Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

Walter G. Gonzalez; Jaroslava Miksovska

doi:10.3791/50969

Methodenartikel

Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

DOI:

10.3791/50969

⸱

18 februari 2014

Walter G. Gonzalez¹ , Jaroslava Miksovska¹

¹Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier een toepassing van de fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek in combinatie met een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen tot microseconde en milliseconde dynamiek en energiebalans van structurele veranderingen met betrekking tot calcium vereniging een neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Modulator volgen we verslag .

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotothermische straalafbuiging met fotoakoestische calorimetrie en thermische raster behoort tot de familie van fotothermische methoden die de tijd-profiel volume en enthalpie veranderingen van licht geïnduceerde conformationele veranderingen in eiwitten op microseconde tijdschaal die niet toegankelijk zijn milliseconde traditionele stop bewaken flow instrumenten. Bovendien, omdat algemene wijzigingen in volume en / of enthalpie gepeild, deze technieken kunnen worden toegepast om proteïnen en andere biomacromolecules die een fluorofoor en een chromofoor label of ontbreekt. Om dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met Ca ² monitoren ⁺ binden aan calcium transducers, zoals neuronale calcium sensoren, een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen, wordt gebruikt om foto-trekker een snelle (τ <20 msec) toename van vrije calcium concentratie en het bijbehorende volume en enthalpie veranderingen worden gesondeerd met fotothermische bundeldeflectie techniek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotothermische werkwijzen zoals fotoakoestische calorimetrie, fotothermische straalafbuigingsbuizen (VOB), en voorbijgaande rooster gekoppeld nanoseconde laser excitatie vormen een krachtig alternatief voor optische spectroscopie voorbijgaande voor tijdsopgeloste studies kortstondige tussenproducten ^1,2. In tegenstelling tot optische technieken, zoals transiënte absorptie-en IR-spectroscopie, die volgen het tijdsprofiel van absorptie veranderingen in de chromofoor omgeving; fotothermische technieken detecteren tijdsafhankelijkheid van warmte / volumeveranderingen en daarom waardevolle gereedschappen voor het onderzoeken tijdprofielen optisch "stille" proce....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monster Voorbereidingen

Voer de monstervoorbereiding en alle monster manipulaties in een donkere kamer om een ongewenste uncaging voorkomen.
Oplosbaar DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimethoxyfenyl) - N, N, N ', N'-tetrakis [(oxy-carbonyl) methyl] -1,2-ethaandiamine) in 50 mM HEPES buffer, 100 mM KCl, pH 7,0 tot een eindconcentratie van 400 uM (ε _{350 nm} = 4330 ^M-1 cm ^{-1 9).}
Voeg _CaCl2 van de 0,1 M stockoplossing aan een wenselijke verhouding van [Ca ^{2 +]} te bereiken: [DM-nitrophen]. Voor eiwitten met _Kd voor Ca ^{2 +} associatie groter dan 1....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een representatief voorbeeld van PBD sporen voor Ca ^{2 +} foto afgifte van ^{Ca2 +} DM-nitrophen wordt getoond in figuur 3. De snelle fase komt overeen met de foto-splitsing van Ca ^{2 +} DM-nitrophen en Ca ^{2 +} bevrijding, terwijl de langzame fase weerspiegelt Ca ^{2 +} binding aan de nonphotolysed kooi. De plot van het monster PBD amplitude van de snelle en langzame fase geschaald op de amplitude van de referentieverbinding als functie van de temperatuur afha.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het fysieke principe fotothermische werkwijzen is dat een foto-geëxciteerd molecuul verspreidt overtollige energie via vibrationele relaxatie naar de grondtoestand, waardoor thermische verwarming van de omringende oplosmiddel ^1,12. Voor oplosmiddelen zoals water, dit tot een snelle-expansie (AV _Th). Aangeslagen toestand moleculen kunnen ook onder fotochemische processen die leiden tot niet-thermische volumeveranderingen (AV _nonth) door bindingssplitsing / formatie en / of veranderingen i.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) en J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraazijnzuur	Life Technologies	D-6814	DM-nitrofen, calciumkooi-verbinding, bewaar oplossingen in het donker om fotodissociatie te voorkomen
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethaansulfonzuur)	Sigma Adrich	0909C	HEPES-buffer
Kaliumferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	referentie-verbinding voor PBD-metingen
Natriumchromat	Sigma Aldrich	307831	referentie-verbinding voor PBD-metingen
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	gebruiken als sondebundel voor PBD-metingen
Oscilloscoop,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandbreedte
Nd:YAG-laser	Continuum	ML II	pompbunde voor PBD-metingen
M₃₅₅; Nd:YAG-laserspiegel	Edmund Optics	47-324	laserspiegel voor 355 nm laserlijn
M₁ en M₂; Laserdiode spiegel	Edmund Optics	43-532	zichtbare laser vlakke spiegel, golflengtebereik 300-700 nm
P₁ en P₂; Iris Diafragma	Edmund Optics	62-649	pin-hole om de sonde- en pompbundels te vormen
L₁; bi-convexe lens	Thorlabs	LB1844	een lens om de sondebundel op de detector te richten, EFL 50 mm, golflengtebereik 350-2.000 nm
DM, dichroïsche spiegel	Thorlabs	DMLP505	een longpass dichroïsche spiegel met een afsnijgolflengte van 505 nm
F₁; Randfilter	Andower	500FH90-25	een langpassfilter met een afsnijgolflengte van 500 nm
Temperatuurgeregeld cuvettehouder	Quantum Northwest	FLASH 300

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
Larsen, R. W., Mikšovská, J.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Photothermal Beam Deflection Submillisecond Conformational Changes Calcium Binding Kinetics Protein Volume Changes Enthalpy Change Measurement Caged Calcium Compound Position Sensitive Detector Temperature Dependent Analysis Reaction Volume Determination Thermodynamic Parameter Analysis

Submillisecond Conformational Veranderingen in Eiwitten opgelost door Fotothermische straalafbuiging

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen