Methodenartikel

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

DOI:

10.3791/50980

⸱

7 november 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Deze technologie heeft laten zien potentieel in het aanpakken van eerder uitdagende toepassingen, met inbegrip van, levering aan primaire immune cellen, cellen herprogrammeren, koolstof nanobuis, en quantum dot levering. Deze vector vrij microfluidic platform gebaseerd op mechanische verbreking van de celmembraan cytosolische levering van het doelmateriaal te vergemakkelijken. Hierin beschrijven we de gedetailleerde methode voor het gebruik van deze microfluïdische apparaten, waaronder, inrichtingsamenstel, cel voorbereiding en werking van het systeem. Deze aflevering aanpak vereist een korte optimalisatie van het type apparaat en voorwaarden voor u onaangekondigd toepassingen. De verstrekte instructies zijn generaliseerbaar naar de meeste celtypes en levering materialen als dit systeem niet gespecialiseerde buffers of chemische modificatie / vervoeging stappen vereisen. Deze werkzaamheden bieden ooks aanbevelingen over hoe de prestaties van het apparaat te verbeteren en trouble-shoot mogelijke problemen in verband met verstopping, lage levering efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levering van macromoleculen aan het cytoplasma is een cruciale stap in therapeutische en wetenschappelijke toepassingen. Nanodeeltjes gemedieerde aflevering, bijvoorbeeld, is potentieel getoond gentherapie 1,2, terwijl eiwitlevering is een veelbelovende manier beïnvloeden celfunctie in zowel klinische en laboratorium 3 4 instellingen. Andere materialen, zoals kleine moleculen, quantum dots, of goud nanodeeltjes, van belang zijn in toepassingen variërend van kankertherapieën 5,6 intracellulaire etikettering 7,8 en single molecule volgen 9.

Het celmembraan is grotendeels ondoorlaatbaar voor macromoleculen. Veel bestaande technieken gebruiken polymere nanodeeltjes 10,11, liposomen 12 of chemische modificaties 13 tot membraan verstoring of endocytotische levering te vergemakkelijken. In deze werkwijzen, de levering efficiëntie en cel levensvatbaarheid vaak afhankelijk zijn van de structuur van ee doel molecuul en het celtype. Deze methoden kunnen in werking treden bij de levering van structureel uniform materiaal, zoals nucleïnezuren, maar zijn vaak niet geschikt voor de levering van structureel diverse materialen, zoals eiwitten en 14,15 nanomaterialen 7. Bovendien is de endosoomdisruptie mechanisme dat de meeste van deze werkwijzen afhankelijk is vaak inefficiënt, dus waardoor veel materiaal opgesloten in vesikel structuren 16. Tot slot, methoden die vaak ontwikkeld voor gebruik met gevestigde cellijnen niet goed vertalen naar primaire cellen.

Membraan perforeren methoden, zoals elektroporatie 17,18 en sonoporatie 19, zijn een aantrekkelijk alternatief in sommige toepassingen, maar zijn ze bekend om lage levensvatbaarheid van de cellen veroorzaken en kan worden beperkt door de lading van de doelgroep levering materiaal.

Rapid mechanische vervorming van de cellen, een microfluïdische benadering van de levering, heeft onlangs demonstrated zijn voordelen ten opzichte stroom in de context van de cel herprogrammering 20 en nanomateriaal levering 21. Deze methode berust op mechanische verbreking o de celmembraan cytosolische levering van materialen aanwezig in de omringende buffer vergemakkelijken. Het systeem heeft aangetoond waardoor potentieel in eerder uitdagende celtypen (bijv. primaire immune cellen en stamcellen) en materialen (bijvoorbeeld antilichamen en koolstof nanotubes). Hierin wordt de algemene procedure voor deze apparaten voor intracellulaire afgifte van target macromoleculen beschreven. De procedure is generaliseerbaar voor de meeste celtypes en levering materialen, maar het wordt aanbevolen dat men voeren een kort optimalisatie van de voorwaarden, zoals omschreven in onze eerder gemelde ontwerprichtlijnen 20, voor alle eerder aangegeven toepassingen. Tot op heden is het systeem met succes gebruikt voor de levering van RNA, DNA, goud nanodeeltjes, quantum dots, koolstof nanobuisjes, eiwits en dextran polymeren 20,21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Opslagruimte

  1. Bewaar de reservoirs, houders, O-ringen en microfluïdische apparaten in 70% ethanol. Gebruik een container (bijv. een potje of beker) die een deksel om verdamping en besmetting te voorkomen door stof of buiten deeltjes heeft. Plaats de apparaten in een houder (1), reservoirs en O-ringen in een tweede houder (2), en houders in de derde (3).

Opmerking: het gebruik van 70% ethanol gedurende opslag is om steriliteit te handhaven. Als de enige componenten van de oplossing zijn ethanol en water (dus geen denaturering agenten), moeten alle onderdelen van het systeem volledig compatibel en zal niet na verloop van tijd.

  1. Wijzig ethanol-oplossing in containers (2) en (3) voor elk gebruik om kruisbesmetting over experimenten te voorkomen en de aanwezigheid van ongewenste deeltjes die verstopping kunnen veroorzaken minimaliseren.

2. Experiment Voorbereiding

  1. Plaats containers (2) en (3) in een ultrasoon bad for 5-10 min voor elk gebruik. Dit helpt verwijder alle vervuilende deeltjes uit eerdere experimenten.
  2. Schone werkplek in bioveiligheid kast met 70% ethanol-oplossing.
  3. Spuit alle materialen (3 containers, en pincet) met een 70% ethanol-oplossing alvorens ze in de bioveiligheid kast.

3. Montage

  1. Vastgelegd 2-3 pluisarme doekjes in het werkgebied.
  2. Verwijder de plastic reservoirs uit hun container met een pincet en leg ze op de doekjes om verdamping van ethanol-oplossing van inwendige oppervlakken te vergemakkelijken. Tik voorzichtig de reservoirs op het oppervlak of blaas lucht door hen om de verwijdering van de ethanol-oplossing te vergemakkelijken.
  3. Plaats de O-ringen in hun juiste sleuf van de reservoirs.
  4. Verwijder de houder en chips van respectievelijke houders en laat ethanol verdampen (~ 1-2 min).
  5. Gebruik een pincet om de gewenste chip face-up (dwz toegang gaten up) in de houder te plaatsen. Til de houdermet de chip naar ooghoogte te zorgen dat de chip wordt plat in de houder en corrigeer zo nodig met de pincet. BELANGRIJK: Als het apparaat niet goed past in de houder, is er een risico dat het tijdens de volgende stappen zal breken.
  6. Vervolgens, plaats voorzichtig de reservoirs op de houder en lijn ze met de clips. Zorg ervoor dat de O-ringen niet uit hun sleuven vallen tijdens dit proces.
  7. Druk licht op de reservoirs tot ze op hun plaats. Zorg ervoor dat beide zijden van de reservoirs veilig zijn en dat de chip lijkt in de juiste positie.

4. Celpreparaat

  1. Voor hechtende cellen (primaire of gevestigde lijnen): Plaat cellen 1-2 dagen voorafgaand aan het experiment zodanig dat zij niet meer dan 80% samenvloeiing op de dag van het experiment.
  2. Plaats cellen in suspensie (in PBS of relevante media) en streven naar een operationele concentratie van 1,0 x 10 6 cellen / ml tot 1,0 x 10 7 cells / ml. LET OP: Wij hebben geen significante veranderingen in de levering prestaties waargenomen als gevolg van cel concentratie.
  3. Meng cellen en de gewenste levering materiaal in een aparte buis naar de gewenste materiaal concentratie te verkrijgen voor het experiment. BELANGRIJK: Omdat de beschreven levering methode is gebaseerd op de diffusie om de levering te vergemakkelijken, zal een hogere materiaal concentratie hoger levering opleveren. Indien mogelijk, is het raadzaam om een ​​1 uM oplossing van het gewenste materiaal voor eerste proeven gebruikt. Deze concentratie kan dan in de toekomst experimenten worden getitreerd zoals nodig. De laagst gerapporteerde concentratie gebruikt met dit apparaat is 10 nM 21.

5. Operatie

  1. Pipet mengsel van cellen en levering materiaal in een reservoir (huidige ontwerp heeft een maximale capaciteit van 150 pi). OPMERKING: Bij apparaat ontwerpen zijn volledig omkeerbaar dus stromingsrichting door de kanalen doet er niet toe. Monsters kunnen in een van de twee reservoirs geladen.
  2. Bevestig druk slang aan de gevulde reservoir en draai de moer om een ​​goede afdichting (handvast is vaak voldoende) te waarborgen.
  3. Stel druk om het gewenste niveau van de regelaar. Dit bepaalt de snelheid waarmee cellen reizen door de inrichting. Merk op dat de mobiele stroom niet starten totdat de knop wordt ingedrukt.

OPMERKING: In eerdere werk, zijn stikstof of perslucht even goed werkte als het dragergas.

  1. Til het apparaat op ooghoogte en oriënteren het zo dat de vloeistof in het reservoir is goed zichtbaar. OPMERKING: Volg de vloeistof kolom af te sluiten van het systeem voordat het reservoir leeg is.
  2. Druk op de knop om het reservoir onder druk en beginnen cel flow.
  3. Wanneer het vloeistofniveau ongeveer 2 mm van de bodem van het reservoir snel het verdraaien naar 0 psi tot flowstop. Belangrijk Als een faalt om de stroom te stoppen voordat het reservoir geleegd, een risico uitwerpen het monster uit de collection reservoir. Merk ook op dat als de vloeistofkolom stilstaat op een aanzienlijke tempo of aanzienlijk vertraagd ten opzichte om haar initiële stroomsnelheid (bijvoorbeeld 3x langzamer), de gemonteerde apparaat waarschijnlijk verstopt en moet worden uitgewisseld. Het bedienen van een verstopte apparaat kan leiden tot hogere celdood.
  4. Verzamel de behandelde cellen uit de betreffende reservoir en plaats ze in de gewenste verzamelbuis / plaat. BELANGRIJK: de verzamelde cellen in elke buffers niet verwateren in dit stadium als de nomen cellen zal blijven materiaal opname voor maximaal 10 min. 20. Nadat het venster is verstreken Verdun de cellen in het gewenste medium / buffer.
  5. Om meer behandelde cellen te verzamelen of probeer alternatieve experimentele omstandigheden, herhaalt u de stappen 5,1-5,7 als nodig is. Bedenk dat de chips zijn omkeerbaar, kan dus monsters in beide reservoir worden gemonteerd. Zorg ervoor dat chips wisselen zo nodig als ze verstoppen. Gooi verstopt apparaten.

6. Demontage

  1. Ontkoppel voorzichtig de reservoirs van de belangrijkste houder door duwden de clip armen.
  2. Plaats elk deel in de daarvoor bestemde opslagcontainer (in paragraaf 1).
  3. Plaats gebruikt chips in een aparte container voor verwijdering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 betreft een beschrijvend schema van het microfluïdische afgiftesysteem. Figuren 2a-b tonen typische resultaten van behandeling HeLa cellen met verschillende ontwerpen inrichting aanwezigheid van fluorescent geconjugeerde 3 kDa dextran 20. Als de procedure correct wordt nageleefd, zal de systeemprestaties gevoelig voor het type apparaat en operationele snelheid. Daarom moet men deze te optimaliseren voor een bepaalde toepassing alvorens complexere experimenten. In het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bepaalde aspecten van de beschreven experimentele procedure (dan chip ontwerp en werkingssnelheid factoren) moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het celtype en levering materiaal het systeem wordt toegepast. De discussie die adressen volgt een aantal van de meest voorkomende factoren te overwegen bij het ontwerpen van experimenten.

Om de levering signaal voor fluorescent gelabelde verbindingen te verbeteren, moet men bronnen van achtergrond fluorescentie te pakken. Oppervlak...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs Armon Sharei, Robert Langer, en Klavs F. Jensen zijn aandeelhouders van SQZ Biotechnologie Bedrijf dat de microfluïdische apparaten die worden gebruikt in dit artikel oplevert.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken T. Shatova voor nuttige discussie over experimenteel ontwerp en data analyse. De hulp en expertise van G. Paradis, worden de personeelsleden van de flowcytometrie kern bij de Koch Instituut, en het personeel van de Microsystems Technology Laboratory van het Massachusetts Institute of Technology dankbaar erkend. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, en gedeeltelijk door de National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Subsidies P30-CA14051 en MPP-09Call-Langer-60.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Device Holder & Plastic reservoirSQZ BiotechnologiesHolder
LSRFortessa AnalyzerBecton DickinsonN/AFlowcytometriemachine gebruikt in de Koch Institute Core Facilities
Microfluidic deviceSQZ BiotechnologiesCell Squeeze
O-RingsMcMaster9452K311
Pressure system to operate deviceSQZ BiotechnologiesPressure System
Tweezers
Ultrasound bath

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cell SqueezingMicrofluidic DeliveryIntracellular DeliveryVector Free DeliveryMechanical DisruptionFlow CytometryDevice AssemblyCell PreparationPressure OptimizationClogging Prevention

Gerelateerde artikelen