Ultra-hoge frequentie echografie is een krachtige live-imaging tool om cardiale afwijkingen in kleine proefdieren. Zijn noninvasiveness maakt het handhaven van de fysiologische toestand van de embryo's. Hierin tonen we het gebruik van M-mode echo om de hartslag van embryo meten E18.5 in de baarmoeder.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In utero Meting van de hartslag in de Muis door invasieve M-mode echocardiografie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aangeboren hartziekte (CHZ) is de meest voorkomende niet-infectieuze oorzaak van overlijden bij de geboorte. De incidentie van CHD varieert van 4 tot 50/1, 000 geboorten (Ziekte en verwondingen regionale schattingen, World Health Organization, 2004). Operaties die vaak afbreuk doen aan de kwaliteit van het leven nodig zijn om hartafwijkingen corrigeren, herinnert ons aan het belang van het vinden van de oorzaken van hart-en vaatziekten. Mutant muismodellen en live imaging technologie zijn geworden essentiële instrumenten om de etiologie van deze ziekte te bestuderen. Hoewel geavanceerde methoden is het mogelijk live-beeldvorming van abnormale harten in embryo's, worden de fysiologische en hemodynamische toestanden van de laatste vaak aangetast als gevolg van chirurgische en / of langdurige procedures. Invasieve echografie, kan echter zonder chirurgisch bloot het embryo, waardoor hun fysiologie handhaven gebruikt. Hierin maken we gebruik van eenvoudige M-mode echo om hartslag van embryo's beoordelen op E18.5 in de baarmoeder. De detectie van abnormale hartslag is inderdaad een goede indicator van dysfunctie van het hart en vormt dus een eerste stap in het identificeren van defecten in de ontwikkeling die kan leiden tot hartfalen.
Inleiding
CHD is de meest voorkomende niet-infectieuze oorzaak van overlijden bij de geboorte 1. Meerdere operaties zijn vaak nodig om de structurele gebreken bij patiënten van wie de kwaliteit van leven kan gecompromitteerd 1 blijven corrigeren. Kinderen met CHD ontwikkelen vaak neurologische aandoeningen, zelfs als ze niet een operatie hebben ondergaan, met vermelding van belang in de baarmoeder gevolgen voor ontwikkeling 2,3. Zowel genetische als omgevingsfactoren, zoals blootstelling aan virussen of chemische stoffen (alcohol) tijdens de zwangerschap, oorzaak CHD. Het bestuderen van de genetische medewerkers zich nog in een vroeg stadium, maar groeit snel. Om deze medewerkers te identificeren en begrijpen van hun rol in de ontwikkeling van het hart, fenotyperen mutante muizen met een eenvoudig en krachtig hulpmiddel zal zijn zeer gunstig.
Mouse is inderdaad een diermodel keuze CHD bestuderen, en de meeste menselijke gevallen kan worden gereproduceerd bij muizen 4,5. Bijgevolg heeft foetale cardiale fenotypering inc gewordenreasingly belangrijk om de etiologie van menselijke CHD onderzoeken en vereist passende instrumenten. Hoewel histologische studies op vaste exemplaren zijn van onschatbare waarde, real-time beeldvorming van levende dieren is cruciaal voor de fysiologie van het hart te begrijpen. Videomicroscopie biedt live beeldvorming. Het vereist echter laparotomie om embryo bloot, waardoor hun fysiologische en hemodynamische toestand compromitteren. Onlangs is echocardiografie de standaard geworden beeldvormende techniek om cardiale evaluaties in de kliniek en in muizen.
Muis foetale echocardiografie wordt uitgevoerd onder normale klinische ultrasound systemen en ultra-hoge frequentie ultrasone systemen. Deze bieden 30 MHz of hogere frequentie transducers dat twee-dimensionale beelden te genereren en kan de evaluatie van vroege embryonale stadia. Deze sensoren hebben een betrekkelijk slechte penetratiediepte (~ 13 mm), die echter voldoende om voldoende beeldvlakken verkrijgen en bepalen fundamentele hart paparameters, zoals hartslag, linker en rechter ventrikel inwendige diameter bij diastole en systole en septum en de wanddikte, zonder het uitvoeren van laparotomie.
In ons onderzoek hebben we een ultra-hoge frequentie ultrasoon systeem om hartslag van muizenembryo's beoordelen op embryonale dag E18.5 gebruikt. We kozen voor een 30 MHz transducer die een gezichtsveld van 20 mm x 20 mm, wat ideaal is gezien de omvang van de foetussen, met een brandpuntsafstand van 12,7 mm biedt. Echter, een hogere frequentie omzetter worden gekozen eerdere ontwikkelingsstadia analyseren. De geselecteerde M-modus kan de visualisatie van weefsels in beweging dankzij een hoge temporele resolutie van 1000 frames / sec. De volledige procedure is eenvoudig en zou zo snel mogelijk worden uitgevoerd om elke verstoring van de fysiologische en hemodynamische toestanden van de foetus te voorkomen. De analyse van ongeveer 8 embryo vereist ongeveer 1 uur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle in dit protocol procedures zijn goedgekeurd door de IRCM Animal Care Comite.
1. Ultrasound System en Station Voorbereiding
- Start het ultrasone beeldvormingssysteem en sluit de aftastkop en de fysiologie controller eenheid volgens aanwijzingen van de fabrikant (figuur 1). Kies Cardiale meetprogramma en de aftastkop die overeenkomt met de 30 MHz transducer.
- Vul het neusstuk van de aftastkop met gedemineraliseerd water. Vermijd luchtbellen als ze interfereren met beeldvorming resolutie. Plaats de scankop met het handvat naar boven aan de houder ervan in de buurt van de imaging platform (Figuur 1A).
- Ontsmet de imaging platform en werkgebied.
- Invullen van de fles van ultrageluid gel om de vorming van luchtbellen te vermijden en leg hem ondersteboven in haar voorverwar container ingesteld op 37 ° C (Figuur 1B).
- Controleer de niveaus van oxygen en isofluraan en de slang systeem voor anesthesie. Een experiment met ~ 8 embryo's zou ongeveer 15-20 L zuurstof te gebruiken.
- Plaats de flessen oogheelkundige balsem, ontharingscrème en elektrode-gel in de buurt van de imaging platform (Figuur 1B).
- Controleer dat de infrarood warmte lamp functies. Tijdens de training set warmte niveau de positie van de lamp en de afstand van de lamp muizen om constante lichaamstemperatuur en hartslag handhaven.
Opmerking: Een goede voorbereiding van het systeem en materiaal kritisch. Langdurige procedures kunnen invloed hebben op de fysiologische en hemodynamische kenmerken van foetussen zolang anesthesie deprimeert hartfunctie door een verlaging van de hartslag, bloeddruk en bloed-oxygenatie niveau. De doorlooptijd voor ~ 8 foetussen (gemiddelde worpgrootte in C57BL / 6) een ongeveer 1 uur zijn. Andere muizenstammen kunnen een hoger aantal foetussen, eventueel voor grotere vrouwelijke formaat. Training is essentieel om de processi optimaliserenng tijd.
2. Muis Voorbereiding
- Verdoven de zwangere vrouw in een kamer met continue aanvoer van 2% isofluraan in zuurstof (200 ml / min) tot het reageert niet wordt.
- Plaats de muis op de imaging platform in liggende positie, passen de slangen voor continue inademing van 1,5% isofluraan in zuurstof (200 ml / min), en bevestig de inhalatie buis met tape (Figuur 2A). Voldoende verdoving moet tijdens de procedure worden bevestigd door de ontspannen houding van de muis en het ontbreken van enige reactie op de staart en teen wringt.
- Plaats elektrode gel alleen aan de linker boven-en rechter onderkant elektroden (rechter voorbeen en linker achterbeen, ook wel lead II positie) voor elektrocardiografie. Lead II opstelplaats beter gedefinieerd rechtop positieve P-top en QRS complex om de hartslag te bepalen. Bevestig de vier poten aan elke pad met tape (Figuur 2A). Om droogheid van de ogen te voorkomen, toepassen 1 druppeloogheelkundige balsem in elk oog.
- Scheer de buik van borst tot blaas met een tondeuse. Dan gelden ontharingscrème voor 2 min en veeg het af met gaas en / of wattenstaafje om alle resterende haren voorzichtig verwijderen. Wees voorzichtig dat u de tepels te snijden.
- Plaats de thermometer gesmeerd met elektrode-gel in het rectum van het vrouwtje om de lichaamstemperatuur te controleren (moet bij 37 ± 0,5 ° C worden gehandhaafd door het aanpassen van een infrarood warmtelamp boven het platform geplaatst). De hartslag moet 450 ± 50 slagen / min (bpm) zijn. Zowel temperatuur en hartslag worden op de fysiologie controller unit (Figuur 1B).
Opmerking: Lange verdoving, haaruitval en ultrasone gel (hoewel voorverwarmde) kan leiden tot onderkoeling, die de hartslag beïnvloeden van het vrouwtje. Indien de lichaamstemperatuur beneden 36,5 ° C, stop de procedure en de positie van de warmtelamp om de temperatuur en hartslag passen passen. Wacht een paar minuten beferts weer verder gaat.
3. Embryo Identificatie
- Druk licht op de blote buik om de embryo's te lokaliseren. Langzaam en licht verspreid ze de meeste embryo's in een laag onder het buikoppervlak. In elke uterushoorn, zijn zakken lineair met elkaar verbonden. Probeer om deze volgorde te respecteren bij het uitrijden.
- Mark elk embryo over de blote buik van de vrouw met een permanent marker met hun voorste / achterste en dorsale / ventrale richtingen. Het kennen van de oriëntatie vergemakkelijkt het lokaliseren van het hart met de sonde. Nummer de embryo's in de rechter en linker hoorns vanuit de cervix (1, 2, 3 ... en 1 ', 2', 3 '... respectievelijk Figuur 2B).
Opmerking: (i) Vermijd het verspreiden van de embryo's met grote kracht. Schetsen hun locaties op een stuk papier om ze op te sporen (figuur 2C). (Ii) C57BL / 6 vrouwtjes hebben ~ 8 foetussen per worp. Echter, 0-2 embryo's in elk nest zijn located onder de anderen, het maken van hun beeldvorming onmogelijk. Uitsluiten deze embryo's uit de analyse en meer nesten te beoordelen als dat nodig is.
4. HARTSLAGMETING
- Plaats een kleine hoeveelheid voorverwarmd ultrasone gel op het blote buik en verdeel het gelijkmatig. Vermijd schuimvorming. Voeg een grotere hoeveelheid gel (~ 5 ml) van het specifieke gebied om de afbeelding.
- Houd de sonde in contact met het dikke gellaag (10 mm) en geleidelijk de sonde naar de huid terwijl het kloppende hart. Zodra het kloppend hart wordt gevisualiseerd op het scherm, stel de hoek van de sonde aan beide ventrikels hebben in hun grootste maat in het beeldvlak (figuur 2D).
- Begin verwerven afbeelding. Met de onderarm rust op het station, plaats de transducer op de echo gel om een live-beeld te verkrijgen op het beeldscherm (figuur 2D). Handhaving van de nok van de transducer op de bovenkant en op de scankop geaardheidn marker (in de linker bovenhoek van de afbeelding) kan de coördinatie van de handbeweging en omgeving gevisualiseerd op het scherm.
- Vanaf de baarmoederhals naar de dichtstbijzijnde embryo aangegeven (1 of 1 'in rechter of linker uterushoorn, respectievelijk) het kloppend hart zichtbaar op het scherm. Omdat scherptediepte is vast, beweeg de sonde omhoog / omlaag en zijwaarts zonder verlies van contact met gel om het gewenste beeldvlak te verkrijgen.
- Plaats het kloppend hart in het midden van het scherm binnen de regio aangegeven door de gele gestreepte lijn die de focale zone voor een betere data-acquisitie.
- Het verwerven van de live-opname. Verkrijgen imago van de verkenner en opnemen (figuur 3A) te hervatten. Zodra een minimum van 10 seconden van stabiele opname wordt verkregen, stoppen met opnemen en opslaan.
- Ga verder naar de volgende embryo.
- Zodra alle embryo's worden geanalyseerd, drukt u op "Bladeren" op het toetsenbord om de lijst van de opnamen te bekijken. Speel elk opgenomen M-modus Tracing en meerdere metingen (minimaal 5 per tracing) van de afstand tussen naburige pieken (tijd / circulatiecyclus) uitvoeren om de gemiddelde hartslag (figuur 3B) te verkrijgen.
Opmerking: Sommige protocollen suggereren met behulp van een stationaire stand voor de scankop te vermijden schudden. Toch weerhoudt de hoek van de analyse, waardoor de waarneming van laterale embryo moeilijk. Het vertraagt ook de analyse als de stand moet worden aangepast voor elke embryo. Houd de scankop terwijl de afwikkeling van de onderarm op het station efficiënt minimaliseert schudden. Trainen met 5-10 drachtige vrouwtjes wordt aanbevolen om het resultaat te optimaliseren.
5. Genotypering
- Met schone chirurgische schaar en forceps, incisie lengterichting huid en spierlaag van de buik. Zoek de zakken in elke baarmoeder hoorn en overeenkomen met de nummers. Opengesneden de dooierzak naar het embryo in de volgorde bovenstaande gebruikte bloot. Indien niet in een lineaire opstelling, de schets van het embryo posities op een stukpapier zal essentieel zijn als de markeringen op de huid niet meer zichtbaar.
- Snijd alleen ~ 4 mm van de staart voor genotypering als genomische DNA wordt heel efficiënt gewonnen uit embryonale staarten.
Opmerking: (i) De chirurgische procedure moet worden uitgevoerd op een andere locatie dan de beeldvormende kamer. Het is echter belangrijk om niet om de muis te bewegen en de chirurgische ingreep op de imaging platform om bij te houden van de genummerde embryo. Raadpleeg het dier facility manager aan de chirurgische procedure te optimaliseren. (Ii) De zwangere vrouw snel overlijdt door bloedverlies als de foetussen worden verwijderd voor genotypering na beeldvorming. Na staart knippen, worden de foetussen geplaatst 3 min op ijs voor anesthesie door onderkoeling en vervolgens onthoofd met een schaar, zoals aanbevolen door onze Animal Care Comite.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De bovenstaande methode werd gebruikt om het effect van de aanwezigheid of afwezigheid van de serine protease furine endotheelcellen hartslag van muizenembryo's op E18.5 in utero beoordelen. Furine behoort tot de familie van proproteïne convertases (PC's) die aanhangen eiwitvoorlopers na basische residuen. Furine en zijn substraten zijn secretoire eiwitten en splitsing kan in het Golgi-apparaat, endosomen of op het celoppervlak. Belangrijke furine substraten omvatten TGFb en TGFb-achtige factoren, zoals...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
M-mode echocardiografie is een effectieve en eenvoudige methode om te meten in utero hartslag van muizenembryo's. Commercieel beschikbare transducers voldoende resolutie om kleine kloppende harten te visualiseren. Dus ze laten een zeer nauwkeurige hartslagmeting, vergeleken met andere methoden, zoals hartslag meting en kan hoge resolutie video microscopie vervangen. Echter, de huidige instrumenten niet toe dat de gelijktijdige analyse van alle embryo's, wat een vervelende procedure elk van de embryo'...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflict verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken Manon Laprise voor opleiding in echocardiografie en Ann Chamberland voor het nemen van de in de figuren 1 en 2 foto's. Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research subsidie MOP 44.363 en Canada Stoel 950-216684.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Isofluraan | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-chloor-2,2,2-trifluorethyl difluormethyl ether |
| Echografiegel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| Elektrodegel | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| Oftalmisch gel | Novartis | Tear-Gel | |
| Ontharingscrème | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| Haarknipmachine | |||
| Gaas/katoenen doek | Q-tips | ||
| Permanente stift | |||
| Hoge Resolutie In vivo Ultrasoon Beeldvormingssysteem | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz Transducer | Visual Sonics | RMV707B | |
| Beeldvormingsplatform en fysiologie controller unit | Visual Sonics | ||
| Anesthesiesysteem | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| Infrarood verwarmingslamp |
Referenties
- Hoffman, J. I., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).
- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and. 15, 165-176 (2003).
- Yu, Q., et al. ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies. Development. 131, 6211-6223 (2004).
- Seidah, N. G., Prat, A. The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver. J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).
- Kisanuki, Y. Y., et al. Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo. Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).
- Kim, W., et al. Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death. Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
