemaakt door gr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken EUROSARF voor het sturen van gist TAP expressie plasmiden. We zijn ook dankbaar voor redactionele hulp van Ryan Labadens. Dit werk werd ondersteund door een NIH / NINDS subsidie ​​(R01NS070962) naar CW

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
U.S.A. standaardtestzeef No. 25Fisher Scientific04-881-18
U.S.A. standaardtestzeef No. 40Fisher Scientific04-881-21
 Kontes Dounce Tissue Grinders 15 mlKimble Chase885300-0015
IgG sepharose kralenPharmacia17-0969-01
Econo-column 0,7 cm x 20 cmBio-Rad737-4721
Econo-column 0,5 cm x 15 cmBio-Rad737-4716
Calmodulin kralenStratagene214303
Coors Molen enstamperCoorsTek60311
AcTEV ProteaseInvitrogen12575-015
Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Protease Inhibitor MixSigmaP8340

Referenties

  1. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
  3. Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
  4. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  5. Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
  8. Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
  9. Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
  10. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  11. Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
  12. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  13. Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
  14. Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
  15. Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
  16. Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16(2007).
  17. Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
  18. Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
  19. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
  20. Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).
  21. Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
  22. Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GAL4/UAS-systeemzuivering van immunoglobuline GTEV-splitsingzuivering van calmodulinemassaspectrometrielysaat van vliegenkoppenultracentrifugatie
Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.