Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Deze technologie heeft laten zien potentieel in het aanpakken van eerder uitdagende toepassingen, met inbegrip van, levering aan primaire immune cellen, cellen herprogrammeren, koolstof nanobuis, en quantum dot levering. Deze vector vrij microfluidic platform gebaseerd op mechanische verbreking van de celmembraan cytosolische levering van het doelmateriaal te vergemakkelijken. Hierin beschrijven we de gedetailleerde methode voor het gebruik van deze microfluïdische apparaten, waaronder, inrichtingsamenstel, cel voorbereiding en werking van het systeem. Deze aflevering aanpak vereist een korte optimalisatie van het type apparaat en voorwaarden voor u onaangekondigd toepassingen. De verstrekte instructies zijn generaliseerbaar naar de meeste celtypes en levering materialen als dit systeem niet gespecialiseerde buffers of chemische modificatie / vervoeging stappen vereisen. Deze werkzaamheden bieden ooks aanbevelingen over hoe de prestaties van het apparaat te verbeteren en trouble-shoot mogelijke problemen in verband met verstopping, lage levering efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen.
Inleiding
Levering van macromoleculen aan het cytoplasma is een cruciale stap in therapeutische en wetenschappelijke toepassingen. Nanodeeltjes gemedieerde aflevering, bijvoorbeeld, is potentieel getoond gentherapie 1,2, terwijl eiwitlevering is een veelbelovende manier beïnvloeden celfunctie in zowel klinische en laboratorium 3 4 instellingen. Andere materialen, zoals kleine moleculen, quantum dots, of goud nanodeeltjes, van belang zijn in toepassingen variërend van kankertherapieën 5,6 intracellulaire etikettering 7,8 en single molecule volgen 9.
Het celmembraan is grotendeels ondoorlaatbaar ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Opslagruimte
- Bewaar de reservoirs, houders, O-ringen en microfluïdische apparaten in 70% ethanol. Gebruik een container (bijv. een potje of beker) die een deksel om verdamping en besmetting te voorkomen door stof of buiten deeltjes heeft. Plaats de apparaten in een houder (1), reservoirs en O-ringen in een tweede houder (2), en houders in de derde (3).
Opmerking: het gebruik van 70% ethanol gedurende opslag is om steriliteit te handhaven. Als de enige componenten van de oplossing zijn ethanol en water (dus geen denaturering agenten), moeten alle onderdelen van het systeem volledig compatibel en zal ni....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 betreft een beschrijvend schema van het microfluïdische afgiftesysteem. Figuren 2a-b tonen typische resultaten van behandeling HeLa cellen met verschillende ontwerpen inrichting aanwezigheid van fluorescent geconjugeerde 3 kDa dextran 20. Als de procedure correct wordt nageleefd, zal de systeemprestaties gevoelig voor het type apparaat en operationele snelheid. Daarom moet men deze te optimaliseren voor een bepaalde toepassing alvorens complexere experimenten. In het.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bepaalde aspecten van de beschreven experimentele procedure (dan chip ontwerp en werkingssnelheid factoren) moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het celtype en levering materiaal het systeem wordt toegepast. De discussie die adressen volgt een aantal van de meest voorkomende factoren te overwegen bij het ontwerpen van experimenten.
Om de levering signaal voor fluorescent gelabelde verbindingen te verbeteren, moet men bronnen van achtergrond fluorescentie te pakken. Oppervlak.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs Armon Sharei, Robert Langer, en Klavs F. Jensen zijn aandeelhouders van SQZ Biotechnologie Bedrijf dat de microfluïdische apparaten die worden gebruikt in dit artikel oplevert.
Dankbetuigingen
Wij danken T. Shatova voor nuttige discussie over experimenteel ontwerp en data analyse. De hulp en expertise van G. Paradis, worden de personeelsleden van de flowcytometrie kern bij de Koch Instituut, en het personeel van de Microsystems Technology Laboratory van het Massachusetts Institute of Technology dankbaar erkend. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, en gedeeltelijk door de National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Subsidies P30-CA14051 en MPP-09Call-Langer-60.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flowcytometriemachine gebruikt in de Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
Referenties
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
