Videomorfometrische analyse van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van intrapulmonale slagaders met behulp van murineprecisie gesneden longschijfjes

Samenvatting

Hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) is een belangrijk fysiologisch fenomeen waarbij bij alveolaire hypoxie longperfusie wordt afgestemd op beademing. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Hier beschrijven we ons protocol voor de analyse van HPV van muriene longvaten met diameters van 20-100 μm.

Samenvatting

Acute alveolaire hypoxie veroorzaakt pulmonale vasoconstrictie (HPV) - ook bekend als von Euler-Liljestrand-mechanisme - die dient om longperfusie te matchen met beademing. Tot nu toe zijn de onderliggende mechanismen niet volledig begrepen. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Deze vaatsectie is verantwoordelijk voor de bloedtoevoer van een individuele acinus, die wordt gedefinieerd als het deel van de longdistaal naar een terminale bronchiol. Intra-acinaire slagaders bevinden zich meestal in dat deel van de long dat niet selectief kan worden bereikt door een aantal veelgebruikte technieken, zoals het meten van de longslagaderdruk in geïsoleerde perfuse longen of krachtopnamen van ontleed proximale longslagadersegmenten^1,2. De analyse van subpleurale vaten door real-time confocale laserscan luminescentiemicroscopie is beperkt tot vaten met een diameter tot 50 μm³.

We bieden een techniek om HPV van muriene intrapulmonale slagaders te bestuderen in het bereik van 20-100 μm binnendiameters. Het is gebaseerd op de videomorfometrische analyse van doorsneden slagaders in nauwkeurig gesneden longschijfjes (PCLS). Deze methode maakt de kwantitatieve meting mogelijk van vasoreactiviteit van kleine intra-acinaire slagaders met een inwendige diameter tussen 20-40 μm die zich bevinden bij gussets van alveolaire septa naast alveolaire kanalen en van grotere pre-acinaire slagaders met binnendiameters tussen 40-100 μm die grenzen aan bronchiën en bronchiolen. In tegenstelling tot real-time beeldvorming van subpleurale vaten bij verdoofde en geventileerde muizen, vindt videomorfometrische analyse van PCLS plaats onder omstandigheden die vrij zijn van schuifspanning. In ons experimentele model vertonen beide arteriële segmenten een monofasische HPV bij blootstelling aan medium vergast met 1% O₂ en de respons vervaagt na 30-40 minuten bij hypoxie.

Inleiding

In de meeste systemische vasculaire bedden induceert hypoxie vasodilatatie, in vergelijking met de vasoconstrictie veroorzaakt door hypoxie in de long vasculatuur. Deze longspecifieke reactie op verlaagde zuurstofspanning wordt hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) genoemd, wordt binnen enkele seconden ingeschakeld en keert snel terug na terugschakelen naar normoxische beademing. Hoewel HPV al meer dan 60 jaar bekend is, zijn de cellulaire zuurstofsensor(en) en de signaalcascade(n) die resulteert in vasoconstrictie nog steeds onderwerp van discussie. Er is een relatief brede consensus dat hypoxie-opgeroepen redox- en ROS-veranderingen essentieel zijn voor HPV en de ontwikkeling van pulmonale hypertensie (beoordeeld in Sylvester et al. ⁴ en Schumacker e.a. ⁵). Onze eigen gegevens ondersteunen een centrale rol van complex II van de mitochondriale ademhalingsketen in HPV^6,7. Onlangs, Wang et al. presenteerde een volledig nieuw concept voor zuurstofdetectie en HPV: Op basis van hun gegevens stellen ze voor dat alveolaire hypoxie wordt waargenomen door de aangrenzende haarvaten die membraandepolarisatie van de endotheelcellen veroorzaken. De respons wordt gepropageerd via connexion 40 gap junctions van de endotheelcellen wat leidt tot vernauwing van gladde spiercellen van upstream arterioles⁸.

De slagaders van de long lopen langs de luchtwegen, vertakken zich ermee, nemen voortdurend af in diameter en leveren ten slotte bloed aan het capillaire systeem in de alveolaire wanden. Deze arteriële circulatie bestaat uit anatomisch en functioneel verschillende segmenten. De proximale buisslagaders, gekenmerkt door een overvloed aan elastische vezels in de wanden, worden gevolgd door volledig gespierde intrapulmonale slagaders die de pulmonale vasculaire weerstand grotendeels beheersen. Stap voor stap gaan deze slagaders over in segmenten waar de spierlaag onvolledig wordt, en ten slotte zijn de vaten vrij van gladde spier actine-immunoreactieve cellen. De intra-acinaire slagader die een individuele longacuinus met bloed voedt, vertegenwoordigt een gedeeltelijk gespierd segment⁶. Evenzo vertegenwoordigt het longslagadersysteem geen uniforme structuur met betrekking tot de hypoxische respons, maar vertoont het een duidelijke regionale diversiteit^9,10. Bijvoorbeeld, in proximale longslagaders geïsoleerd van rattenlongen induceert hypoxie een bifasische respons, met een aanvankelijke snelle samentrekking van korte duur die - na onvolledige ontspanning - wordt gevolgd door een tweede langzame maar aanhoudende contractie¹¹. In weerstandsslagaders geïsoleerd van ratlongparenchym als vierde- en vijfde-deling van longslagaders (uitwendige diameter <300 μm), veroorzaakt hypoxie monofasische vernauwing⁹. Reeds in 1971 concludeerden Glazier en Murray uit metingen van veranderingen in de capillaire rode bloedcelconcentratie in longen van honden geventileerd met hypoxische gasmengsels dat de door hypoxie veroorzaakte toename van de vasculaire weerstand voornamelijk vóór de haarvaten voorkwam¹². Tegenwoordig is intravitale microscopie van intacte longen van verdoofde en mechanisch geventileerde muizen een krachtig hulpmiddel voor de analyse van de longmicrovasculatuur^13,14. Excisie van een cirkelvormig venster in de thoracale wand geeft microscopische toegang tot het oppervlak van de long en maakt de analyse van subpleurale longvaten met een diameter tot 50 μm mogelijk. Door deze techniek te combineren met de infusie van FITC-dextran, Tabuchi et al. aangetoond dat alleen middelgrote arteriolen met diameters van 30-50 μm een duidelijke respons vertonen op hypoxie die gedurende een periode van 60 minuten met een lichte verzwakking na 30 minuten aanhield. Kleine arteriolen met diameters van 20-30 μm vertoonden daarentegen slechts een kleine respons op hypoxie³. Deze techniek maakt het echter niet mogelijk om slagaders met een diameter groter dan 50 μm te analyseren, omdat deze vaten zich te diep in het longweefsel bevinden.

Om de kloof in de analyse van grote en zeer kleine longslagaders (zoals de subpleurale vaten) van muriene longen te overbruggen, hebben we een methode aangenomen die werd beschreven door Martin et al. voor de analyse van de reactiviteit van de luchtwegen¹⁵. Gebaseerd op een agarose gel instilling techniek, het vergemakkelijkt de bereiding van precisie gesneden longschijfjes (PCLS) van dit relatief zachte en elastische orgaan. Binnen de PCLS vasoreactiviteit van doorsneden slagaders met een inwendige diameter tussen 20-100 μm kan direct worden waargenomen door videomicroscopie. Toepassing van geneesmiddelen tijdens de hypoxische incubatie van de PCLS maakt de analyse van hun effecten op HPV mogelijk. Het is van bijzonder belang dat deze techniek ook kan worden toegepast op genetisch gemanipuleerde muizen. Op basis van hun locatie in de long classificeren we de slagaders als pre- en intra-acinaire vaten, met binnendiameters van respectievelijk 20-40 μm en 40-100 μm. Onder een functioneel zicht voorziet de intra-acinaire slagader een individuele longacuinus van bloed en de pre-acinaire slagader zijn de voorgaande vaatsecties. Het opnemen van foto's op een digitale camera maakt de daaropvolgende kwantificering van de vasoreactie mogelijk. Een voor de hand liggend kenmerk van dit PCLS-model is het gebrek aan schuifspanning dat op het endotheel inwerkt. In doordrenkte vaten leidt acute HPV daarentegen tot een toename van schuifspanning, waardoor secundaire mechanismen zoals NO release¹⁶worden geïnduceerd. Bovendien maakt het gebruik van PCLS metingen van HPV mogelijk zonder extrapulmonale neurale of hormonale invloeden. In tegenstelling tot celkweeksystemen, bijvoorbeeld bereid uit canine pulmonale gladde spiercellen¹⁷, is de histologische architectuur van de vaatwand bijna volledig bewaard gebleven.

Samengevat biedt dit protocol een nuttige methode voor de analyse van potentiële moleculaire zuurstofsensoren en/of cellulaire routes die verantwoordelijk zijn voor HPV van intrapulmonale slagaders met inwendige diameters tussen 20-100 μm onder omstandigheden die vrij zijn van schuifspanning.

Protocol

1. Bereiding van gasmengsels, apparatuur, instrumenten en oplossingen

In deze sectie worden de benodigde apparatuur en de installatie voor het protocol beschreven. Aanvullende details en informatie van de fabrikant vindt u in de bijbehorende tabel.

1. Verkrijgen of bereiden van de volgende gasmengsels:
   1. Twee flessen met normoxisch gasmengsel bestaande uit 21% O₂, 5,3% CO₂, 73,7% N₂.
   2. Eén fles met hypoxisch gasmengsel bestaande uit 1% O₂, 5,3% CO₂, 93,7% N₂.
2. Verzamel de volgende apparatuur:
   1. Een magnetron, voor het smelten van de agarose.
   2. Een verwarmingskast, voor het uitwassen van de agarose uit de longsecties (zie hieronder). Plaats een buis verbonden met een fles met normoxisch gasmengsel in de kast.
   3. Een vibratoom met geschikte scheermesjes, voor het snijden van de longen in plakjes van 200 μm dik. Het is voordelig als de vibratome is voorzien van een koelset om de buffer in het vibratomebassin af te koelen.
   4. Een doorstroom superfusiekamer gemonteerd op een omgekeerde microscoop, voor analyse van HPV van intrapulmonale slagaders.
      1. Om de fixatie van de longsecties aan de onderkant van de kamer te vergemakkelijken, sluit u nylon snaren aan op een platina ring (zelfgebouwd). Sluit de perfusiekamer aan op een peristaltische pomp met debieten die zijn ingesteld op respectievelijk 0,7 ml/min en 6 ml/min.
      2. Monteer de apparatuur zodat tijdens de experimenten de media worden opgeslagen in een waterbad van 37 °C en worden besmaald met normoxisch of hypoxisch gas met 21 G x 4 3/4 canules. Gebruik bovendien een tweede aansluiting van de gasfles om de normoxische/hypoxische gasmengsels in het luchtruim van de perfusiekamer te kunnen voeren. Zorg ervoor dat alle buizen van dit systeem gasdicht zijn.
   5. Een CCD-camera gemonteerd op een rechtopstaande omgekeerde microscoop om beelden van de geanalyseerde slagader op te nemen.
   6. Bereid de volgende instrumenten voor:
      1. Voor de voorbereiding van de longen: een steriele ontledingsset inclusief een ruwe schaar en twee paar tangen, een fijne schaar voor het openen van de borstkas, een microscissor om een gat in de luchtpijp te snijden voor het vullen van de agarose en het naaien van katoen (ongeveer 20 cm) voor ligatie van de luchtpijp om uitstroom van de agarose te voorkomen.
      2. Voor het vullen van de luchtwegen met agarose: sluit een spuit van 2 ml aan op de flexibele plastic buis van een indwellende canule (20 G x 1 1/4).
      3. Voor perfusie van de longen met buffer: bevestig een spuit van 50 ml als bufferreservoir ongeveer 40 cm boven de werkplek voor de voorbereiding van de muis.
      4. Voor uitstroom van de buffer: sluit de spuit aan op een buis waaraan een canule van 25 G x 1 is bevestigd. Gebruik een klem bij de buis om de uitstroom aan te passen tot ongeveer 1 druppel/sec (ongeveer 0,3-0,4 ml/min).
   7. Bereid de volgende buffers en media voor:
      1. Maak 1.000 ml HEPES-Ringer buffer (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl₂•6H₂O, 2,2 mM CaCl₂•2H₂O, 11 mM glucose, pH 7,4). Bewaar de steriele gefiltreerde buffer (poriegrootte van het filter: 0,2 μm) bij 4 °C.
   8. Ongeveer 30 minuten voordat u begint met het isoleren van de longen, bereidt u de volgende oplossingen voor:
      1. Los 1,5% w/v laag smeltpunt agarose op in HEPES-Ringer buffer (totaal volume 10 ml) en smelt het door te koken in een magnetron. Koel het vervolgens af tot 37 °C door opslag in een verwarmingskast. Verwarm de spuit van 2 ml voor het vullen van de agarose in de longluchtwegen.
      2. Neem 20 ml van de HEPES-Ringer buffer, voeg heparine toe aan een eindconcentratie van 250 I.U./ml en verwarm de buffer tot 37 °C. Voeg vlak voor gebruik natrium nitroprusside toe aan een eindconcentratie van 75 μM. Dit is de perfusiebuffer voor het afvloeien van het bloed uit de long vasculatuur.
      3. Doe 200 ml HEPES-Ringer buffer in een glazen beker en bewaar deze op ijs. Deze buffer is nodig voor het afkoelen van de met agarose gevulde geïsoleerde longen.
      4. Vul ongeveer 200 ml MEM aangevuld met 1% penicilline/streptomycine in een glazen bekerglas en bewaar het bij 37 °C in de verwarmingskast. Bubbel het medium met normoxisch gasmengsel. Dit zal worden gebruikt voor het verwijderen van de agarose uit de longsecties.
      5. Verwarm 2 flessen MEM aangevuld met 1% penicilline/streptomycine in een waterbad voor tot 37 °C en bubbel ze met respectievelijk normoxisch en hypoxisch gasmengsel gedurende ten minste 2 uur voordat u met de videomorfometrische metingen begint. Per meting is ongeveer 250 ml MEM nodig.
   9. Verzamel de volgende aanvullende materialen:
      1. 70% EtOH voor desinfectie.
      2. Stamoplossing van heparine (25.000 I.U./5 ml), bewaard bij 4 °C (zie hierboven).
      3. Stamoplossing van de NO donor natrium nitroprusside (Nipruss): 10 mM in H₂O, opgeslagen op ijs (zie hierboven).
      4. Stamoplossing van tromboxaan analoog U46619: 10 μM in ethanol, opgeslagen op ijs.
      5. Superlijm.
      6. Naaien van katoen voor ligatie van de luchtpijp na het vullen met agarose.

2. Dieren

Gebruik muizen (bijvoorbeeld van de stam C57Bl6) van beide geslachten op een leeftijd van 10-25 weken. HPV kan ook worden geanalyseerd in knock-out stammen en de bijbehorende wilde soorten.

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de lokale institutionele raden.

3. Isolatie van muriene longen en voorbereiding van precisie gesneden longschijfjes (PCLS)

1. Dood de muis door cervicale dislocatie. Steriliseer onmiddellijk na het doden het ventrale lichaamsoppervlak met 70% EtOH en gebruik de ruwe schaar om de huid langs de ventrale middellijn van de kin naar het bekken te snijden.
   Opmerking: Aangezien bekend is dat inhalatieve anesthetica zoals isofluraan een invloed hebben op de vasculaire toon^18,19,mag u geen vluchtige anesthetica gebruiken.
2. Na het openen van de buikholte, zet de darmlussen opzij en snijd de grote buikvaten voor bloeding. Na het penetreren van het middenrif met de fijne schaar, zullen de longen instorten als gevolg van luchtintrede in de pleuraholte. Gebruik de schaar om het diafragma los te maken van de inferieure thoracale opening. Snijd de ribben en het sleutelbeen lateraal om het ventrale deel van de scheurkooi te verwijderen.
   Opmerking: Het is belangrijk dat de longen in deze stap niet worden beschadigd, omdat anders een opgeblazen gevoel van de longen met agarose onmogelijk zal zijn! Gebruik alleen steriele instrumenten en laboratoriumglaswerk.
3. Voordat u begint met de perfusie van de long vasculatuur, snijdt u een klein gaatje in de linker hartkamer van het hart voor de afvoer van de buffer. Vul het spuitreservoir met warme (37 °C) HEPES-Ringer buffer met heparine en natrium nitroprusside (perfusiebuffer) en doordrenkt het long vasculatuur langzaam via de rechterventrikel.
   Opmerking: Perfusie is efficiënt wanneer de longen van kleur veranderen en een wit uiterlijk krijgen. In deze stap is het belangrijk om natrium nitroprusside toe te voegen aan de perfusiebuffer; dit voorkomt dat de pre-acinaire slagaders van het omringende weefsel afscheuren.
4. Verwijder de speekselklieren, kleine spieren en bindweefsel uit de luchtpijp. Koppel de luchtpijp los van het omringende bindweefsel en draadnaaikatoen tussen slokdarm en luchtpijp voor latere ligatie.
5. Gebruik de microscissor om een klein gaatje in het bovenste deel van de luchtpijp te snijden tussen twee naburige luchtpijpkraakbeen. Steek nu de flexibele plastic pijp van een iv-inwonende canule via het kleine gaatje in de luchtpijp en bevestig deze voorzichtig met het naaikatoen. Vul de luchtwegen langzaam met het warme (37 °C) lage smeltpunt agarose. Let op de longen: In het begin begint de rechterlong uit te breiden, gevolgd door de linkerlong. De vulling is voltooid wanneer beide longen worden opgeblazen tot een volume dat vergelijkbaar is met de in vivo situatie (ongeveer 1,2-2,0 ml afhankelijk van geslacht, leeftijd en gewicht).
   Opmerking: Als slechts één long uitzet, kan de plastic buis te diep zijn ingebracht zodat deze de bronchus heeft bereikt. In dit geval moet het een beetje worden uitgetrokken. Houd er rekening mee dat de agarose zal stollen wanneer het geleidelijk afkoelt.
6. Wanneer de longen vol zijn, trekt u tegelijkertijd de plastic pijp eruit en ligat u de luchtpijp met het naaikatoen om uitstroom van de agarose te voorkomen. Snijd vervolgens de luchtpijp boven de ligatuur en maak longen en hart op blok van de borst los.
   Opmerking: Voor beginners kan het nuttig zijn om een collega om ondersteuning te vragen in de ligatiestap.
7. Breng het orgaanpakket over in een ijskoude HEPES-Ringer buffer om de agarose te stollen. Dit gebeurt binnen een paar minuten.
8. Scheid de afzonderlijke longlobben en bevestig één kwab met superlijm op de monsterhouder van het vibratoom.
   Opmerking: Het is handig om een stuk champagnekurk op de houder te plakken die dient als skewback tijdens het snijden van het elastische longweefsel. Afhankelijk van de gebruikte longkwab en de oriëntatie ervan op de monsterhouder, kan de verkregen PCLS geschikter zijn voor analyse van kleine of grote vaten. Meestal gebruiken we de linkerkwab en de rechter schedelkwab voor de bereiding van de PCLS. Om doorsneden kleine intra-acinaire slagaders te krijgen, lijmt u de schedel rechterkwab met de hilum op de houder en snijdt u deze uit de periferie. Om doorsneden voor-acinaire slagaders te krijgen, lijnt u het hilum van de rechterkwab uit met de champagnekurk.
9. Gebruik een vibratoom uitgerust met een vers scheermesje om de longkwab in plakjes van 200 μm dik te snijden (snelheid: 12 = 1,2 mm/sec; frequentie: 100; amplitude: 1,0). Verzamel de PCLS in het vibratoombassin gevuld met 4 °C koude HEPES-Ringer buffer.
   Opmerking: Koeling van de HEPES-Ringer wordt aanbevolen, maar niet essentieel.
10. Voor het verwijderen van de agarose, breng de orgaansecties over in een glazen beker gevuld met ongeveer 200 ml 37 °C warm MEM. Doe het bekerglas in de verwarmingskast waarin een buis wordt geplaatst die is verbonden met een fles met normoxisch gasmengsel. Bel de MEM met het normoxische gas zodat de longsecties langzaam in het medium bewegen. Na ongeveer 2 uur worden de "agarose plaques" die het luchtruim vullen uit het longweefsel verwijderd. Dit is te herkennen aan het feit dat de secties niet langer aan de bovenkant van het medium zwemmen, maar zich op de bodem van het bekerglas nestelen.

4. Videomorfometrische analyse van intrapulmonale slagaders van PCLS

1. Voor videomorfometrische analyse van intrapulmonale slagaders, breng één PCLS over in de doorstroom superfusiekamer gevuld met 1,2 ml normoxische vergaste MEM. Bevestig de PCLS aan de onderkant van de kamer met nylon snaren verbonden met een platina ring (buiten/binnendiameter: 14/10 mm).
2. Scan de PCLS microscopisch op doorsneden slagaders met binnendiameters tussen 20-100 μm.
   
   Opmerking: Het lumen van de slagaders wordt bekleed door platte endotheelcellen. De omringende gladde spiercellen kunnen in het fasecontrastbeeld worden geïdentificeerd als een "donkere ring" rond het lumen (zie fasecontrastafbeeldingen in figuur 2). Daarentegen kunnen de luchtwegen worden geïdentificeerd door het aanvankelijk gepseudonimificeerde zuilvormige epitheel dat op weg naar het pleuraoppervlak overgaat in een eenvoudig zuilvormig epitheel, gevolgd door een eenvoudig cuboïdaal epitheel.
   
   1. Meet de binnendiameter aan het begin van elk experiment.
      Opmerking: In licht schuin gesneden vaten kan de werkelijke binnendiameter van de buisstructuur worden bepaald in een hoek van 90° ten opzichte van de langste as van het lumen. Grote pre-acinaire slagaders met binnendiameters >40 μm lopen naast bronchiën en bronchiolen. Kleine intra-acinaire slagaders met een binnendiameter <40 μm bevinden zich op gussets van alveolaire septa naast alveolaire en alveolaire kanalen⁶.
3. Experimenteel ontwerp:
   1. Begin elk experiment met een "aanpassingsfase" waarin de kamer wordt doordrenkt met normoxisch vergast medium (debiet: 0,7 ml/min; 10 min). Test vervolgens de levensvatbaarheid van het vat: Analyseer de contractiliteit van de slagader door toevoeging van 12 μl van 10 μM U46619 (eindconcentratie 0,1 μM; 10 min; geen stroom).
      Opmerking: Voor dit werk wordt een vat gedefinieerd als levensvatbaar wanneer het luminale gebied met ten minste 30% wordt verminderd (voor meetmethode zie hieronder).
   2. Na het uitwassen van het geneesmiddel met normoxisch vergast medium (debiet: 6 ml/min; 10 min) verwijdt u de slagader door toepassing van 3 μl 10 mM Nipruss (eindconcentratie 25 μM; 10 min; geen stroom).
   3. Nogmaals, verwijder het medicijn door een wasbeurt van 10 minuten met normoxisch vergast medium (debiet: 6 ml/ min), gevolgd door 10 minuten bij een stroom van 0,7 ml / min.
   4. Induceer hypoxische pulmonale vasoconstrictie door incubatie van de PCLS met hypoxisch vergast medium (debiet: 0,7 ml/min; 40 min). Voer met een extra buissysteem het hypoxische gasmengsel in het luchtruim van de perfusiekamer.
   5. Verwijder het hypoxische medium met een wasbeurt van 20 minuten met normoxisch vergast medium (debiet: 6 ml/min).
   6. Voeg aan het einde van elk experiment 1,2 μl van 10 μM U46619 (eindconcentratie 0,01 μM; 20 min; geen stroom) toe aan de perfusiekamer om vasoconstrictie te induceren.
      Opmerking: Deze laatste stap maakt het mogelijk om te bepalen of een verandering in de hypoxische respons (bijvoorbeeld geïnduceerd door gelijktijdige toepassing van een geneesmiddel in de hypoxische fase of waargenomen in een PCLS bereid uit een knock-out muisstam) specifiek is voor de door hypoxie veroorzaakte vernauwing of dat het een algemene impact op contractiliteit weerspiegelt. De concentratie van 0,01 μM komt overeen met de EC50-waarde van U46619, die werd geschat in eerdere concentratiecontractiemetingen (niet gepubliceerd).
   7. Gebruik een andere PCLS om controle-experimenten uit te voeren met normoxic in plaats van hypoxisch vergast MEM- en normoxisch gasmengsel in het luchtruim van de perfusiekamer.

5. Analyse van vasoreactiviteit en grafische presentatie

1. Met behulp van geschikte software maak je elke minuut foto's van de doorsneden slagader tijdens het hele experiment.
2. Met behulp van geschikte software evalueren veranderingen van het lichtgevende gebied van de vaten door het bekleden van de binnengrenzen met de hand met behulp van full-screen foto's.
   Opmerking: Het is voldoende om elke tweede foto te analyseren om duidelijke grafieken te krijgen. Wanneer echter de ene voorwaarde in de doorstroom superfusiekamer wordt gewijzigd in een andere, analyseert u elk beeld. De overige foto's dienen als back-up voor het geval één foto niet kan worden geanalyseerd.
   Helaas moet deze tijdrovende stap met de hand worden gedaan en niet met de juiste programma's, omdat soms bloedcellen aan de vaatwand zijn bevestigd die tijdens de meting bewegen of het geen perfecte doorsnede van het vat is, maar een tangentiële sectie waarin een betrouwbare lokalisatie van de binnengrenzen alleen onder visuele controle kan worden gedaan.
3. Definieer de waarde die aan het begin van het experiment voor het gebied van het vatlumen wordt verkregen als 100% en druk vasoconstrictie of dilatatie uit als relatieve afname of toename van deze waarde.
4. Zet voor elk experiment het relatieve luminale gebied tegen de tijd in met behulp van geschikte software.
5. Om verschillende experimenten samen te vatten, plot u de middelen van de relatieve luminale gebieden +/- standaardfout van het gemiddelde (SEM) tegen de tijd.
   Opmerking: Voor een duidelijke presentatie van de effecten van verschillende stoffen op hypoxie- of U46619-geïnduceerde pulmonale vasoconstrictie of van de hypoxische respons van knock-out muisstammen, kan de beginfase van de experimenten, waarin de levensvatbaarheid van het vat wordt getest, uit de grafiek worden weggelaten. In dit geval worden de waarden die aan het begin van de blootstelling aan verminderde zuurstof worden verkregen, gedefinieerd als 100%.

6. Statistische analyse

1. Analyseer verschillen tussen experimentele groepen met de Kruskal-Wallis- en de Mann-Whitney-test, waarbij p≤0,05 als significant wordt beschouwd en p≤0,01 als zeer significant.
   Opmerking: Voor aanvullende informatie over de voorbereiding en het operationele gebruik van PCLS zie ook^20,21.

Resultaten

In figuur 1 worden de resultaten van de meting van HPV van een grote pre-acinaire slagader en in figuur 2 van kleine intra-acinaire slagaders gegeven. In de fasecontrastbeelden (figuren 1A en 2A) wordt duidelijk dat het mogelijk is om deze 2 klassen slagaders te onderscheiden op basis van hun locatie in het longweefsel: Pre-acinaire slagaders lopen in de buurt van bronchiën en bronchioli (figuur 1A), terwijl de intra-acinaire slagaders zich bevinden op gussets van alveolaire septa en omgeven zijn door alveolaat (Figuur 2A). Met een beetje oefening is het mogelijk om de veranderingen in het luminale gebied te zien als reactie op U46619 op de fasecontrastfoto's (figuren 1A en 2A). Hypoxische pulmonale vasoconstrictie is echter vaak niet zo uitgesproken en wordt pas duidelijk na volledige evaluatie van de veranderingen van de luminale gebieden (figuren 1B, 1C, 2B en, 2C). Om didactische redenen hebben we een voorbeeld gegeven van een pre-acinaire slagader die een ongewoon uitgesproken vasoconstrictie vertoont. Gemiddeld resulteert HPV in een vermindering van 20-30% van het luminale gebied.

In figuur 2 worden de opnames van kleine intra-acinaire slagaders geïncubeerd met hypoxisch vergast medium met of zonder 50 μM pinacidil (een niet-selectieve opener van mitochondriale ATP-gevoelige kaliumkanalen) getoond en wordt het remmende effect van het geneesmiddel duidelijk zichtbaar. Het laatste deel van het experiment toont de selectiviteit van de werking van het medicijn op HPV: Vasoconstrictie geïnduceerd door de tromboxane analoge U46619 wordt niet veranderd door de toevoeging van pinacidil. Inderdaad, de curve voor de blootgestelde slagader de pinacidil loopt duidelijk lager dan de andere twee, maar de mate van vermindering van het luminale gebied door U46619 alleen is vergelijkbaar. In dit geval was het de onvolledige omkering van HPV die het verschil tussen de curven veroorzaakt. In deze grafiek is ook een slagader blootgesteld aan normoxisch vergast medium opgenomen als extra controle. Onder deze voorwaarde zijn er geen veranderingen van het luminale gebied waarneembaar.

In figuur 3 worden de gegevens van de volledige reeks metingen over de invloed van pinacidil op HPV weergegeven. Ter vergelijking van de twee groepen voor statistische verschillen werden de datasets van de aangegeven tijdspunten geanalyseerd met de Kruskal-Wallis- en de Mann-Whitney-test. HPV werd duidelijk afgeschaft in aanwezigheid van pinacidil, terwijl U46619-geïnduceerde contractie onveranderd bleef.

Als alternatief is het mogelijk om verschillen tussen groepen te identificeren door het gebied onder de curve te vergelijken, zoals beschreven in Müller-Redetzky et al. ²²

Figuur 1. Meting van HPV van een grote pre-acinaire slagader. (A) Fasecontrastbeelden van een doorsnede van een pre-acinaire slagader (a) die in de buurt van een doorsnede bronchus (B) loopt. De foto's worden genomen op de in (B) aangegeven tijdstippen door cirkels: aan het begin van de meting (a), aan het einde van de behandeling met U46619 (b), aan het einde van de blootstelling aan Nipruss (c), na 30 of 40 minuten in hypoxisch vergast medium (d, e), na het wassen met normoxisch vergast medium (f), en na de uiteindelijke toepassing van U46619 (g). In de grafiek (B) worden veranderingen van het luminale gebied uitgezet tegen de tijd, terwijl het luminale gebied aan het begin van het experiment wordt gedefinieerd als 100% en vasoconstrictie /-dilatatie worden gegeven als relatieve waarden. In dit geval veroorzaakt hypoxie een vermindering van 60% van het luminale gebied. (C) Voor een duidelijkere weergave van de hypoxische respons is de beginfase van het experiment waarin de vasoreactiviteit werd getest niet opgenomen, maar wordt de waarde die onmiddellijk vóór blootstelling aan verminderde zuurstof is verkregen, vastgesteld op 100% (zie ook figuur 2). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Impact van pinacidil (een niet-selectieve opener van mitochondriale ATP-gevoelige kaliumkanalen; mitoKATP) op HPV van kleine intra-acinaire slagaders. (A) Intra-acinaire slagaders (a) bevinden zich op gussets van alveolaire septa. Alv = alveolus. De volgorde van de individuele omstandigheden die in deze experimenten worden toegepast, wordt gegeven in de kop van de grafiek (B). Hypoxische blootstelling wordt uitgevoerd in aanwezigheid of afwezigheid van 50 μM pinacidil. Controle incubaties worden gedaan met normoxisch vergast medium. De foto's in (A) worden genomen aan het begin van de meting (a, a', a"), aan het einde van de behandeling met U46619 (b, b', b"), aan het einde van de blootstelling aan Nipruss (c, c', c"), na 30 of 40 min in hypoxisch of normoxisch vergast medium (d, d', d"; e, e', e"), na het wassen met normoxisch vergast medium (f, f). Voor een duidelijkere weergave van de respons op normoxia/hypoxie/hypoxie+pinacidil worden de waarden die onmiddellijk vóór blootstelling aan normoxisch-/hypoxisch-vergast medium zijn verkregen, vastgesteld op 100% (C). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Remming van HPV door pinacidil. De opnames van kleine intra-acinaire slagaders blootgesteld aan hypoxisch vergast medium met of zonder 50 μM pinacidil worden samengevat en gepresenteerd als middel ± SEM. In (A) worden de volledige opnamen gegeven, in (B) worden de relatieve gegevens met betrekking tot de waarde aan het begin van de hypoxische incubatie weergegeven. Er is geen vasoreactiviteit waarneembaar in PCLS die worden blootgesteld aan hypoxisch vergast medium dat pinacidil bevat. Vasoconstrictie geïnduceerd door U46619 wordt niet beïnvloed door het medicijn. "n" tussen haakjes verwijst naar het aantal slagaders/aantal dieren waaruit PCLS is gemaakt. Met andere woorden, het eerste getal beschrijft het aantal geanalyseerde longsecties en het tweede getal geeft het aantal muizen waaruit deze secties zijn bereid. Op de gegeven tijdstippen worden de verschillen tussen beide groepen op significantie getest. n.s.: niet significant, *: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Schematisch overzicht van de methode. Kortom, muizen worden gedood door cervicale dislocatie. Na het openen van de borstkas worden de longen gevuld met laag smeltpunt agarose en na afkoeling gesneden in 200 μm dikke precisie gesneden longschijfjes (PCLS). Na het verwijderen van de agarose bij 37 °C wordt één PCLS overgebracht naar de doorstroom superfusiekamer waarin het wordt blootgesteld aan normoxisch medium of aan medium vergast met 1% O₂. Vasoreactiviteit wordt geregistreerd als veranderingen in het luminale gebied. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussie

De geïsoleerde geventileerde en doordrenkte muislong is een uitstekend model voor de analyse van de fysiologische respons van het long vasculaire systeem op veranderingen in de zuurstoftoevoer en maakt onder andere de continue meting van de longslagaderdruk¹mogelijk. Dit model staat echter niet toe dat die vasculaire segmenten worden geïdentificeerd en geanalyseerd die de sterkste respons op hypoxie laten zien. Dit is het voordeel van onze videomorfometrische analyse van PCLS die de meting van HPV van individuele slagaders met binnendiameters van 20-100 μm vergemakkelijkt. PCLS vertegenwoordigen een aantrekkelijk in vitro model omdat ze sterk lijken op het orgaan waaruit ze zijn voorbereid. In tegenstelling tot celkweeksystemen zijn alle celtypen aanwezig in hun oorspronkelijke weefselmatrixconfiguratie. Bovendien is één long voldoende voor de bereiding van veel PCLS, zodat ten minste gedeeltelijk experimenten kunnen worden gestandaardiseerd door het gebruik van secties van dezelfde muis. Volgens het 3R-concept (reductie, verfijning en vervanging van proefdieren in de biowetenschappen) van Russell en Burch²³ pleit dit feit ook voor het gebruik van PCLS.

Men moet echter in gedachten houden dat het weefsel wordt beschadigd door snijden met een vibratoom en longitudinale signalering, bijvoorbeeld via de endotheelcellen zoals gepostuleerd door Kübler et al. ¹⁴ is niet meer mogelijk.

Aanvankelijk werden PCLS voornamelijk toegepast voor biochemische, farmacologische en toxicologische studies, maar in de tussentijd worden ze ook gebruikt voor het meten van bronchiale contractiliteit, mucociliaire functie en vasculaire reacties (voor beoordelingen zie Sanderson²⁰ en Davies²¹). Held et al. een studie hebben uitgevoerd waarin zij de modellen van geïsoleerde doordrenkte en geventileerde muislong en van PCLS²⁴vergeleken . Ze ontdekten door analyse van de reacties van luchtwegen en longvaten op een verscheidenheid aan endogene mediatoren dat belangrijke kenmerken van de hele long in PCLS werden gehandhaafd.

Bij PCLS worden hypoxische aandoeningen niet vastgesteld via de luchtwegen zoals in de intacte long, maar door incubatie van de longsectie in hypoxisch vergast medium. We hebben de zuurstof partiële druk (pO₂₎van medium voorvergast met respectievelijk 1% O_2,5,3% CO_2,93,7% N₂ en met 21% O_2,5,3% CO_2,73,7% N₂geanalyseerd met behulp van een bloedgasanalysator. Onmiddellijk voordat het in de perfusiekamer werd gevoerd, was pO₂ van de hypoxische vergaste MEM 40 mmHg en die van het normoxische vergaste medium 160 mmHg⁶.  In de intacte long wordt HPV geïnduceerd wanneer alveolaire pO₂ daalt tot onder 50 mmHg²⁵, een situatie die duidelijk kan worden nagebootst door toepassing van hypoxisch vergast medium. Onze gegevens over de omvang van HPV komen goed overeen met resultaten verkregen met een andere experimentele aanpak. Yamaguchi e.a. geïsoleerde rattenlongen hebben toegepast om microvessels met een diameter van 20-30 μm te onderzoeken door real-time confocale laserscan-luminescentiemicroscopie gekoppeld aan een zeer gevoelige camera met een beeldversterker¹⁰. Ze zagen een gemiddelde diametervermindering van 2,7 μm na blootstelling van de longen aan hypoxie. Men kan berekenen dat een vermindering van 20% van het luminale gebied zoals we het in ons systeem meten overeenkomt met ongeveer 15% afname in diameter.

In onze experimenten hebben we de slagaders geclassificeerd als respectievelijk pre- en intra-acinaire vaten met binnendiameters van 40-100 μm en 20-40 μm. Bij mensen vindt de overgang van spier- naar niet-amusculaire slagaders plaats in het diameterbereik van 70-100 μm. Bij muizen zijn gladde spiercellen aanwezig tot een uitwendige diameter van 20 μm²⁶. Om deze reden is het niet mogelijk om slagaders met diameters onder 20 μm te analyseren, omdat ze niet betrouwbaar kunnen worden geïdentificeerd op basis van het fasecontrastbeeld. Aan de andere kant van de schaal zijn vaten met diameters van meer dan 100 μm nauwelijks te vinden in PCLS en vaak ontdaan van het omliggende weefsel.

Eigenlijk worden een aantal moleculaire kandidaten besproken als moleculaire zuurstofsensor(en) of als onderdeel van de signaalcascade resulterend in HPV (voor een overzicht zie Sylvester et al. ⁴). Zodra geschikte knock-out muizen beschikbaar zijn, kan videomorfometrie worden gebruikt voor de analyse van vasoreactiviteit van pre- en intra-acinaire slagaders in vergelijking met wilde dieren. PCLS zijn echter ook gebruikt voor andere kwesties: Faro et al. gebruikt om de ontwikkeling van het endotheelafhankelijke verwijding in de long na de geboorte te karakteriseren²⁹ en PCLS bereid door cavia's die dagelijks gedurende 2 weken aan rook of lucht werden blootgesteld, werden gebruikt om de impact van sigarettenrook op vasoreactiviteit aan te tonen via inductie van endotheeldisfunctie³⁰.

Kritieke stappen binnen het protocol

In onze experimenten classificeerden we de slagaders als pre-acinair (binnendiameters van 40-100 μm) en intra-acinair (binnendiameters van 20-40 μm). Vooral voor de voorbereiding van longsecties die moeten worden gebruikt voor de analyse van grotere vaten is het belangrijk om natrium nitroprusside toe te voegen aan de perfusiebuffer. Dit medicijn voorkomt de samentrekking van de vaten tijdens het monsterpreparaat en daardoor hun afzet van het omliggende weefsel, wat leidt tot onvolledige vasodilatatie. Natrium nitroprusside in de perfusiebuffer is niet zo belangrijk voor de voorbereiding van de longsectie die moet worden gebruikt voor analyse van kleine slagaders omdat ze sterk verankerd zijn aan de alveolaire septa.

Alle experimenten moeten worden gestart met incubaties waarbij de reactiviteit van de slagaders wordt getest. Zelden kregen we longpreparaten waarbij geen reactie van vaten op aannemers of dilatatoren detecteerbaar was. We weten de reden hiervoor niet: Het kan zijn dat het volume van de agarose gevuld in de longen te groot of te laag was, zodat het snijden van het orgaan in PCLS niet optimaal was. Als alternatief is het denkbaar dat de agarose te snel afkoelde tijdens de instillatieprocedure, wat resulteerde in schadelijke schuifspanning. In het geval dat in een individuele PCLS geen levensvatbare slagader kan worden gedetecteerd, moet de sectie worden weggegooid en vervangen door een andere.

De beslissing over de levensvatbaarheid van een slagader werd genomen op basis van de reactie op U46619. Toepassing van U46619 bij een concentratie van 0,1 μM induceert een vasoconstrictie die - na enige oefening - direct zichtbaar is in de beeldsequentie op het scherm. Omdat er enkele afwijkingen zijn in de vasoreactiviteit, onderzoeken we de impact van een medicijn op HPV door de vasorespons te meten in longsecties die op hun beurt aan het medicijn of aan het medium alleen zijn blootgesteld.

HPV van een individuele slagader is vaak nauwelijks detecteerbaar in de microscoop, en gemiddeld resulteert dit in een vermindering van het luminale gebied van ongeveer 20-30%. Kleine veranderingen in de diameter van een slagader hebben echter een duidelijke input voor de stromingsweerstand. Volgens de vergelijking "R = 1/r⁴" met R=weerstand en r=radius is de stroomweerstand omgekeerd evenredig met de vierde macht van de straal. Laat ik een voorbeeld geven: Een "ideale slagader" met een cirkelvormige doorsnede met een diameter van 40 μm (r=20 μm) heeft een lichtgevend gebied van ongeveer 1.260 μm². Wanneer het luminale gebied met 20% wordt verminderd, kunnen we berekenen dat de diameter van het vat met 10,5% wordt verminderd tot 35,8 μm (r = 17,9 μm). Volgens de bovenstaande vergelijking zou de stromingsweerstand van dit vat toenemen van 6,25 x 10^-6 tot 9,71 x 10^-6, dat is met ongeveer 55%. In het geval van een vermindering van het luminale gebied met 30% zou de straal met ongeveer 16% afnemen, maar de stroomweerstand zou met ongeveer 100% toenemen. Hoewel deze berekeningen een oversimplificatie zijn waarbij een laminaire bloedstroom en een bloedvatvorm van een stijve pijp worden verondersteld, is het suggestief voor de impact van reeds kleine veranderingen van de diameter op de stromingsweerstand.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Vibratome "Microm HM 650 V"	Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany
Microwave oven	Bosch, Frankfurt, Germany	HMT 702C
Heating cabinet	Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany
Flow-through superfusion chamber	Hugo Sachs Elektronik, March, Germany	PCLS-Bath Type: 847 SN:4017
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives	Leica, Wetzlar, Germany
CCD-camera	Stemmer Imaging, Puchheim, Germany
Peristaltic pump Minipuls 3	Gilson, Limburg-Offheim, Germany
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205”	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	9452450
Gas tight tubes Tygon R3603-13      Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in	VWR, Darmstadt, Germany
Various scissors and forceps
Sewing cotton
2 ml Syringe	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml Syringe	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm)	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany	4254112B	Voor het inbrengen van de agarose in de long
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm	Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany	4665643	Voor het bebellen van het medium
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm	Terumo, Eschborn, Germany	NN 2425 88DSF18	Voor longperfusie
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2)	Linde, Hildesheim, Germany
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2)	Linde, Hildesheim, Germany
HEPES	Sigma, Deisenhofen, Germany	H 4034
NaCl	Roth, Karlsruhe, Germany	3957.1
KCl	Merck, Darmstadt, Germany	1.04936.0500
MgCl2•6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1.05833.0250
CaCl2•2H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1.02382.0500
Glucose D-(+)	Sigma, Deisenhofen, Germany	G 7021
Low melting point agarose	Bio-Rad, Munich, Germany	161-3111
Heparin-sodium	Ratiopharm, Ulm, Germany	5120046
Phenolred-free minimal essential medium (MEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	5120046
70% EtOH voor desinfectie	Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany
Superlijm	UHU, Bühl/Baden, Germany of van een supermarkt
U46619 (een tromboxaan analoog)	Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany	538944
Natriumnitroprussiaat (Nipruss)	Schwarz Pharma, Monheim, Germany	5332804
Optimas 6.5 software	Stemmer, Puchheim, Germany
SPSS 19	AskNet, Karlsruhe, Germany