Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

Samenvatting

Hier een toepassing van de fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek in combinatie met een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen tot microseconde en milliseconde dynamiek en energiebalans van structurele veranderingen met betrekking tot calcium vereniging een neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Modulator volgen we verslag .

Samenvatting

Fotothermische straalafbuiging met fotoakoestische calorimetrie en thermische raster behoort tot de familie van fotothermische methoden die de tijd-profiel volume en enthalpie veranderingen van licht geïnduceerde conformationele veranderingen in eiwitten op microseconde tijdschaal die niet toegankelijk zijn milliseconde traditionele stop bewaken flow instrumenten. Bovendien, omdat algemene wijzigingen in volume en / of enthalpie gepeild, deze technieken kunnen worden toegepast om proteïnen en andere biomacromolecules die een fluorofoor en een chromofoor label of ontbreekt. Om dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met Ca ² monitoren ⁺ binden aan calcium transducers, zoals neuronale calcium sensoren, een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen, wordt gebruikt om foto-trekker een snelle (τ <20 msec) toename van vrije calcium concentratie en het bijbehorende volume en enthalpie veranderingen worden gesondeerd met fotothermische bundeldeflectie techniek.

Inleiding

Fotothermische werkwijzen zoals fotoakoestische calorimetrie, fotothermische straalafbuigingsbuizen (VOB), en voorbijgaande rooster gekoppeld nanoseconde laser excitatie vormen een krachtig alternatief voor optische spectroscopie voorbijgaande voor tijdsopgeloste studies kortstondige tussenproducten ^1,2. In tegenstelling tot optische technieken, zoals transiënte absorptie-en IR-spectroscopie, die volgen het tijdsprofiel van absorptie veranderingen in de chromofoor omgeving; fotothermische technieken detecteren tijdsafhankelijkheid van warmte / volumeveranderingen en daarom waardevolle gereedschappen voor het onderzoeken tijdprofielen optisch "stille" processen. Tot dusver fotoakoestische calorimetrie en voorbijgaande rooster is met succes toegepast op conformationele dynamica van foto-geactiveerde processen waaronder twee atomen ligand migratie globins ^3,4 ligand interacties met zuurstofsensor eiwit bestuderen FixL ^5, elektronen en protonen transport in heem-koper oxidasen ⁶ eennd fotosysteem II evenals foto-isomerisatie in rhodopsin ⁷ en conformationele dynamica in cryptochrome ^8.

Om de toepassing van fotothermische technieken om biologische systemen die ontbreken intern chromofoor en / of fluorofoor te breiden, werd de PBD techniek in combinatie met het gebruik van gekooide verbinding aan foto-trekker verhoging van ligand / substraat concentratie binnen enkele microseconden of sneller, afhankelijk het gekooide compound. Deze aanpak zorgt voor de opvolging van de dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met de ligand / substraat binden aan eiwitten die ontbreken een interne fluorofoor of chromofoor en op tijd-schaal die niet toegankelijk door commerciële stopstroming instrumenten. Hier een toepassing van PBD de thermodynamica van de kooi verbinding ^{Ca2 +} DM-nitrophen, foto-splitsing en de kinetiek voor Ca ^{2 +} associatie met het C-terminale domein van de neuronale calcium sensor omlaag monitorenstroom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wordt gepresenteerd. De Ca ^{2 +} is foto-vrijgelaten uit Ca ^{2 +} DM-nitrophen binnen 10 usee en rebinds een unphotolysed kooi met een tijdconstante van ~ 300 msec. Anderzijds, in aanwezigheid van apoDREAM extra kinetische zich op de milliseconde tijdschaal waargenomen en weerspiegelt de ligand binding aan het eiwit. De toepassing van PBD conformationele transities in biologische systemen sonde of andere manier beperkt vanwege de instrumentele moeilijkheden, bijvoorbeeld zware uitlijning van de sonde en pompbundel een sterke en reproduceerbare PBD signaal bereiken. Echter, een zorgvuldige ontwerp van een instrumentatie set-up, een nauwkeurige controle van de temperatuur, en een zorgvuldige afstemming van de sonde en pompbundel een consistente en robuuste PBD signaal dat monitoring van tijdopgeloste volume en enthalpie veranderingen maakt op een breed tijdschaal van 10 usee ongeveer 200 msec. Bovendien modificaties van de experimentele procedure voor de detectie van monster en referentiesporen verzekeren onder identieke temperatuur, buffersamenstelling, optische cel oriëntatie, laservermogen, etc. vermindert de experimentele fout in afgemeten reactievolumes en enthalpie.

Protocol

1. Monster Voorbereidingen

1. Voer de monstervoorbereiding en alle monster manipulaties in een donkere kamer om een ​​ongewenste uncaging voorkomen.
2. Oplosbaar DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimethoxyfenyl) - N, N, N ', N'-tetrakis [(oxy-carbonyl) methyl] -1,2-ethaandiamine) in 50 mM HEPES buffer, 100 mM KCl, pH 7,0 tot een eindconcentratie van 400 uM (ε _{350 nm} = 4330 ^M-1 cm ^{-1 9).}
3. Voeg _CaCl2 van de 0,1 M stockoplossing aan een wenselijke verhouding van [Ca ^{2 +]} te bereiken: [DM-nitrophen]. Voor eiwitten met _Kd voor Ca ^{2 +} associatie groter dan 10 uM, de verhouding van [Ca ^{2 +]} [DM-nitrophen] 1:1 de voorkeur binding van foto-model ^{Ca2 +} tot uncaged DM-nitrophen voorkomen . Immers, gezien de _Kd waarde DM-nitrophen zijn 10 nM en de totale concentratie van DM-nitrophen en ^{Ca2 +} om 400 mM, ~ 90% van een calcium bindend eiwitmet K _d = _geeft 10 uM in de apoform. Anderzijds, voor studie van ^{Ca2 +} bindende eiwitten met _Kd <10 uM, het de voorkeur de [Ca ^{2 +]} verlagen: [DM-nitrophen] ratio 0.95 Ca ^{2 +} complexering voorkomen dat de apo- eiwit voorafgaand de kooi fotodissociatiegebieden.
4. Solubiliseren de referentieverbinding, _K3 [Fe (III) (CN) _6] of Na ₂ CrO _4, in dezelfde buffer als het monster.

2. Het opzetten van het experiment

1. De basis experimentele configuratie is getoond in figuur 2.
2. Gebruik een pengat _(P2) aan de diameter van de sonde bundel (632 nm uitgang van He-Ne laser, ~ 5 mW laservermogen) aanpassen aan 1 mm en propageren de testbundel door het midden van een cel in een temperatuur gecontroleerde cel houder met behulp van een M ₁ spiegel.
3. Gebruik een spiegel (M ₂₎ achter het monster aan de testbundel centrerenop een centrum van positie gevoelige detector.
4. Concentreer de sonde bundel op het midden van de detector zodanig dat het verschil in spanning tussen de bovenste twee diodes en onderste twee dioden en het verschil in spanning tussen de twee diodes links en rechts van de detector nul.
5. Vervolgens vorm een diameter van de pompbundel, een 355 nm uitgang Q-switched Nd: YAG laser, FWHM 5 nsec) met een 3 mm pinhole _(P1) geplaatst tussen twee spiegels 355 nm laser.
6. Copropagate de pompbundel door het midden van de cuvet zoals aangetoond in figuur 2. Het is belangrijk dat beide laserstralen worden voortgeplant door het midden van de optische cel in bijna collineaire wijze een meetbare afbuighoek en dus hoge amplitude van PBD signaal te verkrijgen. Onder experimentele omstandigheden, de hoek van het snijpunt van de sonde en pomp bundels kleiner is dan 15 °.
7. Gebruik een referentieverbinding de sonde en pomp uitlijnenbeam om een bevredigende PBD signaal bereiken, dat wil zeggen een goede S / R-verhouding en stabiel PBD amplitude op langere tijdschalen (~ 100 msec).
8. Pas de positie van de pompbundel ten opzichte van de testbundel met een incrementele aanpassing van de 355 nm laser spiegels.
9. Meet de amplitude van de PBD referentiesignaal als een verschil tussen twee bovenste en onderste fotodiodes op de positiegevoelige detector. De PBD signaal zou een snelle toename van de amplitude op een snelle tijdschaal (<10 usec) vertonen en stabiel op 100 msec tijdschema zoals aangetoond in figuur 3. De twee opnamen variabiliteit van de VOB amplitude ligt op 5% van het signaal amplitude en het signaal reproduceerbaarheid wordt vooral beïnvloed door trillingen.
10. Controleer de lineariteit van de PBD signaalamplitude ten opzichte van de vrijkomende warmte-energie door meting van de lineaire afhankelijkheid van de PBD signaal op de excitatie laservermogen en het aantal Einsteins geabsorbeerd, E _een= ^(1-10-A), waarbij A overeen met de referentie absorptie bij de excitatiegolflengte.
11. Houd het laservermogen onder ca. 1000 mJ en absorptie van het monster / referentieverbinding bij de excitatie golflengte van minder dan 0,5 multiphoton absorptie en vermindering van de pomp bundelvermogen respectievelijk voorkomen en zorgen lineariteit van de PBD signaal.

3. PBD Metingen

1. Begin met de meting van de PBD sporen voor de referentie. Plaats de oplossing van de referentieverbinding in een 1,0 cm x 1,0 cm of 1,0 cm x 0,5 cm kwarts cel en plaats de cel in de temperatuur gecontroleerde houder. Beide weglengtes verstrekken vergelijkbare PBD amplitude.
2. Detecteer referentie PBD signaal als functie van de temperatuur in het temperatuurgebied 16-35 ° C waarbij de temperatuur toename van 3 ° C.
3. Bij iedere wijziging van de temperatuur, controleren van de positie van de sonde straal op de positie gevoelige detector en rede aan te passen naar het midden van de detector indien nodig.
4. Controleer de lineariteit van de PBD signaal als functie van de [(dn / dt) / _Cp ρ] termijn volgens vergelijking 2.
5. Plaats de monsteroplossing in dezelfde optische cel als de referentieverbinding houden dezelfde oriëntatie van de optische cel en voor de referentiemeting.
6. Detecteer sample PBD sporen op dezelfde temperatuur als de referentie en controleer de lineariteit van het monster PBD amplitude ten opzichte van het [(dn / dt) / _Cp ρ] termijn.

4. Data Analysis

De grootte van de vervorming is recht evenredig met de volumeverandering door het monster verwarming (AV _th) en nonthermal volumeverandering (AV _nonth) volgens vergelijking 1:

De amplitude van de bemonstering (A _S) En referentie (A _r) PBD signaal kan worden beschreven met behulp van respectievelijk de vergelijkingen 2 en 3.

PBD signaal is recht evenredig met het parameterantwoord instrument (K) en het aantal Einsteins geabsorbeerd _(Ea). De eerste term in vergelijking 2, (dn / dt) (1/ρC _p) Q overeenkomt met het signaal wisselgeld voor de vrijkomende warmte het oplosmiddel. De dn / dt term vertegenwoordigt de temperatuurafhankelijke verandering van de brekingsindex, ρ de dichtheid van het oplosmiddel, _Cp de warmtecapaciteit. Alle parameters bekend voor gedestilleerd water en kan worden bepaald voor een bufferoplossing door vergelijking van een PBD signaal voor de referentieverbinding in gedestilleerd water en in een geschikte buffer. Q is de hoeveelheid warmte returned om het oplosmiddel. De ρ (dn / d ρ) termijn is een eenheid meer constante die onafhankelijk van de temperatuur in het temperatuurbereik 10-40 ° C ^10. An _abs stemt overeen met de verandering van de brekingsindex door de aanwezigheid van absorberende species in de oplossing en het is verwaarloosbaar indien de golflengte van de sonde bundel wordt verschoven ten opzichte van de absorptiespectra van elke species in de oplossing. Het signaal ontstaan ​​uit de referentieverbinding (A _r) wordt uitgedrukt door Vergelijking 3 waar _{Eh ν} is de foton energie op de excitatiegolflengte, _{Eh ν} = 80,5 kcal / mol voor 355 nm excitatie.

1. Neem de amplitude van de referentie-PBD signaal als het verschil tussen de pretrigger en na de trigger-PBD signaal zoals getoond in figuur 3. Op soortgelijke wijze bepaalt de amplitude van de snelle (A _en ^snelle) en langzame fase (A _en ^langzame) Van het monster PBD signaal.
2. De parameter instrumentresponstijd, K elimineren schaal de amplitude van de bemonstering PBD signaal de amplitude van het PBD signaal voor de referentie. De verhouding van het monster signaal het referentiesignaal geeft Vergelijking 4 en kan worden geschreven als:
   
   
3. Met deze vergelijking bepaalt de vrijkomende warmte aan de oplossing (Q) en nonthermal volumeverandering (AV _nonth) geassocieerd met een foto-geïnitieerde reactie van de helling en intercept van respectievelijk een grafiek van [(A _s / A _r) e _{h ν]} termijn versus temperatuur afhankelijke term [(dn / dt) (1/ρCp)].
4. Om het reactievolume en enthalpie verandering voor de snelle en de langzame proces bepalen schaal de waargenomen omvang en enthalpie verandering de juiste quantum opbrengst volgens Vergelijkingen 5-7.
   
   
   
   
   
   
   Voor een meerstaps proces kinetiek plaatsvindt op de tijdschaal tussen 10 psec ~ 200 msec, het volume en de enthalpie veranderingen in verband met de afzonderlijke stappen van de reactie worden bepaald. De amplitudes en looptijden van de afzonderlijke stappen worden geanalyseerd door het aanbrengen van de gegevens aan de functie F (t) die het tijdsprofiel van het volume en enthalpie veranderingen beschrijft.
   
   waarbij α ₀ correspondeert met de A _is ^snel en α _i stemt overeen met een ^langzame _s voor elk proces en τ _i zijn de levensduur van de afzonderlijke reactiestappen. Van de temperatuur-afhankelijkheid van de snelheidsconstante for individuele processen (k _i = 1 / τ _i) de activering enthalpie en entropie parameters kunnen gemakkelijk worden bepaald met behulp Eyrings plaatsen.

Resultaten

Een representatief voorbeeld van PBD sporen voor Ca ^{2 +} foto afgifte van ^{Ca2 +} DM-nitrophen wordt getoond in figuur 3. De snelle fase komt overeen met de foto-splitsing van Ca ^{2 +} DM-nitrophen en Ca ^{2 +} bevrijding, terwijl de langzame fase weerspiegelt Ca ^{2 +} binding aan de nonphotolysed kooi. De plot van het monster PBD amplitude van de snelle en langzame fase geschaald op de amplitude van de referentieverbinding als functie van de temperatuur afha...

Discussie

Het fysieke principe fotothermische werkwijzen is dat een foto-geëxciteerd molecuul verspreidt overtollige energie via vibrationele relaxatie naar de grondtoestand, waardoor thermische verwarming van de omringende oplosmiddel ^1,12. Voor oplosmiddelen zoals water, dit tot een snelle-expansie (AV _Th). Aangeslagen toestand moleculen kunnen ook onder fotochemische processen die leiden tot niet-thermische volumeveranderingen (AV _nonth) door bindingssplitsing / formatie en / of veranderingen i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraazijnzuur	Life Technologies	D-6814	DM-nitrofen, calciumkooi-verbinding, bewaar oplossingen in het donker om fotodissociatie te voorkomen
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethaansulfonzuur)	Sigma Adrich	0909C	HEPES-buffer
Kaliumferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	referentie-verbinding voor PBD-metingen
Natriumchromat	Sigma Aldrich	307831	referentie-verbinding voor PBD-metingen
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	gebruiken als sondebundel voor PBD-metingen
Oscilloscoop,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandbreedte
Nd:YAG-laser	Continuum	ML II	pompbunde voor PBD-metingen
M355; Nd:YAG-laserspiegel	Edmund Optics	47-324	laserspiegel voor 355 nm laserlijn
M1 en M2; Laserdiode spiegel	Edmund Optics	43-532	zichtbare laser vlakke spiegel, golflengtebereik 300-700 nm
P1 en P2; Iris Diafragma	Edmund Optics	62-649	pin-hole om de sonde- en pompbundels te vormen
L1; bi-convexe lens	Thorlabs	LB1844	een lens om de sondebundel op de detector te richten, EFL 50 mm, golflengtebereik 350-2.000 nm
DM, dichroïsche spiegel	Thorlabs	DMLP505	een longpass dichroïsche spiegel met een afsnijgolflengte van 505 nm
F1; Randfilter	Andower	500FH90-25	een langpassfilter met een afsnijgolflengte van 500 nm
Temperatuurgeregeld cuvettehouder	Quantum Northwest	FLASH 300