Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Werken met delicaat weefsel kan een bemoeilijkende factor zijn bij het uitvoeren van immunohistochemische beoordeling. Hier presenteren we een methode die een ring-ondersteunde hydrofiliseerde PTFE-membraan gebruikt om structurele ondersteuning te bieden aan zowel levend als gefixeerd weefsel tijdens immunohistochemische verwerking, wat het gebruik van een verscheidenheid aan protocollen mogelijk maakt die anders schade aan het weefsel zouden veroorzaken. Eerst wordt dit gedemonstreerd met bolus-belasting van fluorescerende markers in levend retinaweefsel. Deze methode maakt snelle visualisatie van doelgerichte structuren mogelijk, terwijl de membraanondersteuning de weefselintegriteit tijdens de injectie behoudt en eenvoudige overdracht van de voorbereiding voor verdere beeldvorming of verwerking mogelijk maakt.
Ten tweede wordt een procedure voor antilichaamkleuring in weefsel gefixeerd met carbo-di-imide beschreven. Hoewel paraformaldehyde-fixatie gebruikelijker is, biedt carbo-di-imide-fixatie een superieur substraat voor de visualisatie van synaptische eiwitten. Een beperking van carbo-di-imide is dat het resulterende gefixeerde weefsel relatief kwetsbaar is; dit wordt echter overwonnen met het gebruik van de ondersteunende membraan. Retinaweefsel wordt gebruikt om deze technieken te demonstreren, maar ze kunnen worden toegepast op elk kwetsbaar weefsel.
Inleiding
Het uitvoeren van immunohistochemie in delicate intacte weefsels brengt het risico met zich mee dat er schade ontstaat tijdens het hanteren en overbrengen. Dit kan optreden in hersenslices of ander dun weefsel, zoals gedegenereerde retina. Bovendien zijn er bepaalde methoden voor weefselfixatie die voordelig kunnen zijn voor immunokleuring van neuronale structuren, maar die resulteren in een verminderde structurele stabiliteit, waardoor hun gebruik wordt uitgesloten. Een specifiek voorbeeld hiervan is carbodiimide-gebaseerde fixatie, die superieur is voor het kleuren van receptoren en hormonen1-7, maar meestal wordt vermeden vanwege de instabiliteit van het....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Bij alle experimentele procedures werden dieren behandeld volgens de voorschriften in de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visuel onderzoek en in overeenstemming met protocollen goedgekeurd door Weill Cornell Medical College. Dieren werden geëuthanaseerd door koolstofdioxide en vervolgens cervicale dislocatie.
1. Dissectie van de gehele netvliesmontage
- Nadat de muis is geëuthanaseerd, enucleer zijn ogen en plaats ze in geoxideerde HEPES-gebufferde Ringer's oplossing (Tabel 1).
- Verwijder de hoornhuid door in een cirkelvormige baan langs de ora serrata te snijden me....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier worden twee representatieve experimenten gedemonstreerd die profiteren van het gebruik van een gehydrofiliseerd PTFE-membraan om de hele retina te ondersteunen tijdens kleuringsprocedures. Het eerste experiment illustreert de methode voor een snelle en eenvoudige karakterisering van de retinale vasculatuur, een complex netwerk van bloedvaten dat zich over meerdere retinale lagen uitstrekt (Figuur 2). Deze aanpak combineert bolus-belading van isolectine met immersie-labeling met SRH. Dit is een effic.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hoge biocompatibiliteit en transparantie in oplossingen van de gehydrofiliseerde PTFE-membraan is voordelig bij het werken met levend weefsel. Deze voorbereiding is met succes gebruikt in eerder werk voor patch-clamp opnames van lichtreacties8-10. Hier laten we zien hoe deze aanpak kan worden toegepast voor structurele analyse van de gehele retina.
De bolus ladingstechniek kan effectief worden gebruikt voor het labelen van levend weefsel. Deze techniek wordt ondersteund door de s.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R01-EY020535 (B.T.S), International Retinal Research Foundation en Karl Kirchgessner Foundation (B.T.S).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrofiel PTFE (Biopore), 0,4 μm | Millipore | PICM01250 | |
| Insuline spuit, 1 ml | Beckton Dickinson | 309659 | |
| Schaar | Fine Science Tools | 15003-08 | dissectie |
| Pincet, Dumont #55, roestvrij staal | Fine Science Tools | 11255-20 | dissectie |
| Cryostat | Leica | diversen | |
| Confocal Microscope Systeem | Nikon | diversen | |
| Glas capillair | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipet Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Picospritzer III | Parker Hannifin | ||
| Bakgrond Cultuur Schotels met Glas Bodem | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Petrischaal | Falcon | 1008 | |
| Eenmalige Gegradueerde Transfer Pipetten | VWR | 16001-180 | |
| Multiwell platen, 24-well | Beckton Dickinson | 351147 | |
| Dekglas, #1 | Electron Microscopy Sciences | 72200-30 | |
| Polysine adhesieve slides | Electron Microscopy Sciences | 63412-01 | |
| Microscoopglaasjes | Globe | 1301 | |
| Liquid Blocker | Electron Microscopy Sciences | 71312 | |
| VECTASHIELD montage medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| OCT medium | Sakura | 4583 | |
| Parafilm laboratorium film | Fisher | 13-374-10 | |
| Dow Corning high vacuum grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| Muis anti-PSD95 | Millipore | MABN68 | antilichaam |
| Ezel anti-muis Alexa 568 | Invitrogen | A10037 | antilichaam |
| Isolectin Alexa 488 | Invitrogen | I21411 | |
| Chemiblocker | Chemicon | 2170S | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sulforhodamine | Sigma-Aldrich | 341738 | |
| Carbodiimide | Thermo Scientific | 22980 | EDC |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 |
Referenties
- Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis. Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
