Methodenartikel

Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie

DOI:

10.3791/50989

⸱

12 november 2013

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2MRC Centre for Developmental Neurobiology, King's College London

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroblast migratie is een cruciale stap in postnatale neurogenese. Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt om de rol van de kandidaat regulatoren van neuroblast migratie door gebruik DNA / small hairpin RNA (shRNA) nucleofection en een 3D migratietestsysteem met neuroblasts geïsoleerd van het knaagdier postnatale rostrale migratiestroom onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subventriculaire zone (SVZ) gelegen in de laterale wand van de laterale ventrikels speelt een fundamentele rol bij volwassen neurogenese. In dit beperkte gebied van de hersenen, neurale stamcellen vermenigvuldigen en voortdurend genereren neuroblasts die tangentieel migreren in ketens langs de rostrale migratie stroom (RMS) om de olfactorische bulb (OB) te bereiken. Eenmaal in de OB, neuroblasts overschakelen naar radiale migratie en vervolgens differentiëren tot rijpe neuronen in staat zijn om te integreren in de reeds bestaande neuronale netwerk. Juiste neuroblast migratie is een fundamentele stap in neurogenese, het waarborgen van de juiste functionele rijping van pasgeboren neuronen. Gezien het vermogen van SVZ-afgeleide neuroblasts om gewonde gebieden richten in de hersenen, het onderzoek naar de intracellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hun beweeglijkheid zal niet alleen het inzicht in neurogenese, maar kan ook de ontwikkeling van neuroregeneratieve strategieën.

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerdeprotocol voor de transfectie van primaire knaagdier RMS postnatale neuroblasts en de analyse van hun beweeglijkheid behulp van een 3D in vitro migratiebepaling indient de wijze van migratie waargenomen in vivo. Zowel de rat en de muis neuroblasts kan snel en efficiënt getransfecteerd zijn via nucleofectie met ofwel plasmide-DNA, kleine haarspeld (sh) RNA of korte storende (si) RNA-oligo's gericht genen van belang. Om migratie analyse worden nucleofected cellen opnieuw geaggregeerde in 'opknoping druppels en vervolgens ingebed in een driedimensionale matrix. Nucleofectie per se niet wezenlijk afbreuk doen aan de migratie van neuroblasts. Farmacologische behandeling van nucleofected en opnieuw geaggregeerde neuroblasts kan ook worden uitgevoerd om de rol van signalerende wegen betrokken bij neuroblast migratie bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de postnatale hersenen van zoogdieren, productie van nieuwe neuronen (neurogenese) optreedt gedurende levensduur en is beperkt tot twee neurogene niches subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone van de dentate gyrus van de hippocampus 1. Verschillende recente studies hebben aangetoond dat de belangrijke rol van de volwassen neurogenese in het faciliteren van leer-en geheugentaken 2,3. Bovendien, het bewijs van proliferatie en rekrutering van neurale voorlopercellen na hersenletsel 4-7 noemt de mogelijkheid van farmacologische activatie van neurogenese in neurale reparatie.

Postnatale neurogenese is strikt gereguleerd in alle fasen, die neurale voorlopercellen proliferatie, migratie, differentiatie, overleving, en de uiteindelijke synaptische integratie van pasgeboren neuronen 8 omvatten. Neurale voorlopercellen (neuroblasts) afgeleid van stamcellen in de SVZ migreren over grote afstand door de rostrale trekkendestroom (RMS) naar de bulbus olfactorius (OB), waar ze volwassen worden in functionele neuronen 9. Trekkende neuroblasts zijn overwegend unipolaire, met een langwerpig cellichaam uitstrekt een leidende proces. Deze cellen verplaatsen in ketens op collectieve wijze, schuiven over elkaar 10. Migratie is een belangrijke stap voor de verdere rijping van SVZ-afgeleide voorlopercellen in functionele neuronen 11 en wordt beheerst door meerdere factoren en navigatie moleculen inclusief: polysialylated neurale celadhesie molecuul (PSA-NCAM) 12, Efrines 13 integrines 14, Slits 15, groeifactoren 16 en neurotransmitters 17, maar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces worden niet volledig begrepen. Onderzoek de intracellulaire signaleringsroutes reguleren neuroblast migratie niet alleen een beter begrip van volwassen neurogenese, maar zal ook bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutischebenaderingen van de hersenen te repareren te promoten.

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om de rol van kandidaat regulatoren van neuroblast migratie in vitro bestuderen met nucleofection en een 3D migratietestsysteem. Nucleofection is een cel transfectie techniek waarbij een verbeterde werkwijze elektroporatie. Celtype specifieke elektrische stroom en nucleofection oplossing toestaan ​​dat van polyanionische macromoleculen zoals DNA en shRNA vectoren en siRNA oligonucleotiden direct in de celkern en vergunningen transfectie van langzaam delende of mitotisch inactieve cellen zoals embryonale en zoogdieren neuronen 18. Deze methode is snel, relatief gemakkelijk uit te voeren en resulteert in zeer reproduceerbare transfectie van een groot aantal celtypen waaronder primaire neuroblasts en 19-21 neuronen.

Dissociatie van RMS weefsel maakt de isolatie van trekkende neuroblasts, die met succes kan worden nucleofected met DNA / SHRNA vectoren of siRNA oligo's gericht genen van belang. Na nucleofection worden neuroblasts opnieuw geaggregeerde in opknoping druppels en vervolgens ingebed in een driedimensionale Matrigel matrix. Deze voorwaarden kunt neuroblasts migreren uit de cel aggregaten indient migratie modus waargenomen in vivo, waardoor een uitstekend modelsysteem signalerende wegen betrokken bij neuroblast migratie te onderzoeken en de invloed van farmacologische behandelingen op de motiliteit van deze cellen bepalen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure is in overeenstemming met de UK Home Office Verordeningen (Animal Wetenschappelijke Procedures Act, 1986). Wetenschappers zouden de gevestigde en door hun institutionele en nationale dier regelgevende organisaties goedgekeurde richtlijnen te volgen.

1. Dissectie en dissociatie van Rat RMS neuroblasts

  1. Bereid de voor RMS dissectie en dissociatie oplossingen:

Dissectie medium (100 ml)
Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) - 98.5 ml
5 M HEPES pH 7,4-0,5 ml
Penicilline-streptomycine (10.000 eenheden / ml en 10.000 pg / ml) - 1 ml

Dissociatie medium (2 ml)
HBSS - 1.760 ml
10x trypsine (2,5%) - 200 pl
DNAse1 (1 mg / ml) - 40 pl

Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) (40 ml)
DMEM -36 ml
FCS - 4 ml

Compleet medium (12 ml)

Neurobasal medium - 11.46 ml
B27 supplement - 250 pl
L-glutamine (200 mM) - 125 pl
Glucose (45%) - 165 pl

2. Filter-steriliseer de DMEM + 10% FCS en compleet medium en preequilibrate ze in een 37 ° C / 5% CO2 incubator.

  1. Ontleding
    1. Offer een P6-P7 rat nest (ongeveer 12 pups) door cervicale dislocatie en onthoofden met een schaar.
    2. Maak een achterwaartse insnijding in de huid langs de mid-pijlnaad van de neus naar de kleine hersenen met een scalpel. Schil de huid uit en herhaal dezelfde incisie langs de schedel.
    3. Verwijder voorzichtig de craniale flappen met een tang en verwijder voorzichtig de hersenen met een spatel, zorg ervoor dat de olfactorische bollen bevatten.
    4. Snijd de meest caudale derde van de hersenen en gooi hem weg.
    5. Hak the hersenweefsel in 1,4 mm dikke coronale plakjes met een tissue chopper.
    6. Leg plakjes in gerechten met koud dissectie medium en ze voorzichtig los met behulp van een naald.
    7. De RMS verschijnt als een driehoekige, doorzichtige gebied in het centrum van OB secties en als een klein cirkelvormig gebied meer caudale hersencoupes. Snijd de RMS uit elk sneetje met een microchirurgische mes, zorg om te voorkomen inclusief omliggende weefsel. In P7 rattenpups, meestal de ~ 8 meest rostrale plakjes (inclusief OB) bevatten de RMS.
    8. Verzamel de RMS-fragmenten met een plastic Pasteur pipet en plaats ze in een kleine schotel met koud dissectie medium op ijs.
    9. Wanneer de dissectie is voltooid, breng de RMS fragmenten in een 15 ml buisje met een plastic pipet. Voeg fragmenten bezinken op de bodem van de buis.
  2. Dissociatie
    1. Vervang de dissectie medium met 2 ml dissociatie medium.
    2. Vermaal de RMS-fragmenten door zachtjes pipetting het fragment ophanging op en neer over 10x met behulp van een P1000 pipet.
    3. Laat de buis met het weefsel fragmenten in een 37 ° C waterbad gedurende 2 minuten.
    4. Pipetteer de oplossing weer 10x en ervoor te zorgen dat fragmenten hebben gedistantieerd (de suspensie moet troebel).
    5. Inactivatie van het trypsine door toevoeging 5 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS.
    6. Centrifugeer de celsuspensie bij 433 xg gedurende 5 minuten.
    7. Ondertussen monster de vereiste hoeveelheid siRNA / DNA in Eppendorf buisjes (meestal 3-5 ug DNA / shRNA of 5-9 ug siRNA oligo per nucleofection, maar de hoeveelheid DNA / siRNA kan optimalisering vereisen).
    8. Verwijder overtollig medium en resuspendeer de cel pellet door voorzichtig pipetteren in 5 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS.
    9. Voer een celgetal. Verwacht ~ 1 x 10 6 cellen per rat pup hersenen. Een minimum van 2,5 x 10 6 cellen voor elke nucleofection, terwijloptimale resultaten worden bereikt met behulp van 3-4 x 10 6 cellen per nucleofectie.
    10. Centrifugeer de celsuspensie bij 433 xg gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat u zo veel medium te verwijderen als mogelijk.

2. Nucleofectie

  1. Onmiddellijk resuspendeer de celpellet in ratten (of muizen bij gebruik muizencellen) neuron nucleofection oplossing die vooraf geïncubeerd bij kamertemperatuur. Gebruik 100 ul per nucleofectie. Opmerking: typisch een rat nest van 12 pups is voldoende om 4 nucleofections presteren en een muis nest (12 pups) is voldoende om 2 nucleofections voeren.
  2. Breng 100 pi van de celsuspensie aan elk Eppendorf buis met siRNA / DNA en meng voorzichtig 2-3x door pipetteren met een pipet P200.
  3. Voeg de steekproef (cell-DNA/siRNA schorsing) aan de onderkant van de nucleofectioncuvette, zorg om luchtbellen te voorkomen.
  4. Nucleofect behulp van het programma G-013 (voor cellen rat) of O-005 (voormuizencellen). Een nucleofectie duurt ongeveer 5 sec.
  5. Voeg snel 1 ml voorverwarmde DMEM + 10% FCS aan de nucleofected monster.
  6. Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 voor alle andere monsters. Opmerking: voor een optimaal resultaat, dient de gehele nucleofectie procedure niet langer dan 5 minuten duren.
  7. Breng elk monster een 15 ml buis met 5 ml voorverwarmd DMEM + 10% FCS met de plastic pipet door de nucleofection kit. Vermijd de overdracht van eventuele cellulaire puin aan de buis.
  8. Centrifugeer monsters bij 433 xg gedurende 5 minuten.
  9. Verwijder voorzichtig alle overtollige medium en resuspendeer de pellet in 25-30 ul voorverwarmde DMEM + 10% FCS met een P20 pipet. Gebruik niet meer dan 30 pl medium.
  10. Pipetteer de suspensie als een druppel op de binnenzijde van een p35 schotel deksel.
  11. Inverteer de deksel via p35 schaaltje met 2 ml compleet medium (zie ook figuur 1).
  12. Laat in de incubator (37 ° C / 5% CO2) gedurendeminste 5 uur en maximaal 7 uur. Langere incubatietijd maakt een betere reaggregation van celgroepen.
  13. Breng de hangende druppels van het deksel in de compleet medium in de schotel met een P1000 pipet met een cut tip.
  14. Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 24 uur voor DNA nucleofections en 48 uur voor siRNA / shRNA nucleofections.

3. Inbedding

  1. Bereid compleet medium (25 ml) en preequilibrate het bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende enkele uren.
  2. Haal de bevroren monsters van basaal membraan matrix van -80 ° C vriezer en ontdooien op ijs in de koude kamer.
  3. Per nucleofection een 6 cm schaaltje met maximaal acht 13 mm steriel coverlips bereiden.
  4. Leg de gerechten op een ice box bedekt met plasticfolie. Het is belangrijk om de dekglaasjes koelen matrix stollen tijdens het inbedden procedure voorkomen.
  5. Om de vochtigheid te behouden, plaats een strook van vochtige weefsel in een 15 cm schotel die wziek worden gebruikt om maximaal drie 6 cm schalen met de embedded neuroblasts.
  6. Voeg compleet medium aan de ontdooide matrix in een 01:03 verhouding. Bijvoorbeeld, meng 40 pl compleet medium met 120 gl matrix door pipetteren. Deze hoeveelheid is voldoende voor matrix inbedden aggregaten acht 12 mm dekglaasjes.
  7. Breng het opnieuw geaggregeerde cel clusters aan een 15 ml buis en centrifugeer bij 433 xg gedurende 5 minuten.
  8. Verwijder overtollig medium en resuspendeer de pellet in 10 ul volledig medium.
  9. Plaats 2 pl cel totale schorsing op elke steriele dekglaasje en voeg 18 ul van matrix / volledig medium mengsel. Gebruik de pipet tip om de matrix over de gehele dekglaasje verspreid.
  10. Onmiddellijk de 6 cm schaaltje met de dekglaasjes in de 15 cm schaal en laat in de incubator (37 ° C / 5% CO2) gedurende 15-20 minuten. Als de matrix is ​​gestold, zachtjes voeg 5 ml compleet medium aan elk 6 cm schotel verzorgen te duwenonderaan een drijvend dekglaasje met een pipet tip.
  11. Incubeer 24 uur bij 37 ° C / 5% CO 2 te laten neuroblasts migreren uit de cel aggregaten.

4. 3D Migratie Assay

  1. Bereid de voor immunokleuring oplossingen.
    1. Bereid het blok oplossing:
      Geit blok-oplossing (50 ml)
      Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) - 5 ml
      Geitserum - 7,5 ml
      10% Triton X-100 - 1,5 ml
      BSA - 50 mg
      H 2 O - 36 ml
    2. Filter en bewaar bij 4 ° C.
    3. Bereid de vaststelling oplossing:
      Bevestiging (100 ml)
      Paraformaldehyde (PFA) - 4 g LET OP: altijd behandelen PFA onder een kap
      Sucrose - 20 g (optioneel)
      PBS tot 100 ml
    4. Op een hete plaat en onder constant roeren opgelost PFA in 80 ml PBS gehouden op 65 ° C.
    5. Zodra de PFA is opgelost, voeg 20 g sucrose.
    6. Breng de pH op7.4 (gewoonlijk door toevoeging ~ 60 pi 1 M NaOH per 100 ml oplossing).
    7. Breng tot een totaal volume van 100 ml met PBS.
  2. Immunostaining
    1. Plaats dekglaasjes in een 24-well plaat.
    2. Spoel coverslips met PBS 2x.
    3. Bevestig de RMS neuroblast aggregaten met bevestigings oplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Spoel coverslips met PBS 3x (5 min / wasbeurt - op een schommelende platform).
    5. Blok voor 30-60 min met geit blok oplossing.
    6. Verdun primaire antilichamen bij geiten blok-oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C. (Indien gewenst, fluorescent phalloidin (1:400) en Hoechst kleurstof (1:10.000) kan ook worden toegevoegd aan het primaire antilichaam oplossing filamenteuze actine en kernen zichtbaar).
    7. Spoel coverslips met PBS 3x (5 min / wasbeurt).
    8. Verdun secundaire antilichamen bij geiten blok-oplossing en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
    9. Spoel coverslips met PBS 3x (5 min / wasbeurt)
    10. Mount coverslips met fluorescerende montage medium en laat een nacht drogen bij kamertemperatuur.
  3. Migratie Analyse
    1. Beelden vastleggen van vaste RMS neuroblast aggregaten met een fluorescentiemicroscoop met een 10X objectief. Omvatten een schaal bar afbeelding een monster in.
    2. Voor het instellen van de schaal voor de kwantificering, meet de schaal bar in het beeld door het selecteren van de 'Rechte lijn' tool op de ImageJ werkbalk.
    3. Kies de optie 'Analyseren' en klik op 'zet de schaal'.
    4. In de schaal venster in te stellen de 'bekende afstand' en vink de 'global' box om dezelfde instellingen voor alle metingen te houden.
    5. Gebruik de 'Gesegmenteerde lijn' tool op de ImageJ werkbalk om de afstand te meten vanaf de rand van het aggregaat naar de verste gemigreerd neuroblast in 6 verschillende sectoren over de gehele aggregaat (Figuur 3B). Besteed alleen geïsoleerd aggregates voor analyse.
    6. Bereken een gemiddelde migratie afstand van de 6 waarden verkregen voor ieder aggregaat.
    7. Meet 10-20 aggregaten voor elke aandoening in elke onafhankelijke experiment en het zwembad de resultaten van een minimum van drie onafhankelijke experimenten. Vermeld altijd een nucleofectie controle (bv. GFP of een controle-sh / siRNA).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroblasts succes kan worden geïsoleerd uit ontleed RMS weefsel (Figuur 1A) en ingebed in een driedimensionale matrix. Cellen geïsoleerd uit zowel rat of muis postnatale RMS zijn immunopositieve voor trekkende neuroblast markers, zoals doublecortin (DCX), βIII tubuline of PSA-NCAM (figuren 1B-C).

Gedissocieerde neuroblasts efficiënt worden nucleofected met DNA (bijv.. Een GFP coderende plasmide, figuur 2) of shRNA plasmiden (figuur 4) eiwit uitputting bereiken, die kan worden bepaald door western blot analyse (Figuur 4B) of immunofluorescentie (niet getoond) .

Cellen nucleofected met GFP coderen plasmiden migreren radiaal uit opnieuw geaggregeerde neuroblast clusters (figuur 3A). Kwantificering van relatieve gemigreerde afstand 24 uur na het inbedden (Figuur 3B) toont geen verschil in migratie tussen GFP-poneren ive cellen en GFP-negatieve, nonnucleofected cellen (figuur 3C), wat aangeeft dat nucleofectie zodanig niet van migratie verstoren. Er is geen significant verschil in de mate van migratie tussen nucleofected neuroblasts en neuroblasts direct migreren van RMS explantaten (gegevens niet getoond).

figure-results-1
Figuur 1. Dissectie van RMS neuroblasts. (A) Schematische weergave van RMS neuroblast dissectie. Voor een gedetailleerde beschrijving wordt verwezen naar de tekst. (B) Geïsoleerde rat RMS cellen zijn immunopositieve voor de trekkende neuroblast makers DCX en βlll tubuline. Bar, 20 urn. (C) Cellen migreren van muis RMS explants drukken de trekkende neuroblast markers DCX en PSA-NCAM. Bar, 20 urn.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

figure-results-2
Figuur 2. Muis neuroblast nucleofectie. Dissociated muis RMS neuroblasts werden nucleofected met Pmax-GFP, opnieuw geaggregeerde, ingebed in een driedimensionale matrix en mogen migreren gedurende 6 uur. Neuroblasts migreren uit een opnieuw geaggregeerde cel cluster (top, fase contrast foto's) vertonen een hoge transfectie-efficiëntie (bodem, GFP kanaal foto's). De rechterkant panelen laten hogere vergroting beelden overeenkomt met de bijvoegsels gemarkeerd in de linkerkolom panelen. Bars, 20 urn. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-3 NHOUD-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg" width = "500px" />
Figuur 3. 3D Migratie assay. (A) Ratten neuroblasts werden nucleofected met PMAX-GFP (GFP) of pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), opnieuw geaggregeerde, ingebed in matrix en vertrokken om te migreren voor 24 uur. Cellen werden vervolgens gefixeerd en immunologisch gekleurd voor GFP (groen) en βIII tubuline (rood). Bar, 50 pm (B). Meten migratie afstand met behulp van ImageJ. De opnieuw geaggregeerde cel cluster is verdeeld in 6 gelijke sectoren. De afstand tussen de rand van het cluster (stippellijn) en het verst gemigreerde cel wordt gemeten voor elke sector. (C) Kwantificering van de relatieve afstand gemigreerd nucleofected cellen (GFP-positieve) en controle nonnucleofected cellen (GFP-negatief) . Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-results-4"Figuur 4" fo: content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" width = "500px" />
Figuur 4. Monitoring neuroblast migratie na shRNA nucleofectie. (A) Ratten werden neuroblasts nucleofected met een controle shRNA vector (pCA-b-EGFPm5 Demper 3, die ook tot expressie EGFP 23) of dezelfde vector die een shRNA gericht fascin, een actine bundeling eiwit 24. Cellen werden opnieuw geaggregeerde dan 48 uur, ingebed in matrix en liet men migreren 24 uur. Aggregaten werden vervolgens gefixeerd en immunostained voor GFP (groen) en βIII tubuline (rood). Bar, 50 pm (B). Effectieve fascin depletie kan worden gedetecteerd 50 uur na shRNA nucleofection door Western blot analyse. Actine wordt hier getoond als een laad-controle (C) Kwantitatieve analyse van relatieve migratie afstand waaruit blijkt dat fascin uitputting aanzienlijk schaadt neuroblast migratie. (Gemiddelde ± SEM; ** p <0,01, n = 3 onafhankelijke experimenten). Klik hier voor grotere afbeelding.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De migratie van neuroblasts langs de RMS naar de uiteindelijke locatie in de OB is een fundamentele stap in postnatale neurogenese. De moleculaire mechanismen die dit complexe proces verre van volledig begrepen.

De hier beschreven experimentele procedure maakt de studie van neuroblast migratie in vitro. We hebben een eerder gepubliceerde protocol aangepast voor het isoleren van RMS neuroblasts van vroege postnatale muis of rat 25. Om een ​​optimaal resultaat is het belangrijk om de dissectie stap beheersen, omdat het cruciaal om het tijdsinterval tussen dissectie en nucleofection te beperken. Na nucleofection kan neuroblasts worden opnieuw geaggregeerde, ingebed in een driedimensionale matrix en links te migreren gedurende een periode van 24 uur. Als alternatief voor andere doeleinden dan de migratie (bijv. immunofluorescentie of western blot analyse) doeleinden, cellen direct worden verzilverd na nucleofectie op polyornithine/laminin-beklede dekglaasjes, waar ze overleven tot 4-5 dagen. Muis en rat neuroblasts migreren Matrigel gelijke mate echter muiscellen blijken een sterkere neiging tot migreren ketens dan cellen rat hebben.

Afhankelijk van het doel van de studie kan worden neuroblasts nucleofected met verschillende plasmiden die fluorescerende eiwitten of wildtype / mutant eiwitten van belang. Voor een optimale eiwit expressie plasmiden met een CAG promotor (β-actine promoter met CMV enhancer en-β globine poly-A-staart) 26 zijn sterk aanbevolen. Bovendien kan siRNA oligo of shRNA plasmiden worden nucleofected om doelen van belang knockdown. Effectieve eiwit uitputting kan worden gevisualiseerd door immunofluorescentie of door western blot (meestal lyseren ingebed aggregaten van 1 rat pup met 50 ul van standaard lysisbuffer).

Nucleofection is een relatief eenvoudige methode om primaire neuroblasts transfecteren, biedt een eenvoudiger en sneller alternatief viral-vector gemedieerde transfectie, en kan hoge (~ 70-80%) transfectie efficiëntie te bereiken. Het is cruciaal om snel te werken tijdens de nucleofection procedure sinds het verlaten neuroblasts de nucleofection oplossing gedurende langere tijd drastisch vermindert cellevensvatbaarheid.

De gemiddelde cel opbrengst van RMS dissectie relatief laag voor P7 muizen (~ 5 x 10 5 cellen / brein) ten opzichte P7 ratten (~ 1 x 10 6 cellen / brein) en ten minste 3 x 10 6 cellen per nucleofection vereist de transfectie bereiken met ~ 50% rendement. Bovendien neuroblasts rat blijken beter bestand te nucleofectie vergelijking met muis neuroblasts. Daarom zou pups vroege postnatale (P6-P7) rat een handige neuroblast bron vertegenwoordigen, ook gezien het feit dat de organisatie van de rat en de muis RMS zijn opmerkelijk similar 27 en dat de omvang van rat en muis neuroblast migratie in vitro is ook vergelijkbaar. Het is raadzaam het opnieuw geaggregeerde clusters van nucleofected neuroblasts in suspensie niet te houden voor langer dan 48 uur aan abnormale effecten op cel morfologie en migratie (onze gepubliceerde waarnemingen) te vermijden.

De 3D assay beschreven kunnen worden gebruikt om neuroblast migratie kwantificeren op een vast tijdstip na inbedding in matrixmateriaal (bijv.. 24 uur). Aggregaten van verschillende afmetingen kunnen worden gebruikt bij de analyse, aangezien er geen significante correlatie tussen de grootte van de aggregaten en migratie afstand (onze niet gepubliceerde waarnemingen). Visualiseren en verder de dynamiek van neuroblast migratie te onderzoeken, kan time-lapse imaging worden gebruikt. Het wordt aanbevolen om de migratie-analyse uit te voeren binnen een 24 uur interval na het inbedden, omdat de snelheid van neuroblasts lijkt drastisch te verlagen op meer tijdstippen (onze gepubliceerde waarnemingen).

Er zijn enkele beperkingen aan deze protocol. Ten eerste kan nucleofection dusver worden voor vroege postnatale knaagdier neuroblasts, terwijl infectie met virale vectoren blijft de meest efficiënte transfectie methode voor volwassen neuroblasts 28. Ten tweede, de in vitro migratie assay niet volledig de complexe architectuur van de waargenomen in vivo RMS reproduceren. Ofschoon neuroblasts behouden het vermogen om te migreren op een soortgelijke manier om hun in vivo tegenhangers in de experimentele opzet beschreven ze geen interacties met andere RMS componenten zoals astrocyten en bloedvaten, die ook bijdragen tot hun beweeglijkheid 9,29 reguleren, 30. Dit probleem kan in de toekomst worden aangepakt door optimalisatie van driedimensionale coculture modelsystemen.

Tot slot, een combinatie nucleofectie met een 3D migratie test is een waardevol instrument om beter inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggenneuroblast migratie. De experimentele procedure wordt een eerste, snelle en relatief eenvoudige methode om de rol van kandidaat regulatoren van neuroblast migratie, die verder kan worden gevalideerd door andere benaderingen zoals in vivo elektroporatie en postnatale time-lapse beeldvorming van de hersenen slice cultures evalueren 28,31,32 .

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust Project Grant toegekend aan PD en GL (089236/Z/09/Z). SG werd ondersteund door een biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council PhD studentship. Wij danken Matthieu Vermeren voor het soort geschenk van de shRNA vector en Jennifer Shieh voor waardevolle adviezen over neuroblast nucleofectie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicillin-StreptomycinInvitrogen Life Technologies15140-122
2.5% Trypsin-EDTA (10x)Gibco15090-046bewaar 200 µl aliquots bij -20 °C
DNAse I Vial (D2)WorthingtonLK003170>1.000 eenheden per fles; bewaar 50 µl aliquots bij -20 °C
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco11960-044
Fetal Calf Serum (FCS)HycloneSH3007902
Neurobasal mediumGibco21103-049
B27 supplementInvitrogen Life Technologies17504044
L-Glutamine (200 mM)Invitrogen Life Technologies25030-081
D-(+)-Glucose solution (45%)Sigma-AldrichG8769
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-FreeBD Biosciences356231bereid 120 µl aliquots bij 4 °C voor, bewaar daarna bij -80 °C
PFASigma-Aldrich441242
SucroseBDH102745C
Goat serumSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
BSAFisher ChemicalBPE9701-100
Dako fluorescence mounting mediumDakoS3023
Rat neuron nucleofection kitLonzaVPG-1003
Mouse neuron nucleofection kitLonzaVPG-1001
Microsurgical knifeAngiotech7516
McIlwain tissue chopperThe Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector IILonza

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. J. Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Alonso, M., et al. Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory. Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).
  3. Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction? Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
  4. Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
  5. Jin, K. L., et al. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).
  6. Kim, Y., Szele, F. G. Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury. Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).
  7. Massouh, M., Saghatelyan, A. De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature. Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).
  8. Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
  9. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  10. Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
  11. Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
  12. Battista, D., Rutishauser, U. Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues. J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).
  13. Conover, J. C., et al. Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone. Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).
  14. Mobley, A. K., McCarty, J. H. beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream. Glia. 59, 1579-1587 (2011).
  15. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).
  16. Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling. J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).
  17. Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg. Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).
  18. Dityateva, G., et al. Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons. J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).
  19. Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons. PloS One. 6, (2011).
  20. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  21. Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. Nucleofection of primary neurons. Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).
  22. Causeret, F., et al. The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).
  23. Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse. Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).
  24. Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
  25. Ward, M., Rao, Y. Investigations of neuronal migration in the central nervous system. Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).
  26. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  27. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).
  28. Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. , e4061(2012).
  29. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  30. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  31. Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain. J. Vis. Exp. , in press (2013).
  32. Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. , e50197(2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nucleofectietechniekrostrale migratiestroom3D in vitro assayhanging drop methodeimmunofluorescentieanalysetime lapse imagingplasmid DNA transfectieshRNA siRNA afgifteWestern blot analyse

Gerelateerde artikelen