Intra-lymfeklierinjectie van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes

Samenvatting

Lymfeklieren zijn de immunologische weefsels die de immuunrespons orkestreren en een cruciaal doelwit zijn voor vaccins. Biomaterialen zijn gebruikt om lymfeklieren beter te richten en de levering van antigenen of hulpstoffen te controleren. Dit artikel beschrijft een techniek die deze ideeën combineert om biocompatibele polymeerdeeltjes in lymfeklieren te injecteren.

Samenvatting

Het genereren van adaptieve immuunrespons is afhankelijk van efficiënte drainage of handel in antigeen naar lymfeklieren voor de verwerking en presentatie van deze vreemde moleculen naar T- en B-lymfocyten. Lymfeklieren zijn dus kritische doelwitten geworden voor nieuwe vaccins en immunotherapieën. Een recente strategie voor het richten van deze weefsels is directe lymfeklierinjectie van oplosbare vaccincomponenten, en klinische proeven met deze techniek zijn veelbelovend. Verschillende biomaterialenstrategieën zijn ook onderzocht om de lymfekliertargeting te verbeteren, bijvoorbeeld het afstemmen van deeltjesgrootte voor optimale drainage van biomateriaalvaccindeeltjes. In dit artikel presenteren we een nieuwe methode die directe lymfeklierinjectie combineert met biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes die kunnen worden beladen met antigeen, adjuvans of andere vaccincomponenten. In deze methode worden polymere microdeeltjes of nanodeeltjes gesynthetiseerd door een gemodificeerd dubbel emulsieprotocol met lipidenstabilisatoren. Deeltjeseigenschappen(bijv. grootte, ladinglading) worden bevestigd door respectievelijk laserdiffractie en fluorescerende microscopie. Muislymfeklieren worden vervolgens geïdentificeerd door perifere injectie van een niet-toxische tracerkleurstof die visualisatie van de doelinjectieplaats en daaropvolgende afzetting van polymeerdeeltjes in lymfeklieren mogelijk maakt. Deze techniek maakt directe controle mogelijk over de doses en combinaties van biomaterialen en vaccincomponenten die aan lymfeklieren worden geleverd en kan worden gebruikt bij de ontwikkeling van nieuwe vaccins op basis van biomaterialen.

Inleiding

De lymfeklieren (LN's) zijn de commandocentra van het immuunsysteem. Op deze immunologische site presenteert antigeen cellen prime naïeve lymfocyten tegen specifieke vreemde antigenen om cellulaire en humorale immuunresponsen te activeren. LN's zijn daarmee een aantrekkelijk doelwit geworden voor de levering van vaccins en immunotherapieën. Helaas resulteren de meeste vaccinstrategieën in inefficiënte, voorbijgaande toediening van antigeen en hulpstoffen aan het lymfoïde weefsel¹. Benaderingen die de targeting en het behoud van vaccincomponenten in LAN's verbeteren, kunnen daarom een aanzienlijke impact hebben op de potentie en efficiëntie van nieuwe vaccins.

Een strategie om de uitdaging van LN-targeting te omzeilen die grote belangstelling heeft getoond voor nieuwe klinische proeven is directe , intra-LN (i.LN.) injectie^2-4. Deze onderzoeken maakten gebruik van ultrasone begeleiding om vaccins aan LN's te leveren als een eenvoudige poliklinische procedure. In vergelijking met traditionele perifere injectieroutes resulteerde deze aanpak in aanzienlijke dosissparende en verbeterde werkzaamheid in therapeutische contexten, waaronder allergieën en kanker^2-4. Deze studies maakten gebruik van i.LN. injectie van oplosbare vaccins(d.w.z. biomateriaalvrij) die snel werden gewist door lymfedrainage. Daarom werden meerdere injecties- of cycli van meerdere injecties - toegediend om deze indrukwekkende therapeutische effecten te bereiken. Verbeterde retentie in de LN kan de interactie tussen antigeen en/of adjuvans en immuuncellen verbeteren, waardoor de potentie van immuuncelpriming verder wordt verbeterd. Dit potentieel wordt ondersteund door recente studies die aantonen dat kinetiek van antigeen en adjuvante toediening een cruciale rol spelen bij het bepalen van de specifieke immuunrespons gegenereerd^5-7. Verder kan het lokaliseren en minimaliseren van medicijn- en vaccindoses systemische effecten, zoals chronische ontstekingen, verminderen of elimineren.

Biomaterialen zijn uitgebreid bestudeerd om de potentie en efficiëntie van vaccins te verbeteren^1,8,9. Inkapseling of adsorptie op biomateriaaldragers kan lading fysiek beschermen tegen afbraak en oplosbaarheidsbeperkingen overwinnen. Een ander opmerkelijk kenmerk van biomaterialendragers, zoals polymere micro- of nanodeeltjes, is de mogelijkheid om verschillende klassen lading te coloaden en vervolgens deze ladingen over gecontroleerde intervallen vrij te geven. Een significante beperking die biomateriaalvaccins en immunotherapieën in vivo blijft belemmeren, is echter inefficiënte targeting van immuuncellen en beperkte handel naar lymfeklieren. Perifere injectie van biomateriaalvaccins via conventionele routes(bijv. intradermaal, intramusculair) vertoont bijvoorbeeld meestal een slechte LN-targeting, waarbij tot 99% van het geïnjecteerde materiaal op de injectieplaats overblijft^4,10. Meer recentelijk is de omvang van de dragers van biomaterialenvaccins afgestemd op het verbeteren van de preferentiële handel of drainage van deze vaccins naar LN's via interstitiële stroom^8,10. Deze vooruitgang heeft geleid tot verbeterde cellulaire en humoristische immuunresponsen, wat het belang onderstreept van het richten en ontwerpen van de LN-omgeving voor nieuwe vaccins.

Dit artikel presenteert een vaccinatieprotocol dat lipide-gestabiliseerde polymeerdeeltjes en i.LN. levering combineert om vaccindepots met gereguleerde afgifte te genereren^5,11. Voortbouwend op recente studies met chirurgische technieken voor i.LN. bij muizen^6,7,12,13ontwikkelden we een snelle, niet-chirurgische strategie voor het injecteren van biomateriaalvaccins bij kleine dieren⁵. Combinatie van i.LN. toediening met biomateriaal vaccindragers krachtig verbeterde CD8 T celrespons binnen 7 dagen na een enkele injectie van gecontroleerde afgifte vaccin depots⁵. Er werd ook een sterke humoristische respons(d.w.z. antilichaamtiters) gegenereerd; beide verbeteringen werden gekoppeld aan een verhoogde retentie van vaccincomponenten in lymfeklieren die werd gemedieerd door gecontroleerde afgifte van de biomateriaaldragers. Interessant is dat de grootte van vaccindeeltjes het lot van deze materialen ooit in de LAN's veranderde: nanoschaaldeeltjes vertoonden verhoogde directe opname door cellen, terwijl grotere microdeeltjes in de extracellulaire LN-omgeving bleven en lading vrijkwamen(bijv. adjuvans) die werd opgenomen door LN-ingezeten antigeen dat cellen^{presenteerde 5}. Deze gegevens suggereren twee trajecten die kunnen worden benut voor nieuwe vaccins door de grootte van de geïnjecteerde biomaterialen i.LN te controleren.

In dit artikel worden biologisch afbreekbare lipide-gestabiliseerde polymeerdeeltjes (micro- en nanoschaal) gesynthetiseerd met behulp van een gemodificeerde dubbele emulsiestrategie^5,11. Deeltjeseigenschappen worden gekenmerkt door laserdiffractie en microscopie. Deze deeltjes worden vervolgens rechtstreeks in de inguinale LN's geïnjecteerd die niet-assurgisch zijn geïdentificeerd met behulp van een gemeenschappelijke, niet-toxische tracerkleurstof¹⁴. Post-injectie analyse van LN's door histologie of flow cytometrie kan worden gebruikt om de verdeling van deeltjes binnen de LN-omgeving te verifiëren, evenals om de cellulaire opname en retentie van deeltjes in de loop van de tijd te controleren. Voor protocollen met histologische verwerking en flowcytometrie worden lezers verwezen naar recente JoVE-artikelen en tijdschriftrapporten^15-22. Typische resultaten tonen lokale LN-targeting van deze depots aan die kunnen worden misbruikt om krachtige, efficiënte immuunresponsen te bereiken of om immuniteit op maat te maken voor doelpathogenen.

Protocol

Alle dierstudies in dit protocol werden voltooid in overeenstemming met federale, staats- en lokale richtlijnen en met behulp van protocollen die werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Maryland.

1. Synthese van lipide gestabiliseerde micro- en nanodeeltjes

1. Combineer dopc-, DSPE-PEG- en DOTAP-lipiden in een ml glazen flacon(en) in een molaire verhouding van 60:20:20 om een master lipidenmix te bereiden.
   1. Om een enkel monster te synthetiseren: Breng respectievelijk 242,9 μl, 287,4 μl en 71,9 μl DOPC, DSPE-PEG en DOTAP over in de flacon met behulp van 2 ml glazen serologische pipetten.
   2. Om meerdere monsters te synthetiseren: Vermenigvuldig elk lipidenvolume hierboven met het aantal monsters en combineer in een enkele flacon en breng vervolgens gelijke aliquots van dit lipidenmengsel over in flacons die overeenkomen met elk te bereiden monster.
   3. Droog lipiden gedurende 10 minuten onder een zachte stroom stikstofgas of plaats ze 's nachts in een vacuümoven.
2. Los in een enkele, lege glazen flacon van 20 ml 80 mg PLGA op in 5 ml dichloormethaan voor elk deeltjesmonster om een polymeervoorraadoplossing van 16 mg/ml te genereren.
3. Voeg 5 ml polymeeroplossing toe aan de flacon(s) met de gedroogde lipiden, dop en vortex gedurende 30 sec.
4. Om microdeeltjes te synthetiseren:
   1. Begin met het soniceren van de organische fase die het polymeer, lipide en andere wateroplosbare lading op ijs met behulp van een sonicator bevat.
   2. Maak de water-in-olie (m/o) emulsie door een pipet te gebruiken om 500 μl gedestilleerde H₂O toe te voegen, of H₂O met 1 mg peptide, eiwit of andere in water oplosbare lading.
   3. Blijf 30 sec soniceren bij 12 W op ijs, schommel de flacon zachtjes op en neer en zij aan zij rond de sonicatortip om volledige emulgering te garanderen.
   4. Maak de water-in-olie-in-water (w/o/w) emulsie door de w/o emulsie in 40 ml H₂O in een bekerglas van 150 ml te gieten.
   5. Homogeniseer gedurende 3 minuten bij 16.000 tpm met behulp van een digitale homogenisator.
   6. Voeg een magnetische roerstaaf toe, breng het bekerglas over op een roerplaat en laat de w/o/w emulsie een nacht roeren om het overtollige oplosmiddel te verwijderen.
5. Nanodeeltjes synthetiseren:
   1. Begin met het soniceren van de organische fase die de polymeer-, lipide- en andere wateroplosbare lading op ijs met 14 W bevat.
   2. Maak de w/o-emulsie door een pipet te gebruiken om 500 μl gedestilleerde H₂O toe te voegen, of H₂O met 1 mg peptide, eiwit of andere in water oplosbare lading.
   3. Blijf soniceren gedurende 30 sec bij 14 W op ijs.
   4. Maak de w/o/w emulsie door de w/o emulsie in een bekerglas van 150 ml op 40 ml H₂O te gieten en gedurende 5 min bij 16 W op ijs te soniceren. Schommel de flacon voorzichtig op en neer en van links naar rechts rond de sonicatortip om volledige emulgering te garanderen.
   5. Voeg een magneetroerstaaf toe, breng de kolf over op een roerplaat en laat de w/o/w emulsie een nacht roeren om het overtollige oplosmiddel te verwijderen.
6. Was en verzamel de volgende ochtend deeltjes:
   1. Giet emulsie door 40 μm Nylon mesh celzeef in een conische buis van 50 ml.
   2. Centrifugeer deeltjes gedurende 5 min bij 5.000 x g voor microdeeltjes of 5 min bij 24.000 x g voor nanodeeltjes.
   3. Decanteer supernatant en was deeltjes door resuspending in 1 ml H₂O.
   4. Breng gesuspendeerde deeltjes over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   5. Centrifugeer gedurende 5 min bij 5.000 x g voor microdeeltjes of 5 min bij 24.500 x g voor nanodeeltjes.
   6. Was de deeltjes nog twee keer door supernatant te verwijderen, te resuspenden in 1 ml H₂O en te centrifugeren zoals in stap 1.6.5. Schors na het wassen deeltjes in 1 ml H₂O voor onmiddellijk gebruik of lyofiel voor uitgebreide opslag.

2. Meting van de syntheseopbrengst

1. Preweigh een lege 20 ml glazen flacon. Voeg 100 μl deeltjessuspensie toe aan de voorgewege flacon na pipetten op en neer met een micropipet om te mengen.
2. Lyophiliseer de deeltjes of droog onder een zachte stroom stikstof.
3. Weeg de flacon met het gedroogde polymeer af. Bepaal de deeltjesopbrengst in de flacon door het oorspronkelijke gewicht van de flacon af te trekken van de massa van de flacon die de gedroogde deeltjes bevat.
4. Bepaal de totale deeltjesopbrengst door de deeltjesmassa in de flacon te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor. Om de procentuele opbrengst te bepalen, deelt u de deeltjesmassa door de maximale theoretische ingangsmassa en vermenigvuldigt u zich met 100%.

3. Bepaling van deeltjesgrootte

1. Reinig de meegeleverde cuvette-achtige glasfractiecel door te vullen met gedeioneerd water en af te vegen met wattenstaafje. Breng 10 ml gedestilleerde H₂O over naar de gereinigde factiecel, voeg magnetische microroerstaaf toe en laad de fractiecel in de celhouder van de deeltjesgrootteanalysator.
2. Pas de magnetische roersnelheid in de deeltjesanalysator aan om een volledige menging in de fractiecel te bereiken en sluit de deur van het compartiment.
3. Lijn de lasers uit op de breukcel met behulp van de instrumentsoftware-interface.
4. Gebruik de instrumentsoftware-interface om een basislijnmeting op te nemen met de breukcel die alleen gedestilleerde H₂O bevat.
5. Pipetteer de originele deeltjessuspensie op en neer met een micropipet om te mengen.
6. Pipet 10 μl deeltjessuspensie (meestal ongeveer 0,5 mg) in de fractiecel. Zorg ervoor dat het volume van het deeltjesmonster dat aan de cel wordt toegevoegd voldoende is om signaalsterkte te genereren in het juiste bereik zoals aangegeven op de software-interface van het instrument. De werkelijke massa van de deeltjes die nodig zijn, is afhankelijk van de procentuele opbrengst en de optische eigenschappen van het deeltjesmonster.
7. Sluit de deur van het deeltjesgrootteanalysatorcompartiment en meet de deeltjesgrootte met behulp van een brekingsindex van 1,60 voor PLGA.
8. Gebruik de software-interface om de deeltjesdiameter te berekenen met behulp van een getalbasis.

4. Visualisatie van deeltjes

1. Pipetdeeltjessuspensie op en neer met micropipet om te mengen. Verdun deeltjessuspensie tot 1 mg/ml in gedeioneerd water.
2. Bereid een microscoopschuif voor door 3 μl verdunde deeltjesophanging toe te voegen en een afdeklip onder een hoek van 45° te monteren om bellenvorming te voorkomen. Plaats de dia op het microscoopstadium en het beeld met behulp van de juiste filtersets voor elke fluorescerende lading.

5. Voorbereiding van muizen voor i.LN. injectie

1. Bereid tracerkleurstofoplossing voor:
   1. Bereid een 0,1% (m/v) oplossing van tracerkleurstof door 10 mg kleurstofpoeder op te lossen met 10 ml gedestilleerde H2O.
   2. Steriliseer de kleurstofoplossing in een glazen flacon met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm.
2. Verdoof de muis een dag voor de injectie met isofluraan volgens een door de IACUC goedgekeurd dierprotocol. Om de diepte van de anesthesie te evalueren, voert u een teenknijpreflextest uit en controleert u de ademhalingsfrequentie om een ademhalingsfrequentie van ongeveer 100-140 ademhalingen per minuut te garanderen.
3. Scheer haar aan de basis van staart en achterhand met behulp van tondeuses terwijl de muis wordt verdoofd. Verwijder haar van de ventrale kant van het dier en lateraal rond de rugzijde net boven het gewricht van het achterbeen (heup).
4. Injecteer tracer kleurstof.
   1. Gebruik voor elke kleurstofinjectie een micropipet om 10 μl kleurstofoplossing in een microcentrifugebuis over te brengen en aspireer de volledige 10 μl in een 31G-naald die aan een spuit van 1 ml is bevestigd.
   2. Injecteer 10 μl kleurstofoplossing subcutaan aan elke kant van de staartbasis waar het haar werd geknipt en herlaad tussen de injecties door.
5. Verwijder het resterende haar door een milde ontharingscrème aan te brengen via wattenstaafjes. Zorg ervoor dat u het gebied tussen de achterdij en de buik bedekt.
6. Laat ontharingscrème 3 minuten op de huid incuberen. Na incubatie, natte gehandschoende hand met warme H₂O en wrijf voorzichtig ontharingscrème in de huid.
7. Verwijder onmiddellijk ontharingscrème door de gehandschoende hand nat te maken met warme H₂O en de staartbasis en de achterhand te wrijven. Herhaal dit totdat het overtollige ontharingsgerei is verwijderd en zorg ervoor dat u de hand nat houdt om irritatie te voorkomen.
8. Verwijder het resterende ontharingsvocht van de muis door een zachte doek of keukenpapier met warme H₂O nat te maken en in één beweging een onderste deel van de muis af te vegen. Vermijd een wrijvende beweging om slijtage of huidbeschadiging aan de muis te voorkomen.
9. Laat de muis zich herstellen onder een warmtelamp en weer vasthouden.

6. i.LN. Injectie van deeltjes

1. Verdoof de muis de volgende dag met isofluraan volgens een door de IACUC goedgekeurd dierprotocol.
2. Onderzoek de muis om de drainage van tracerkleurstof in elke liesklier te bevestigen. De lymfeklier moet zichtbaar zijn als een donkere vlek in de buurt van de achterdij en buik.
3. Bereid deeltjesinjectieoplossing voor:
   1. Resuspend deeltjes in gedestilleerde H₂O bij gewenste injectieconcentratie. Gebruik voor elke injectie een micropipet om 10 μl deeltjesoplossing in een microcentrifugebuis over te brengen.
   2. Aspireer de volledige 10 μl in een 31G insulinenaald bevestigd aan een spuit van 1 ml.
4. Injecteer deeltjesdosis:
   1. Nadat u LN hebt gevisualiseerd, trekt u de huid rond LN aan met duim, wijsvinger en middelvinger om de huid te bespotten en een gecontroleerde plaatsing van het injectievolume mogelijk te maken.
   2. Benader de LN met de naald onder een hoek van 90° ten opzichte van de huid en penetreer de huid over de geverfde LN tot een diepte van 1 mm.
   3. Injecteer langzaam het hele volume. Observeer tijdens de injectie het LN-volume door de huid om de injectie te bevestigen door zichtbare LN-vergroting.
5. Laat de muis zich herstellen onder een warmtelamp en keer terug naar het vasthouden of uitvoeren van aanvullende tests.

Voor relevante analysetechnieken (bijv. histologie, flowcytometrie ) zie JoVE-artikelen 265, 1743 en 3054 en Current Protocols in Immunology, hoofdstukken 5 en 21^15-22.

Resultaten

De verwachte resultaten voor de protocollen in dit manuscript kunnen worden onderverdeeld in drie categorieën: deeltjessynthese, dierlijke voorbereiding en deeltjesinjectie.

Figuur 1 toont de synthese en karakterisering van biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes, gestabiliseerd door amfifiele lipiden. De resultaten van het emulsie/oplosmiddelverdampingssyntheseprotocol (figuur 1A) kunnen kwalitatief worden beoordeeld door visuele inspectie van de uiteindelijke emulsies die worden gegenereerd; deeltjesbatches moeten homogene, stabiele emulsies zijn met een ondoorzichtig uiterlijk. Complicaties omvatten emulsies die crème of flocculate, vaak als gevolg van onjuiste opslag van lipidenstabilisatoren. Om deze instabiliteit te voorkomen, moeten lipiden bij -80 °C worden bewaard in een gedehydrateerde toestand of in een verzegelde flacon gezuiverd met stikstof. Kwantitatieve beoordeling van deeltjessynthese kan worden uitgevoerd met behulp van laserdiffractie of dynamische lichtverstrooiing om de grootteverdeling te analyseren (Figuur 1B). De verwachte resultaten omvatten strak verdeelde, monomodale deeltjesgrootten, wat wijst op een uniforme populatie deeltjes. De in dit manuscript beschreven syntheseparameters genereren een gemiddeld aantal distributies gecentreerd op ongeveer 100 nm of 3 μm voor respectievelijk nanodeeltjes en microdeeltjes. Verdere kwalitatieve beoordeling van deeltjessynthese kan worden bereikt door wijziging van het bovenstaande protocol om meerdere klassen fluorescerende lading op te nemen. In figuur 1Cbevestigen microscopiebeelden van microdeeltjes geladen met een fluorescerend peptide (FITC, groen), een lipofiele kleurstof (DiD, rood) en een overlayafbeelding (geel) de creatie van deeltjes binnen het gewenste groottebereik en inkapseling van peptide in het volume van het deeltje.

De eerste twee panelen van figuur 2 vatten de verwachte resultaten van de dierlijke voorbereiding voor de i.LN.-injectiestrategie samen die in dit document worden beschreven. De methode omvat het markeren van inguinale LN 's door perifere injectie van een niet-toxische tracer om de locatie te bepalen voor daaropvolgende i.LN.-injectie van deeltjes (Figuur 2A)⁵. Zoals opgemerkt, zal drainage van de tracerkleurstof na subcutane injectie aan de staartbasis visualisatie van de inguinale LN's mogelijk maken (Figuur 2B)⁵. Inname van goedgekeurde ontharingscrèmes kan gevaren opleveren voor de muizen. Er moet dus voor worden gezorgd dat alle aangebrachte crème grondig wordt verwijderd, met bijzondere aandacht voor poten en de ventrale kant van de muizen. Het ontharen moet worden verwijderd met een natte, zachte doek of natte papieren handdoek in een enkele, vloeiende beweging. Vermijd wrijven om crème te verwijderen, omdat dit kan leiden tot schaafwonden op de blootgestelde huid van de muizen.

Bevestiging van lokale levering aan het inguinale LN kan worden geëvalueerd door observatie of histologie. Het LN-volume kan tijdens de injectie visueel worden gecontroleerd als indicator voor een succesvolle injectie. Verwachte resultaten omvatten een efficiënte ladingverdeling door de LN-structuur, zonder significante lekkage naar aangrenzende weefsels of cellen. Verder, aangezien geïnjecteerde vloeistof de tracer in de LN verplaatst/verdunt, moet de kleurstofconcentratie/kleurstof na injectie minder intens worden. Observatie van het weefsel moet een intacte, maar vergrote LN onthullen als gevolg van vloeistofinjectie. Mogelijke uitdagingen zijn het te snel injecteren of het missen van het LN, die beide elutie van het volume in het omliggende onderhuidse weefsel kunnen veroorzaken. Deze ongewenste uitkomsten kunnen worden bevestigd door obductie of histologie, waarbij de deeltjessuspensie wordt waargenomen die zich verspreidt naar cellen en weefsel op afstand van knooppunten die zijn gericht op injectie. Een verwacht resultaat zou daarentegen de identificatie van een vergrote inguinale LN zijn als gevolg van insluiting van deeltjes in de LN-structuur. Histologische verwerking van accijns-LAN's kan de levering van lading aan het lymfoïde weefsel definitief bevestigen, zoals blijkt uit de figuren 2C en 2D. Merk op dat de deeltjes in figuur 2 fluorescerende lading bevatten om visualisatie van lading mogelijk te maken tijdens injectie, evenals tijdens histologische verwerking en fluorescerende microscopie.

Figuur 1. Synthese en karakterisering van lipide gestabiliseerde deeltjes. A) Schematisch schema dat de synthese beschrijft van lipide-gestabiliseerde deeltjes bereid door emulsie/oplosmiddelverdamping. B) Grootteverdelingen van microdeeltjes (vaste lijn, diameter = 2,8 μm) en nanodeeltjes (onderbroken lijn, diameter = 113 nm). C) Fluorescerende microscopiebeelden van deeltjes geladen met fluorescerend gelabeld peptide en een fluorescerende deeltjeskleurstof. Labels: peptide (groen) en deeltje (rood). Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2. i.LN. Injectie en distributie van biologisch afbreekbare deeltjes binnen LN. A) Methodologie voor i.LN. injectie. B) Visualisatie van LAN's in een muis door de huid (bovenste afbeelding) en na obductie (onderste afbeelding)^5. C) Histologische kleuring van een LN ter bevestiging van depositie en distributie van fluorescerend gelabelde polymeermicrodeeltjes (deeltjes, groen; T-cellen, rood; B-cellen, blauw). D) Fluorescerend gelabelde nanodeeltjes (50 nm, linkerafbeelding) en microdeeltjes (6 μm, rechterafbeelding) in LN's 24 uur na injectie. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken. 

Discussie

De in dit protocol beschreven techniek maakt gecontroleerde toediening van vaccins aan LAN's en aan in LN-ingezeten antigeen presenterende cellen mogelijk. Biomateriaal ingekapselde lading kan worden gelokaliseerd binnen de LN, waardoor manipulatie van de doses van een of meer soorten lading geleverd aan de LN micro-omgeving. Het is aangetoond dat de lokalisatie en gecontroleerde afgifte van polymeerdeeltjes een krachtige cellulaire en humorale immuunrespons genereert bij aanzienlijk lagere doses dan conventionele benaderingen. Verder kan door de manipulatie van de grootte van de biomaterialendrager de primaire modus van cellulaire verwerking worden gemoduleerd tussen directe opname van nanodeeltjes of extracellulaire ladingafgifte uit grotere microdeeltjes⁵. Deze resultaten bepalen de haalbaarheid van i.LN. biomateriaallevering als platform voor therapeutische vaccinafgifte.

De synthese van PLGA-deeltjes door emulsie/oplosmiddelverdamping is op grote schaal toegepast in toepassingen voor de levering van geneesmiddelen^23,24. Potentiële uitdagingen in verband met deze techniek hebben dus vooral betrekking op succesvolle identificatie en depositie van vaccins op de LN-doellocatie. Hoewel het gebruik van tracerkleurstof de visualisatie van de beoogde inguinale LAN's vergemakkelijkt, zijn de doelgrootte en diepte onder de huid klein. Daarom raden de auteurs aan om tijd en muizen toe te wijzen voor het oefenen van de voorbereiding en injecties van muizen. Tijdens de voorbereiding van het dier(d.w.z. scheren en aanbrengen van ontharing) moet ervoor worden gezorgd dat de muizen aan de ventrale kant van het dier niet worden gesneden, waarbij de hoek van het been met de buik de huid vatbaarder maakt voor letsel door tondeuses. Bovendien moet al het ontharen worden verwijderd met warm water om te voorkomen dat dieren de crème binnenkrijgen tijdens normaal verzorgingsgedrag. Om LN-injecties te oefenen, kan een hogere tracerkleurstofconcentratie worden toegediend en kunnen oefendieren worden geëuthanaseerd en vervolgens meerdere keren worden geïnjecteerd. Na injectie kunnen muizen worden necropsie ondergaan en de grootte van LAN's van geïnjecteerde dieren kan worden vergeleken met een niet-geïnjecteerde controle-LN. Een beperking van deze techniek is de fysieke limiet van het injectievolume dat in de LN-structuur kan worden geladen. Ons protocol suggereert een injectievolume van 10 μl bij muizen, hoewel andere studies grotere injectievolumes hebben gemeld die minstens zo hoog zijn als 20 μl.¹³ De directe toediening van vaccins via i.LN. injectie maakt echter dramatische dosissparen mogelijk, zodat de functie van deze vaccins over het algemeen niet mag worden beperkt door volumebeperkingen.

Zoals opgemerkt, is het veranderen van de fysische eigenschap van de deeltjes(d.w.z. grootte) een effectief mechanisme om de route of resultaten te veranderen die worden geïnduceerd door biomaterialen en ingekapselde ladingen in LN-weefsel. Het emulsie-/oplosmiddelverdampingsprotocol kan eenvoudig worden gewijzigd om fysische of chemische eigenschappen zoals oppervlaktelading of functionaliteit en de snelheid van biologische afbraak/ladingafgifte te wijzigen^23,24. De afgiftekinetiek kan bijvoorbeeld worden afgestemd door middel van alternatieve polymeersamenstellingen en de oppervlaktefunctie kan worden gewijzigd met behulp van gemodificeerde lipidesamenstellingen of poly (vinylalcohol). De lading geladen in deeltjes kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om verschillende antigenen of hulpstoffen voor doelpathogenen te bevatten. Het voordeel van deze aanpak wordt bereikt door de combinatie van i.LN. levering met lokale, gecontroleerde vrijgave van lading uit biomaterialen. Deze synergie creëert een platform dat kan worden benut om efficiënt adaptieve immuunresponsen te genereren met behulp van minieme doses en met verminderde niet-specifieke / systemische bijwerkingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375	10 mg/ml stock in chloroform
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880128	10 mg/ml stock in chloroform
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890	10 mg/ml stock in chloroform
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	P2191	Lactide:Glycolide (50:50). MW 30.000-60.000
Dichloromethane (DCM)	VWR	BDH1113
Isoflurane	Vetone	502017
Nair	Nair
Evans blue tracer dye	VWR	AAA16774-09
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle	VWR	BD328418
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle	VWR	BD305167
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml	VWR	BD309628
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm	VWR	21008-949
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	Invitrogen	V-22887
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm	Polysciences	17149
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm	Polysciences	17156
Ovalbumin, Purified	Worthington Biochemical	LS003056
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125	Qsonica	Q125	1/8 in diameter microtip probe
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer	IKA	YO-04739-22	10 G dispersing element
Fluorescent Microscope	Olympus	IX-83
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer	Horiba	LA-950	Including provided cuvette-style glass fraction cell
Professional 8685 Peanut Classic Clippers	Wahl