Methodenartikel

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

DOI:

10.3791/51018

⸱

13 december 2013

 ,  ,  , 
1Ophthalmology, Weill Medical College of Cornell University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Werken met delicaat weefsel kan een bemoeilijkende factor zijn bij het uitvoeren van immunohistochemische beoordeling. Hier presenteren we een methode die een ring-ondersteunde hydrofiliseerde PTFE-membraan gebruikt om structurele ondersteuning te bieden aan zowel levend als gefixeerd weefsel tijdens immunohistochemische verwerking, wat het gebruik van een verscheidenheid aan protocollen mogelijk maakt die anders schade aan het weefsel zouden veroorzaken. Eerst wordt dit gedemonstreerd met bolus-belasting van fluorescerende markers in levend retinaweefsel. Deze methode maakt snelle visualisatie van doelgerichte structuren mogelijk, terwijl de membraanondersteuning de weefselintegriteit tijdens de injectie behoudt en eenvoudige overdracht van de voorbereiding voor verdere beeldvorming of verwerking mogelijk maakt.

Ten tweede wordt een procedure voor antilichaamkleuring in weefsel gefixeerd met carbo-di-imide beschreven. Hoewel paraformaldehyde-fixatie gebruikelijker is, biedt carbo-di-imide-fixatie een superieur substraat voor de visualisatie van synaptische eiwitten. Een beperking van carbo-di-imide is dat het resulterende gefixeerde weefsel relatief kwetsbaar is; dit wordt echter overwonnen met het gebruik van de ondersteunende membraan. Retinaweefsel wordt gebruikt om deze technieken te demonstreren, maar ze kunnen worden toegepast op elk kwetsbaar weefsel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het uitvoeren van immunohistochemie in delicate intacte weefsels brengt het risico met zich mee dat er schade ontstaat tijdens het hanteren en overbrengen. Dit kan optreden in hersenslices of ander dun weefsel, zoals gedegenereerde retina. Bovendien zijn er bepaalde methoden voor weefselfixatie die voordelig kunnen zijn voor immunokleuring van neuronale structuren, maar die resulteren in een verminderde structurele stabiliteit, waardoor hun gebruik wordt uitgesloten. Een specifiek voorbeeld hiervan is carbodiimide-gebaseerde fixatie, die superieur is voor het kleuren van receptoren en hormonen1-7, maar meestal wordt vermeden vanwege de instabiliteit van het gefixeerde weefsel.

Hier beschrijven we een procedure die een gehydrofiliseerde PTFE-membraan gebruikt om delicaat weefsel, vast of onbehandeld, structureel te ondersteunen voor een verscheidenheid aan kleuringstechnieken. Het ondersteunende membraan maakt het mogelijk om delicaat weefsel te manipuleren voor en na fixatie, wat verschillende verwerkingsstappen mogelijk maakt met minimale risico's op weefselschade. Al met al biedt deze eenvoudige methode om de weefselintegriteit te behouden de mogelijkheid om technieken te gebruiken die anders zouden kunnen worden vermeden. Als zodanig zou deze aanpak ook met succes kunnen worden gebruikt voor de voorbereiding van een breed scala aan weefsels, zoals hersenslices die broos worden na slijpprocedures.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij alle experimentele procedures werden dieren behandeld volgens de voorschriften in de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visuel onderzoek en in overeenstemming met protocollen goedgekeurd door Weill Cornell Medical College. Dieren werden geëuthanaseerd door koolstofdioxide en vervolgens cervicale dislocatie.

1. Dissectie van de gehele netvliesmontage

  1. Nadat de muis is geëuthanaseerd, enucleer zijn ogen en plaats ze in geoxideerde HEPES-gebufferde Ringer's oplossing (Tabel 1).
  2. Verwijder de hoornhuid door in een cirkelvormige baan langs de ora serrata te snijden met kleine schaar, waarbij het oog met pincetten bij de limbus wordt vastgehouden. Trek de lens eruit met pincetten.
  3. Verwijder zoveel mogelijk glasvocht met stompe pincetten. Deze stap is belangrijk voor bolusinjecties en elektrofysiologische opnames; het is niet nodig bij het uitvoeren van alleen immunohistochemie.
  4. Los het netvlies van de oogcup los door pincetten tussen het netvlies en de oogcup te plaatsen, waarbij de pincetten langzaam rond de omtrek worden bewogen. Stabiliseer de oogcup door de sclera stevig vast te houden met een tweede set pincetten. Snijd de oogzenuw op de locatie tussen het netvlies en de oogcup om de scheiding van het netvlies van de oogcup te vergemakkelijken.
  5. Het netvlies kan in stukken worden gesneden (bijv. kwartjes) of als geheel worden gebruikt. Om in stukken te snijden, gebruikt u een schaar om incisies te maken vanaf de rand van het netvlies tot aan de oogzenuw. Als u het hele netvlies wilt gebruiken, maakt u incisies vanaf de rand tot halverwege de oogzenuw. De incisies helpen om een platte voorbereiding te maken.

2. Monteren op gehydrofiliseerde PTFE-membraaninzet

  1. Bereid het membraan voor zoals hieronder beschreven. Wanneer fysiologische opnames of kleurstofinjectie-experimenten worden uitgevoerd, verkort de houder door een draaibank of handzaag te gebruiken, zodat de resterende ring een hoogte van 1 mm heeft.
    Opmerking: De kweekplaatinzet kan ongewijzigd of gewijzigd zijn (Figuur 1A). De keuze van de configuratie wordt bepaald door het doel van het experiment. Voor immunokleuring is een ongewijzigde inzet geschikt.
  2. Polijst ruwe oppervlakken met fijne (300 grit of hoger) schuurpapier.
  3. (Optioneel) Verwijder de voetjes onder de ring met schaar.
  4. Om eventueel vuil te verwijderen, spoel of soniceer het membraan 2-3 min. in gedestilleerd water.
  5. Monteer het weefsel op het membraan (Figuur 1A). Plaats het weefsel met wat oplossing op de bovenkant van het membraan met een plastic overdrachtspijpje. Snijd indien nodig de smalle punt van het pijpje af, om te voorkomen dat het weefselmonster aan het pijpje blijft plakken tijdens het overbrengen.
  6. Bevestig het netvlies met ganglioncellen (GC's) omhoog: op het membraan, verwijder geleidelijk oplossing terwijl het netvlies wordt verspreid en de plooien met pincetten worden ontvouwen.
  7. Aan de andere kant van het membraan, plaats een lege spuit (1 ml) direct onder het weefsel. Breng zuiging aan door de plunjer naar achteren te trekken tot een volume van 0,2-0,3 ml. Vergroot het zuigoppervlak door de vasthoudende punt van de spuit te snijden voor gebruik. Het weefsel vereist geen verdere behandeling voor hechting, omdat het fysiek in het membraan is ingesloten.

3. Bolusinjectie van Isolectin Alexa 488

  1. Bereid patchpijpjes en kleurstofoplossing. Trek patchpijpjes van borosilicaat capillair glas met een Flaming/Brown puller, met een weerstand van ~1 MΩ. Breek voorzichtig de punt van het pijpje.
  2. Maak kleurstofoplossing door 0,3 μl isolectin Alexa 488 stamoplossing toe te voegen aan 10 μl van de HEPES-gebufferde Ringer's oplossing beschreven in stap 1.2.
  3. Breng monster over naar de patch-clamp opzet voor injectie (Figuur 1C). Plaats het membraan met bevestigd weefsel in de opnamekamer geperfundeerd met opgewarmde (37 °C) en geoxideerde HEPES-gebufferde Ringer's oplossing.
  4. Plaats het pijpje met kleurstof tegen de binnenste beperkende membraan (ILM, Figuur 2A). Gebruik een micromanipulator om het pijpje verder tegen het ILM te brengen tot het het doorboort. Injecteer de kleurstofoplossing met een druk van 10-20 psi gedurende 1 sec. met behulp van een picospritzer. Enkele of meerdere locaties kunnen worden aangewezen voor injectie (Figuur 2B). Als een picospritzer niet beschikbaar is, kan een 10 ml-spuit worden gebruikt om een positieve luchtdruk voor injectie te leveren.
  5. Incubeer het geïnjecteerde weefsel gedurende 10 min. Tijdens incubatie kan het geïnjecteerde weefsel onder epifluorescentie-verlichting worden bekeken.
  6. Na markering kan de voorbereiding naar een microscoop worden gebracht voor beeldvorming. Breng de inzet over naar een glasbodem kweekschaal, met de netvlieszijde naar beneden (Figuur 1C).
  7. Voeg een druppel HEPES-oplossing toe om het specimen vochtig te houden.
  8. Plaats 2-3 stippen vacuümvet rond de omtrek van de plastic ring om de inzet stevig aan de bodem van de kweekschaal te bevestigen.
  9. Breng de schaal over naar het microscoopplatform.

4. Paraformaldehyde en carbodiimide fixatie

  1. Fixeer het monster door de inzet over te brengen naar fixeermiddel gedurende 15 min. Langere of kortere fixatietijden kunnen worden gebruikt,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstreerd hier zijn twee representatieve experimenten die profiteren van het gebruik van een gehydrofiliseerde PTFE-membraan om de gehele retina te ondersteunen tijdens kleuringsprocedures. Het eerste experiment illustreert de methode voor snelle en eenvoudige karakterisering van het retinale vaatwerk, een uitgebreid netwerk van bloedvaten dat zich uitstrekt over meerdere retinale lagen (Figuur 2). Deze aanpak combineert bolusbelasting van isolectine met onderdompeling labelen met SRH. Dit is een effi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hoge biocompatibiliteit en transparantie in oplossingen van de gehydrofiliseerde PTFE-membraan is voordelig bij het werken met levend weefsel. Deze voorbereiding is met succes gebruikt in eerder werk voor patch-clamp opnames van lichtreacties8-10. Hier laten we zien hoe deze aanpak kan worden toegepast voor structurele analyse van de gehele retina.

De bolus ladingstechniek kan effectief worden gebruikt voor het labelen van levend weefsel. Deze techniek wordt ondersteund door de s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R01-EY020535 (B.T.S), International Retinal Research Foundation en Karl Kirchgessner Foundation (B.T.S).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm,
hydrofiel PTFE (Biopore), 0,4 μm		MilliporePICM01250
Insuline spuit, 1 mlBeckton Dickinson309659
SchaarFine Science Tools15003-08dissectie
Pincet, Dumont #55, roestvrij staalFine Science Tools11255-20dissectie
CryostatLeicadiversen
Confocal Microscope SysteemNikondiversen
Glas capillairWorld Precision Instruments1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Micropipet PullerSutter Instrument Co.
Picospritzer IIIParker Hannifin
Bakgrond Cultuur Schotels met Glas BodemMatTek CorporationP35G-0-14-C
PetrischaalFalcon1008
Eenmalige Gegradueerde Transfer PipettenVWR16001-180
Multiwell platen, 24-wellBeckton Dickinson351147
Dekglas, #1Electron Microscopy Sciences72200-30
Polysine adhesieve slidesElectron Microscopy Sciences63412-01
MicroscoopglaasjesGlobe1301
Liquid BlockerElectron Microscopy Sciences71312
VECTASHIELD montage mediumVector LaboratoriesH-1000
OCT mediumSakura4583
Parafilm laboratorium filmFisher13-374-10
Dow Corning high vacuum greaseSigma-AldrichZ273554
Muis anti-PSD95MilliporeMABN68antilichaam
Ezel anti-muis Alexa 568InvitrogenA10037antilichaam
Isolectin Alexa 488InvitrogenI21411
ChemiblockerChemicon2170S
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
SulforhodamineSigma-Aldrich341738
CarbodiimideThermo Scientific22980EDC
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis. Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).
  2. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  3. Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. Histamine immunoreactive axons in the macaque retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).
  4. Haverkamp, S., Wassle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).
  5. Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina. J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).
  6. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).
  7. Tymianski, M., et al. A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments. Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).
  8. Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output. J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).
  9. Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue. J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).
  10. Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration. Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).
  11. Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).
  12. Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina. J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinal Whlemount PreparationImmunohistochemical StainingCarbodiimide FixationFluorescent Marker LoadingTissue StabilizationMembrane Support TechniqueSynaptic Protein ImagingRetinal Tissue PreparationFluorescence MicroscopyCryostat Sectioning

Gerelateerde artikelen