Methodenartikel

Identificatie van een Muriene erytroblast subpopulatie verrijkt in Enucleating Events door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

DOI:

10.3791/50990

⸱

6 juni 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 2IBM

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het identificeren van een populatie van enucleating orthochromatische erytroblasten van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, die een visualisering van de erytroblast enucleatie proces.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erytropoëse in zoogdieren wordt afgesloten met het dramatische proces van enucleatie dat resulteert in reticulocyten formatie. Het mechanisme van enucleatie is nog niet volledig opgehelderd. Een veelvoorkomend probleem bij het bestuderen van de lokalisatie van de belangrijkste eiwitten en structuren binnen enucleating erytroblasten microscopisch is de moeilijkheid om een ​​voldoende aantal cellen die enucleatie nemen. We hebben een nieuwe analyse protocol ontwikkeld met multiparameter high-speed cell imaging in flow (Multi-Spectral Imaging flowcytometrie), een methode die immunofluorescente microscopie gecombineerd met flowcytometrie, teneinde efficiënte manier een groot aantal enucleating gebeurtenissen die toelaat verkrijgen metingen en statistische analyses uit te voeren.

We beschrijven eerst hier twee in vitro erytropoëse cultuur methoden die worden gebruikt om muizen erytroblasten synchroniseren en verhogen de kans op het vastleggen van enucleatie bij The tijd van evaluatie. Vervolgens beschrijven we in detail de kleuring van erythroblasten na fixatie en permeabilisatie om de lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipide rafts bestudeerd worden enucleatie van multispectrale beeldvorming flowcytometrie. Samen met de grootte en DNA/Ter119 vlekken die worden gebruikt om de orthochromatische erytroblasten identificeren, maken we gebruik van de parameters "aspect ratio" van een cel in de bright-field kanaal dat helpt bij de erkenning van langgerekte cellen en "delta centroïde XY Ter119/Draq5 "waarmee de identificatie van cellulaire gebeurtenissen waar het centrum van Ter119 kleuring (ontluikende reticulocyten) is ver uit het centrum van Draq5 kleuring (nucleus ondergaan extrusie), hetgeen wijst op een cel over te ophelderen. De subset van de orthochromatische erythroblast bevolking met een hoge delta zwaartepunt en lage aspect ratio wordt sterk verrijkt in enucleating cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terminale differentiatie in de erytroïde afstammingslijn bij zoogdieren eindigt met de dramatische proces van enucleatie, waardoor de orthochromatische erytroblast verdrijft het membraan omhulde kern (pyrenocyte) 1, het genereren van een reticulocyten 2. Het exacte mechanisme van deze werkwijze, die ook de snelheidsbeperkende stap van succesvolle, grootschalige productie van rode bloedcellen in vitro, is nog niet volledig opgehelderd. De lokalisatie van de belangrijkste eiwitten en structuren binnen enucleating erythroblasten gebaseerd op het gebruik van fluorescente en elektronenmicroscopie 3-5. Dit moeizaam proces resulteert typisch in de identificatie van een beperkt aantal enucleatie evenementen en niet altijd mogelijk zinvolle statistische analyse. Voortbouwend op een werkwijze erytroblast identificatie eerder beschreven door McGrath et al.. 6, hebben wij een nieuwe benadering voor het identificeren en bestuderen enucleatie gebeurtenissen door Multi-Spectral Ima ontwikkeldGing flowcytometrie (multiparameter snelle celweergave in flow, een methode die fluorescentiemicroscopie met flowcytometrie combineert) 7, dat een voldoende waarnemingen kan leveren uitvoeren van metingen en statistische analyse.

Hier beschrijven we eerst twee in vitro erytropoëse kweekmethoden gebruikt om erytroblasten synchroniseren en verhogen de kans op het vastleggen enucleatie bij de evaluatie. Vervolgens beschrijven we in detail de kleuring van erythroblasten na fixatie en permeabilisatie om de lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipide rafts bestudeerd worden enucleatie van multispectrale beeldvorming flowcytometrie.

Monsters worden uitgevoerd op een imaging flowcytometer en de verzamelde cellen adequaat gated om orthochromatische erytroblasten 6 identificeren. Orthochromatische erythroblasten worden vervolgens geanalyseerd op basis van hun verhouding, gemeten helderveld imaGing, versus de waarde voor de parameter delta zwaartepunt XY Ter119-DNA, dat wordt gedefinieerd als de afstand tussen de middelpunten van de gebieden, respectievelijk gekleurd voor Ter119 en DNA. De populatie van cellen met een lage aspect ratio en een hoge delta centroïde XY Ter119/DNA is sterk verrijkt in enucleating cellen. Met behulp van wild-type (WT) erytroblasten versus erytroblasten met Mx-Cre-gemedieerde voorwaardelijke schrapping van Rac1 op Rac2 - / - of gecombineerd Rac2 - / -; RAC3 - / - genetische achtergrond en deze nieuwe analyse protocol van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, we onlangs aangetoond dat enucleatie lijkt asymmetrische cytokinese en dat de vorming van een ring actomyosine gedeeltelijk gereguleerd door Rac GTPases is belangrijk voor enucleatie progressie 7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lange termijn In vitro Erythropoiesis Cultuur (Ex vivo Erythroid Differentiatie Cultuur Protocol door Giarratana et al.. 8, gewijzigd en aangepast voor Mouse Cells)

Dit is een 3-stap op lange termijn in vitro erytropoëse protocol. In de eerste stap (dagen 0-4) 2 x 10 5 cellen / ml worden in erytroblast groeimedium aangevuld met stamcelfactor (SCF), interleukine-3 (IL-3) en erythropoietine (Epo). In de tweede stap (5-6 dagen) worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 2 x 10 5 cellen / ml en co-gekweekt op hechtende stromacellen (MS5) in vers kweekmedium aangevuld erytroblast alleen Epo. In de derde stap (dagen 7-9), cellen gekweekt op een laag van MS-5-cellen in vers erytroblast groeimedium zonder cytokinen tot enucleatie (figuur 1A).

Alle dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) vanMedisch centrum Kinderen van Cincinnati.

  1. Oogst van botten en isolatie van lage-dichtheid beenmergcellen
    1. Voeg 2 ml steriel IMDM dat 2% foetaal bovine serum (FBS) in een 15 ml conische buis en blijf op ijs.
    2. Euthanaseren een 2-6 maand oud wild type C57/BL6 muis (samen met of zonder genetisch gerichte muis van rente) na-instelling goedgekeurde protocol (bijv. CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie).
    3. Isoleer bekken, scheen-, en tibiae van beide benen met behulp van pincet en scalpel, voeg ze toe aan de buis met IMDM 2% FBS en blijf op ijs.
    4. Voeg 1 ml IMDM 2% FBS in een steriele flow cytometrie buis en flush botten behulp van een tang en een tuberculine spuit met een 25-G x 5/8 "naald. Flush IMDM 2% FBS door de botten een paar keer zachtjes ( door opzuigen ~ 500 pi van de celsuspensie en opnieuw spoelen door het bot), en verzamel de beenmergcellen in de stroom-cytometry buis. Vlissingen is voltooid wanneer de botten verschijnen wit.
    5. Filter cel-suspensie door een 40-um cel zeef set op de top van een 50 ml conische buis. Was cel zeef met IMDM 2% FBS en met hetzelfde medium regelen eindvolume van celsuspensie tot 5 ml.
    6. Bereid een lage dichtheid beenmergcellen (LDBM) door dichtheidsgradiëntcentrifugatie: zorgvuldig te laag van de 5 ml celsuspensie op 5 ml dichtheid gradiënt celscheiding medium 1,083 g / ml in een 15 ml buis en draaien op 750 xg gedurende 25 min bij kamertemperatuur (RT) zonder rem / lage versnelling.
    7. Overdracht supernatant (alles tot ongeveer de streep 2 ml van de 15-ml buisje om buffy coat verwerven) een nieuwe 15 ml buis en voer nog een wassing met IMDM 2% FBS bij 525 xg gedurende 5 minuten bij RT.
    8. Zuig supernatant en lyseren resterende rode bloedcellen (RBC) suspenderen van de pellet in 3 ml RBC lysis buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Indien een grotere zuiverheid van erytroblasten isvereist bij de laatste stap (bijv. voor biochemische studies), zuiveren LDBM cellen verder bij deze stap naar Lin neg cellen door magnetische scheiding.
  2. Ex vivo erythroid differentiatie cultuur protocol vanaf LDBM of Lin neg cellen (figuur 1A)
    1. 7 ml IMDM Voeg 2% FBS, rotatie bij 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 2 ml erytroblast groeimedium (EGM), bestaande uit:
      een. StemPro-34-medium, dat
      b. 2,6% StemPro-34 medium supplement,
      c. 20% BIT-9500,
      d. 900 ng / ml ijzersulfaat,
      e. 90 ng / ml ijzernitraat,
      f. 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine, 2 mM L-glutamine
      g. 10 -6 M hydrocortison
      h. en vers toegevoegd cytokines:
      i) 100 ng / ml SCF,
      ii) 5 ng / ml IL-3 en
      iii) 3 IU / ml Epo.
    2. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter of handmatig op een microscoop met een zoomocytometer.
    3. Plaat in een 6-well celcultuur plaat bij een concentratie van 5 x 10 5 cellen / putje tot een eindvolume van 2,5 ml in EGM (2 x 10 5 LDBM cellen / ml) en incubeer bij 37 ° C (dit wordt beschouwd als de dag # 0 van cultuur).
    4. Opnieuw medium door afzuigen 1,5 ml van de supernatant, het spinnen bij 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, opnieuw suspenderen in 1,5 ml vers medium dat alle 3 de cytokines voegen naar de putjes elke dag op dagen # 2, 3, 4, optimaliseren proliferatieve fase. Op dag 3, verwijder alle cellen tellen en verdeeld in geschikte aantal putten om goed celconcentraties van ~ 2 x 10 5 cellen / ml te ondersteunen. Handhaaf cultuur bij 37 ° C / 5% CO 2.
    5. Op dag 4, plaat MS5 cellen (muizen stromale cellijn) in de putjes van een nieuwe cel-cultuur 6-wells plaat. De MS5 cel-kweekmedium α-MEM bevattende 20% FBS, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine.
    6. Op dag 5, telt het aantalcellen (thans aanzienlijk verrijkt in erytroblasten) in elk putje van de oorspronkelijke petrischaal met een geautomatiseerde celgetalmeter of handmatig op een microscoop met een hemocytometer.
    7. Lift alle cellen uit elk putje en overbrengen naar 15 ml conische buizen, spin down 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, aspireren supernatant en los pellets met vers EGM die slechts Epo (3 IU / ml) tot een concentratie van 2 x 10 5 cellen / ml.
    8. Zuig supernatant van de putjes waar MS-5-cellen werden uitgeplaat gisteren (gericht op 70-80% confluentie op het moment van co-cultuur) en voeg de erythroïde cellen in deze putten in EGM met alleen Epo (hoewel hun medium keuze, MS-5-cellen overleven goed in EGM voor meerdere dagen).
    9. Wijzig medium toevoegen van verse EPO op dag # 6.
    10. Opnieuw medium op dag # 7, met EGM zonder toegevoegde cytokinen. Op dagen 7 tot en met 9, de monsters voor enucleatie met flowcytometrie na kleuring met anti-Ter119 en Syto-16 dagelijkse en proceed tegen vlekken monsters voor Multi-Spectral Imaging flowcytometrie (zoals beschreven in paragraaf 3).
      Opmerking:. Voordat plating en op dag 2, 4, 6, en 7 van de cultuur, bewaken gekweekte cellen voor erythroblast verrijking en differentiatie met flowcytometrie door beoordeling oppervlakte markers CD44 en Ter119 vs grootte (FSC) 9 alternatief CD71, Ter119 en FSC kan ook 10, 11.

2. Fast Enucleatie Assay, Volgens het protocol Beschreven door Yoshida et al.. 12 met wijzigingen (Figuur 1B)

  1. Stress erytropoëse inductie en stroma celpreparaat voor in vitro erytropoëse cultuur
    1. Verdoven een 2-6 maand oud wild type C57/BL6 muis per IACUC richtlijnen (bijv. met isofluraan oplossing). Zorg ervoor dat de muis voldoende is verdoofd door te controleren op afwezigheid van reflexieve reacties op een zachte achterste poot knijpen en voorregelmatige ademhaling tijdens de procedure. Gebruik dierenarts oogzalf op de ogen tot droog te voorkomen, terwijl onder verdoving.
    2. Induceren van stress erytropoëse via staart bloeden tot een uiteindelijk volume van 500 pi. Met een insulinespuit, injecteer gelijk volume normale zoutoplossing intraperitoneaal aan vloeistofresuscitatie van het dier (houd dier Trendelenburg voor het injecteren en injecteren in de onderbuik, zodat er geen interne organen beschadigen) verzekeren.
    3. Laat de muis niet onbeheerd achter totdat het motorische controle heeft herwonnen, zoals aangegeven door het dier begint te bewegen rond de kooi en te kunnen staan ​​en lopen zonder te vallen. De Phlebotomized muis in een kooi geplaatst, zonder andere muizen.
    4. Na 2 dagen, plaat MS-5-cellen in putjes van een 24-well celcultuur plaat. Incubeer MS-5-cellen bij 37 ° C / 5% CO 2 in MS5 celmedium (a-MEM bevattende 20% FBS, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) met het doel om 70-80 % samenvloeiing in putjes na 48 uur.
  2. Oogst van milt en verwerking van splenocyten
    1. Vier dagen (96 uur) na het stress-erythropoiesis inductie, Euthanaseren eerder gebloed muis via IACUC-goedgekeurde protocol (bijv. CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie).
    2. Oogst milt en zet het in een 15 ml conische buis met IMDM 2% FBS en blijf op ijs.
    3. Terug in het laboratorium, in weefselkweek kap onder steriele omstandigheden, zwenken milt-bevattende buis op een 40-um cel zeef op de top van een 50 ml buisje. Crush milt met behulp van de zuiger van een 5-ml plastic spuit.
    4. Was cel zeef met IMDM 2% FBS en met hetzelfde medium, het eindvolume celsuspensie passen aan 5 ml.
    5. Laag het 5 ml splenocyt suspensie voorzichtig op 5 ml dichtheid gradiënt celscheiding medium 1,083 g / ml in een 15 ml buis en draaien op 750 xg gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur zonder rem / lage versnelling.
    6. Overdrachtsupernatant (oplossing tot ongeveer de 2-ml-markering van 15 ml buis om buffy coat verwerven) een nieuwe 15 ml buis en voer nog een wassing met IMDM 2% FBS bij 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur .
    7. Zuig supernatant en lyseren rode bloedcellen door het suspenderen van de pellet in 3 ml RBC lysis buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. 7 ml IMDM 2% FBS aan de cellen te wassen en te verdunnen en neutraliseren de RBC lysis buffer en centrifugeren bij 525 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    9. Zuig supernatant en schorten gepilleerd cellen in 2 ml erythroblast groeimedium (EGM).
  3. Cultuur van de geïsoleerde lage-dichtheid splenocyten, verrijkt in erytroblasten, op kunststof (eerste fase van snelle in vitro erytropoëse cultuur)
    1. Tellen cellen op een geautomatiseerde celgetalmeter of handmatig door een hemocytometer. Gebruikelijk aantal cellen geïsoleerd per milt in dit stadium is ~ 15 x 10 6.
    2. Opschorten cellen verder in EGM met de cytokinen (bij fspronkelijke concentraties): SCF 50 ng / ml IL-3 5 ng / ml en Epo 2 U / ml.
    3. Plaat 1-5 x 10 6 cellen in een eindvolume van 1 ml / putje (hetzelfde aantal cellen per putje afhankelijk totale aantal cellen) van een 24-well celcultuur platen en incubeer O / N bij 37 ° C / 5% CO2.
  4. Cultuur van erytroblasten op MS5 cellen (tweede fase van snelle in vitro erytropoëse cultuur
    1. Zuig supernatans van de kunststof goed en til de cellen (sterk verrijkt in erytroblasten) door toevoeging van 2 ml koude 10 mM EDTA in PBS gedurende 5 min op ijs in elk putje.
    2. Plaats cellen in verse buizen keer wassen in EGM (zonder cytokinen) en resuspendeer in dezelfde.
    3. Plate 5 x 10 5 -1 x 10 6 cellen in een volume van 1-2 ml elk MS5-cel bekleed putje van een 24-wells plaat. Als farmacologische remmers worden gebruikt in het experiment, voeg ze op geschikte concentraties nu.
    4. Incubeer gedurende 6 tot 8 uur (tijd geleid doormicroscopische waarneming van ongeveer 30% -40% enucleatie in het onbehandelde monster WT). De binding van erytroblasten naar MS-5-cellen versnelt hun enucleatie.
    5. Til cellen uit elk putje door toevoeging van 2 ml koude PBS + 10 mM EDTA, gedurende 5 minuten op ijs. Samen met de erytroblasten, zal MS-5-cellen ook worden verzameld, maar deze kunnen later eenvoudig worden uitgesloten tijdens flowcytometrische analyse als FSC hi Ter119 - cellen.
    6. In dit stadium kunnen cellen worden gefixeerd en gekleurd voor analyse door Multi-Spectral Imaging flowcytometrie.

3. Kleuring van erytroblasten voor Lokalisatie van intracellulaire eiwitten of lipidevlotten Tijdens Enucleatie door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

  1. Was de cellen in PBS, spinnen 525 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en aspireren supernatant.
  2. Fix cellen door resuspenderen celpellets in 500 ui 3,7% formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten (fixatie kan variëren naargelang de antigen wordt gesondeerd) en pipetteren voorzichtig.
  3. Breng 1,5 ml plastic centrifugebuizen en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Spin op een bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en voer een wasbeurt door toevoeging van 500 pi PBS aan elke buis en voorzichtig pipetteren.
  5. Spin op een bankje microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en houden buizen op ijs gedurende minstens 15 minuten. Permeabilisering stappen 3,6-3,9 moet snel en efficiënt gebeuren, en na spinning / aspiratie bij RT, cel pellets moeten onmiddellijk worden terug gezet op het ijs, zodat de cellen beter hun integriteit behouden.
  6. Neem aceton oplossingen uit van -20 ° C vriezer en op ijs gezet. Permeabilize cellen door resuspenderen celkorrels eerst in 500 pi ijskoude 50% aceton (1:1 met dH 2 O) en pipetteren voorzichtig.
  7. Spin op de bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en resuspendeer cel pellets in 500 pi60; ijskoude 100% aceton door pipetteren voorzichtig.
  8. Spin op de bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en resuspendeer celpellets opnieuw in 500 pi ijskoude 50% aceton door pipetteren voorzichtig.
  9. Spin op bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en was cellen eenmaal in koude FACS-buffer (PBS + 0,5% BSA) door voorzichtig pipetteren.
  10. Bereid etikettering cocktail met antilichamen of markers voor de moleculen van belang: 0.1 U/100 ul AF488-phalloidin voor F-actinekleuring en 1 μl/100 pi Ter119-PECy7 voor erytroïd cel kleuring. Alternatieve of aanvullende kleuring kan ook via AF-488-anti-β-tubuline antilichaam (1:50), AF-594-geconjugeerde choleratoxine subunit B lipide rafts label (1:200), anti-pMRLC (Ser19) primair antilichaam voor het gefosforyleerde regulerende myosine lichte keten (1:50), gevolgd door anti-konijn AF-488-geconjugeerd secundair antilichaam (1:400) en anti-γ-Tubulin primaire konijn antilichaam (1:100), gevolgd door anti-konijn AF-555-geconjugeerd secundair antilichaam (1:300).
  11. Na aspiratie supernatant, resuspendeer celpellets in 100 pl van de marker cocktail, pipet zachtjes en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Bereid FACS buffer met 2,5 uM van de nucleaire vlek Draq5.
  13. Was de cellen in FACS buffer, spin down op de bank microcentrifuge 2000 xg gedurende 20 sec aspireren supernatant en resuspendeer in 60 ul FACS buffer met Draq5.
  14. Voer monsters op een grafisch flowcytometer verzamelen ten minste 10.000 gebeurtenissen per experiment compenseren ruwe data bestanden eerder gepubliceerd 13, en de resultaten geanalyseerd zoals getoond in figuur 2, met de analysesoftware specifiek voor de beeldvorming flowcytometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerst worden de cellen geanalyseerd op basis van hun Brightfield Aspect Ratio (verhouding van de lengte van de kleine tegenover de hoofdas) en de helderveld Area (indicatie van hun grootte). Evenementen met een waarde Brightfield Area lager dan 20 en hoger dan 200 zijn meestal puin en mobiele aggregaten, respectievelijk, en zijn uitgesloten van de analyse (Figuur 2A). Enkele cellen (gate "R1") zijn vervolgens geanalyseerd op basis van hun waarde voor de parameter Gradient RMS, die de scherpte ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De laatste jaren onderzoek erytroblast enucleatie heeft opgedaan toenemende momentum omdat het de stap van in vitro erytropoëse culturen die het meest moeilijk efficiënt reproduceren om succesvol grootschalige productie van rode bloedcellen ex vivo te bereiken. Tot voor kort, de studie van erythroblast enucleatie gebruikt voornamelijk fluorescentie microscopie en flowcytometrie methoden. Fluorescentiemicroscopiemethodes, zij nuttig bij het identificeren deelnemende moleculen vereisen dagen microscopisc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken de Research Doorstroomcytometrie Core in Cincinnati Children's Hospital Research Foundation en Richard Demarco, Sherree vriend, en Scott Mordechai uit de Amnis Corporation (onderdeel van EMD Milllipore) voor deskundige technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health verleent K08HL088126 en R01HL116352 (TAK) en P30 DK090971 (YZ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
αMEM mediumCellGro15-012-CV
IMDM mediumHyclone (Thermo Scientific)SH30228.01
Stempro-34 SFMGIBCO (Life Tech)10640
Stempro-34 nutrient supplementGIBCO (Life Tech)10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta Biologicals512450
BIT9500Stemcell Technologies09500
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS)Hyclone (Thermo Scientific)SH30028.02
Penicillin/StreptomycinHyclone (Thermo Scientific)SV30010
L-glutamineHyclone (Thermo Scientific)SH30590.01
Isothesia (Isoflurane)Butler-Schein029405
Histopaque 1.083 mg/mlSigma10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)BD Biosciences555899
AcetoneSigma-Aldrich534064
FormaldehydeFisher ScientificBP 531-500
HydrocortisoneSigmaH4001
Stem Cell Factor (SCF)Peprotech250-03
Interleukin-3 (IL-3)Peprotech213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)AMGENavailable by pharmacy
CD44-FITC antibodyBD Pharmingen553133
CD71-FITC antibodyBD Pharmingen553266
Ter119-PECy7 antibodyBD Pharmingen557853
Phalloidin-AF488Invitrogen (Life Technologies)A12379
β-tubulin-AF488 antibodyCell Signaling#3623
anti-rabbit AF488-secondary antibodyInvitrogen (Life Technologies)A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibodyInvitrogen (Life Technologies)A21428
AF594-cholera toxin B subunitInvitrogen (Life Technologies)C34777
pMRLC (Ser19) antibodyCell Signaling#3671
γ-tubulin antibodySigmaT-3559
Syto16Invitrogen (Life Technologies)S7578
Draq5BiostatusDR50200
Ferrous sulfateSigmaF7002
Ferric nitrateSigmaF3002
EDTAFisher ScientificBP120500
15-ml tubesBD Falcon352099
50-ml tubesBD Falcon352098
6-well platesBD Falcon353046
24-well platesBD Falcon351147
Flow tubesBD Falcon352008
Tuberculin syringeBD309602
Insulin syringeBD329461
Syringe needle 25-G 5/8BD305122
Capped flow tubesBD352058
40-μm cell strainerBD Falcon352340
Scalpel (disposable)Feather2975#21
FACS Canto Flow CytometerBD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow CytometerAMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell CounterDrew ScientificCDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ IncubatorThermo scientific
Allegra X-15R CentrifugeBeckman Coulter392932
Mini Mouse Bench centrifugeDenvilleC0801

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Erytroblasten enucleatieaspectratio analysedelta centroidmetingorthochrome erytroblastenTer119 kleuringDraq5 DNA kleuringin vitro erythropo sefixatie en permeabilisatie van cellen

Gerelateerde artikelen