Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

Summary

Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.

Abstract

Collageen inhoud en organisatie bij de ontwikkeling van collagene weefsels kan worden beïnvloed door lokale weefsel stammen en weefsel beperking. Weefselingenieurs doel om deze principes te gebruiken om weefsels te creëren met voorgedefinieerde collageen architecturen. Een volledig begrip van het exacte onderliggende processen van collageen remodelleren de definitieve weefselarchitectuur controle echter ontbreekt. In het bijzonder weinig bekend over de (her) oriëntatie van de collageenvezels in reactie op veranderingen in weefsel mechanische belastingscondities. We ontwikkelden een in vitro modelsysteem bestaande uit biaxiaal constrained myofibroblast-gezaaide constructen fibrine, collageen verder te ontrafelen (her) oriëntatie in reactie op i) terugkeer naar biaxiale eenassige statische belastingsomstandigheden en ii) uniaxiale cyclische belasting van de biaxiaal beperkt constructen voor en na een verandering in belastingsrichting, met gebruik van de Flexcell FX4000T laadinrichting. Time-lapse confocale beeldvorming wordt gebruikt om visualize collageen (her) oriëntatie op een niet-destructieve manier.

Cel en collageen organisatie in de constructen kunnen worden gevisualiseerd in real-time, en een interne referentie systeem stelt ons in staat om te verhuizen cellen en collageen structuren voor time-lapse-analyse. Verschillende aspecten van het model systeem kan worden aangepast, zoals mobiele bron of het gebruik van gezonde en zieke cellen. Additieven kunnen worden gebruikt om verder te verhelderen mechanismen onderliggende collageen remodelleren, bijvoorbeeld door toevoegen van MMPs of blokkering integrinen. Vorm en grootte van de construct kan gemakkelijk worden aangepast aan de specifieke behoeften, wat resulteert in een zeer regelbaar modelsysteem cel en collageen (re) organisatie bestuderen.

Introduction

Cardiovasculaire weefsels hebben een prominente dragende functie. In het bijzonder de inhoud en organisatie van collageenvezels in de extracellulaire matrix bijdragen aan de dragende eigenschappen en domineren algehele weefsel sterkte ^1. In tissue engineering mechanische conditionering van het construct wordt gebruikt - meestal bestaande uit (cyclische) uitpersen regimes - om weefsel organisatie en mechanische eigenschappen ^2,3 versterken. Volledig begrip van stam-geïnduceerde collageen organisatie in complex weefsel geometrieën weefsels voorgedefinieerde collageen architectuur maakt is nog niet bereikt. Dit is voornamelijk te wijten aan onze beperkte kennis van collageen remodeling in het ontwikkelen van weefsels. Bestaande modellen geven vooral informatie over de uiteindelijke netto resultaat van collageen remodeling met gebruik van statische belasting ^4-6. Hier bieden we een zeer afstembare modelsysteem dat de studie van collageen (re) organisatie maakt in een real-time mode, in 3D, onder invloedvan statische of cyclische belasting. Het weefsel constructen fibrine-based, zodat alle collageen in het construct is endogeen. Cel en collageen organisatie in de constructies wordt gevisualiseerd, en een interne referentie systeem stelt ons in staat om te verhuizen cellen en collageen structuren voor time-lapse-analyse. In dit protocol wordt het gebruik van het model voor Human Vena saphena Cells (HVSCs) beschrijven, aangezien deze cellen staan ​​bekend om hun toegenomen extracellulaire matrix productie en de mogelijkheid om de matrix en ons langdurig gebruik in cardiovasculaire weefsels gemanipuleerde ⁷ verbouwen, gebaseerd over het werk van de Jonge et al.. ⁸

Protocol

1. Cultuur van de mens Vena saphena Cellen

1. Isoleer cellen van de vena saphena magna, verkregen van een donor in overeenstemming met richtlijnen voor het secundair gebruik materiaal, volgens het protocol van Schnell et al.. ⁹ en bewaar deze in vloeibare stikstof. Uit het gedeelte van de vena saphena magna ve donor gesneden stukken van 2 x 2 mm tot cultuur in een zes-well plaat. Gebruik 2 stuks per putje. Algemeen genoeg cellen kan worden verkregen tot ongeveer 3 flesjes vullen met 0,25 x 10 ⁶ cellen in vloeibare stikstof. HVSCs worden gekarakteriseerd als myofibroblasten, door het tonen van expressie van vimentine, geen expressie van desmine en een subpopulatie uiten α gladdespieractine ^10. Volgende beginnen het protocol bij de cellen van de vloeibare stikstof ontdooien het aantal cellen te verhogen.
2. Plaats de cellen van een flacon in een T75 weefselkweek kolf en voeg groeimedium (GM), bestaande uit geavanceerde DMEM, 50 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml penicilline /streptomycine en 5 ml L-glutamax. Wijzig medium om de 2-3 dagen.
3. Cellen groeien samenvloeiing na ongeveer 14 dagen. WINKEL 0,5 x 10 ⁶ cellen in een flacon in vloeibare stikstof, genoemd passage 1.

Opmerking: Bevriezing van de cellen is niet nodig bij het ​​oogsten HVSCs, maar wordt uitsluitend gebruikt voor opslag.

4. Plaats de HVSCs uit een flacon in een T175 weefselkweek kolf en voeg GM. Wijzig medium om de 2-3 dagen. Cellen groeien samenvloeiing na circa 7 dagen. WINKEL 3 x 10 ⁶ cellen in een flacon in vloeibare stikstof, genoemd passage 2.
5. Plaats de cellen van een flacon in een rollerbottle en voeg GM. Wijzig medium om de 2-3 dagen. Cellen groeien samenvloeiing na ongeveer 8 dagen. Een rollerbottle bevat ongeveer 20-30 x 10 ⁶ cellen. Kweekcellen tot passage 6. Gebruik geen cellen van een passage hoger dan doorgang 9, aangezien cel fenotype kunnen veranderen.

2. Engineering van fibrine-based Tissue constructen

1. Bereid siliconenlijm door mengen van het elastomeer met het hardingsmiddel (10:01). Snij 7 x 3 mm rechthoekige segmenten van klittenband. Lijm de klittenband in een 6 putjes, met flexibele membranen aan een kruis te vormen, en een vierkante ruimte van 3 mm tussen de klittenband te verlaten.

Opmerkingen: Gebruik alleen de zachte kant van het klittenband en het gezicht van deze kant naar boven. Bij het verlijmen van het klittenband, alleen betrekking hebben op het klittenband met siliconen lijm, verspreiden zich niet lijmen hele goed. Aangezien de cultuur platen rolmembraan bodems, gebruik iets onder de wells plaat voor het versterken van de flexibele membranen, gemakkelijk lijmen waarborgen op de plaat.

2. Droog de siliconenlijm overnacht in een oven op 60 ° C tot verharding van de lijm te garanderen. Steriliseren door toevoeging van 70% EtOH aan de putjes en incubeer gedurende 30 minuten. Spoel 3x met PBS en verwijder alle PBS uit de wells en de klittenband. Gezet onder UV gedurende 30 minuten en houd steriel tot gebruik.
3. Bereid Tissue Engineering medium (TM), dat bestaat uit GM en 130 mg L-ascorbinezuur 2-fosfaat.
4. Voeg 1 mg / ml ε-aminocapronzuur (ACA) aan de TM. ACA wordt gebruikt voor de eerste 7 dagen van cultuur aan de fibrine voorkomen afbrekende ^11. Alternatief aprotinine worden gebruikt.
5. Om de vorming klonteren te voorkomen, laat fibrinogeen op kamertemperatuur komen alvorens te openen. Zonder klonten fibrinogeen zal gemakkelijker oplossen. Los fibrinogeen tot een concentratie van 10 mg werkelijke eiwit / ml TM ⁷ aangevuld met ACA. Steriel filter de fibrinogeenoplossing, meerdere filters nodig kunnen zijn. Slaan op ijs tot gebruik.

Opmerking: Om fibrinogeen mix ontbinden zachtjes te veel schuimvorming te voorkomen.

6. Los trombine tot een concentratie van 10 IU / ml TM ⁷ aangevuld met ACA. Slaan op ijs tot gebruik.

Opmerking: Opslag op ijs is nodig om vroege gelering van trombine en fibrinogeen voorkomen.

7. Trypsinize de cellen opnieuw in suspensie in GM en tellen.
8. Gebruik 15 x 10 ⁶ cellen / ml voor het zaaien van de fibrine-based weefselconstructen (concentratie op basis van methoden voor tissue engineering hartkleppen ^7). Een gel bestaat uit 100 ul gof el en dus van 1,5 x 10 ⁶ cellen. Doe 1,5 x 10 ⁶ cellen in een centrifugebuis, waardoor zoveel centrifugebuizen als het aantal gels die worden gemaakt.
9. Centrifugeer de cellen bij 350 xg gedurende 7 min en gooi het supernatant. Resuspendeer de cellen in 50 ul trombine. Voeg 4 ul van blauwe fluorescerende polystyreen microsferen om deze schorsing. Plaats 50 gl van fibrinogeen in een flesje. Gebruik een pipet tot het nemen van de 50 ul trombine met cellen. Het volume van de pipet 100 ul. Pipetteer de 50 ul oplossing van trombinecellen in de flacon met fibrinogeen aan de trombine en fibrinogeen mixen, en het nemen van de 100 pi mengsel.

Opmerking: De fluorescerende polystyreen microsferen worden gebruikt als interne referentie markers voor beeldanalyse. Bij het mengen van trombine en fibrinogeen, de vorming van luchtbellen door voorzichtig pipetteren het mengsel. Luchtbellen zullen resulteren in gaten in de fibrine gel.

10. Pipetteer de gel-mengsel in en tussen de klittenband. De typische geltijd voor fibrine gels, wanneer de componenten worden gemengd, in de orde van 20 sec.

Opmerkingen: Doe dit zo spoedig mogelijk gelering te voorkomen voordat het mengsel wordt gepipetteerd in de putjes. Oefenen alvorens cellen en kralen.

11. Incubeer suspensies gedurende 30 min bij 37 ° C in een bevochtigde 95% lucht / 5% _CO2 incubator gelering mogelijk voor het toevoegen cultuur TM met ACA.
12. Vervang TM met ACA om de 2-3 dagen voor de eerste 7 dagen. Gels zijn stabiel genoeg na een week worden gekweekt zonder ACA. Na de eerste week vervangen TM om de 2-3 dagen. Voeg 6 ml TM per putje. Op dag 12 cellen genoeg collageen voor visualisatie geproduceerd.

3. Het toepassen Strain en Inducerende Veranderingen in Strain en Constraints

1. Statische belasting wordt door de cellen direct, vanwege cel tractie en verdichting ¹² toegepast. Om collageen reorganisatie induceren, snijd de weefselconstruct los van twee klittenband in een richting. Dit resulteert in een richting beperkingen (Figuur 1A). Voer deze op dag 12, aangezien het construct wordt vervolgens stabiel genoeg en collageen is gedeponeerd.
2. Toepassen cyclische belasting door een vacuüm aan de onderkant van de kweekplaten met flexibele membranen met behulp van de Flexcell FX4000T systeem. Plaats de platen op een basisplaat, bovenop loading posten (die een deel van ee cyclische belasting-apparaat). De pomp voert een vacuüm op het membraan en daardoor trekt het membraan via rechthoekige paal dat eronder ligt. Door de kruisvormige bevestigingen van het weefsel construeert het membraan (via de klittenband) en rechthoekige paal de toegepaste cyclische stam uniaxiale (Figuur 1B).
3. In eerste instantie gebruik maken van statische cultuur gedurende 5 dagen om de eerste mechanische integriteit te bereiken, vóór toepassing van cyclische belasting beginnend op dag 6. Programma een cyclische vlek protocol in de controller voor de vacuümpomp. Bijvoorbeeld gebruik maken van een vooraf vastgestelde tussenpozen cyclisch stam protocol, met eenassige richting ^13. Dit betekent dat een pulserend stam van een sinusgolf met 1 Hz, persen 0-5% rek voor een periode van 3 uur, afgewisseld met rustperiodes 3 uur. Voer deze cyclische stam protocol voor 7 dagen, het induceren van een uitgelijnde collageen organisatie.
4. Meestal na 12 dagen HVSCs een uitgelijnde collageen organizatio hebben geproduceerdn. Na een uitgelijnde collageen organisatie bereikt, verandert de uniaxiale cyclische spanning richting, loodrecht op de oorspronkelijke stam richting. Doe dit door de rechthoekige berichten van 90 °.

4. Visualiseren cellen en collageen

1. Om actieve, real-time collageen remodeling, label monsters visualiseren met sondes die niet interfereren met de levensvatbaarheid van de cellen of de vorming van collageen. Gebruik sondes om fluorescent vlekken op de cel cytoplasma en collageen.
2. Alternatief tweede harmonische generatie met behulp van confocale laser scanning microscopie kan worden gebruikt om collageen structuren met behulp autofluorescence ^14, met excitatie bij 780 nm en opsporing tussen 500-550 nm visualiseren.
3. Verwijder de cultuur platen uit de installatie en de incubator, voor de conjunctuur gespannen monsters tijdens de 3 uur rusttijd, en te transporteren naar een confocale laser scanning microscoop naar de cellen en collageen te visualiseren.

Results

Dit model systeem maakt het mogelijk voor het kweken myofibroblastachtige gezaaide fibrinegelen. Figuur 1A toont een tissue eerst gekweekt onder statische biaxial beperkingen. Weefselbegrenzingen zijn vrijgegeven door het snijden van de fibrinegel uit twee beperkingen, om eenassige statische randvoorwaarden creëren, en het weefsel compacts en renovaties achteraf (figuur 1A). Voor cyclische belasting, wordt het weefsel gekweekt onder statische biaxial beperkingen ook. Na 5 dagen cyclisch...

Discussion

Het beschreven modelsysteem cel-bevolkte fibrine constructen grote mogelijkheden voor de studie van de cel en collageen (her) inrichting (de Jonge et al.. ^15), bijvoorbeeld te gebruiken voor weefselregeneratie doeleinden. Door het gebruik van fibrine als de oorspronkelijke cel vervoerder, na fibrine degradatie, wordt een weefsel gemaakt met cellen en slechts endogene matrix. Op deze wijze worden cellen gestimuleerd om te reageren op spanning, statisch of cyclisch van aard, door toepassing co...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Omvat kweekkolven en pipetten
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetaal bovien serum	Greiner	758075
Penicilline/streptomycine	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomeer en uithardingsmiddel	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regelmatige winkel		Je kunt dit kopen in een reguliere winkel, gebruik alleen de zachte kant
Bioflex kweekplaten	Flexcell Int	BF-3001U	Onbehandeld
L-Ascorbinezuur 2-fosfatase	Sigma	A8960
ε-Aminocapronzuur	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine trombine	Sigma	T4648
Bovine fibrinogeen	Sigma	F8630
0,45 spuitfilter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyreen microsferen	Invitrogen	F-8829	Blauw fluorescerend, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Omvat rechthoekige laadposten
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Vriendelijk ter beschikking gesteld door het Laboratorium voor Macromoleculaire en Organische Chemie, Afdeling Biomedische Technologie, Technische Universiteit Eindhoven
Confocale laserscanningmicroscoop	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laserscanningmicroscoop en Two-Photon-LSM modus
Amfotericine	Gibco	15290-018	Nodig voor celisolatie