De opengesneden Vaseline gap benadering wordt gebruikt om lage ruis opnames van ionische en gating stromen van spanningsafhankelijke ionkanalen uitgedrukt in Xenopus oöcyten met een hoge resolutie van snelle kanaal kinetiek verkrijgen. Met kleine wijzigingen, kunnen spanningsklem fluorimetrie worden gekoppeld aan de opengesneden eicel protocol.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De opengesneden eicel Vaseline gap (COVG) voltage clamp techniek maakt het mogelijk voor de analyse van elektrofysiologische en kinetische eigenschappen van heterologe ionkanalen in eicellen. Opnames van de opengesneden setup zijn vooral nuttig voor het oplossen van lage magnitude gating stromen, snelle ionenstroom activering en deactivering. De belangrijkste voordelen via twee elektroden spanningsklem (TEVC) techniek omvatten een toename klemsnelheid, verbeterde signaal-ruisverhouding en het vermogen om de intracellulaire en extracellulaire milieu moduleren.
Hier maken we de menselijke cardiale natrium kanaal (HNA V 1.5), uitgedrukt in Xenopus oöcyten, de opengesneden setup en protocol alsook over eventuele wijzigingen die nodig zijn om spanningsklem fluorometrie mogelijkheden toe te voegen aan te tonen.
De eigenschappen van snelle activerende ionkanalen, zoals HNA V 1.5, niet volledig kan worden opgelost in de buurt van kamertemperatuur met behulp TEVC, in which het geheel van de eicel membraan geklemd, waardoor spanningsregeling moeilijk. Echter, in de opengesneden techniek, isolatie van slechts een klein deel van het celmembraan zorgt voor de snelle klemmen die nodig zijn om nauwkeurig registreren snelle kinetiek terwijl het voorkomen kanaal vervallen in verband met patch clamp technieken.
In combinatie met de COVG techniek kinetiek van ionkanalen en elektrofysiologische eigenschappen kunnen verder worden getest door voltage clamp fluorometrie, waar eiwithoudende beweging wordt gevolgd via cysteïneconjugatie van extracellulair toegepaste fluoroforen, insertie van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen, of de opname van onnatuurlijke aminozuren in het gebied van belang 1. Deze extra gegevens levert kinetische informaties spanningsafhankelijke conformationele herschikkingen van het eiwit via veranderingen in de micro-omgeving rond het fluorescent molecuul.
Inleiding
Gespecialiseerde spanning klem technieken toestaan dat de opname van de ionische stromen bij een gecontroleerde membraanpotentialen. Wijd gebruikt twee-elektrodespanning klem (TEVC) en patch clamp technieken betrouwbare elektrofysiologische informatie over de eigenschappen van vele ionkanalen. Echter, beide methoden hebben nadelen die het verkrijgen van betrouwbare gegevens voor snelle spanningsafhankelijke natriumkanalen en andere snelle activerende kanalen in membranen zoals die van Xenopus oöcyten voorkomen. De Bezanilla en Stefani laboratoria dus ontwikkelde de opengesneden Vaseline kloof voltage clamp techniek (COVG) voor eicellen 2. De techniek is algemeen toegepast opnemen, Na +, K + en Ca2 + kanalen 3-8.
Tijdens COVG opname wordt een heterologe-eiwit tot expressie brengen eicel membraan verdeeld in drie regio's. De ionische stroom gegevens worden opgetekend uit de topgebied van de eicel alsbad rond het topgebied geklemd om een commando potentieel, dat gemakkelijk en snel kan worden veranderd. Het middengebied waakt tegen lekstromen door klemming dezelfde potentiaal als de bovengebied 9. Het onderste gebied is waar eicel opening (opengesneden) gebeurt door middel van een saponine-oplossing of canule. Chemisch of handmatig openen van het membraan in het bodemgebied controle mogelijk van de interne potentieel, dat wordt vastgeklemd aan de grond en maakt de cel inwendige grenzen aan de onderste kamer oplossing. Perfusie van oplossingen in de onderste kamer kan de eigenschappen van de interne omgeving aan te passen, terwijl oplossing uitwisseling in de bovenste kamer verandert de externe omgeving. 
Figuur 1. Eicel opengesneden Voltage-Clamp Bath Installatieblad. (A) Topdown view van de drie baden van elkaar gescheiden. De afmetingen van de kamers voor COVG worden weergegeven op de figuur. (B) Zijaanzicht van de baden setup in het testen positie. Klik hier voor grotere afbeelding .
De voordelen van de COVG techniek zijn lage stroomruis (1 nA 3 kHz), de controle van de ionische samenstelling van het externe medium, de mogelijkheid om de interne media, snelle tijdsresolutie (20-100 usec tijdconstante van verval van het moduleren capaciteit voorbijgaande) en stabiele opnamen gedurende enkele uren 9. De nadelen zijn dat het vereist speciale apparatuur en het is moeilijker uit te voeren vergeleken met electrodes voltage klem (TEVC) 10.
Terwijl de COVG benadering vereist zeer gespecialiseerde apparatuur en ingewikkelde procedurele elementen, kan het mogelijk maken voor de verwerving van waardevollekunnen elektrofysiologische gegevens. Deze gegevens, zoals het poorten stromen met snelle kinetiek en staart stromingen 4, kan worden opgenomen zonder een aantal van de kwesties in verband met andere spanning klem protocollen waaronder kanaal vervallen. Kleine aanpassingen aan de COVG setup kunnen zorgen voor het gebruik van de temperatuurregelaars en spanningsklem fluorometrie (VCF). De opname van spanningsklem fluorometrie elementen binnen de COVG montage kan data output te vergroten door het verlenen van de mogelijkheid om eiwit conformationele veranderingen te monitoren, terwijl het gelijktijdig opnemen van de huidige 11-13.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Initial Equipment Setup
- Plaats het podium en de micro-elektrode manipulator op een vibratie-isolatiesysteem (bijvoorbeeld een lucht tafel) met een omringende kooi van Faraday om elektrische en mechanische ruis te voorkomen.
- Solderen zes Ag / AgCl pellets tot zes-inch lengtes van 24 AWG draad. Voor een van deze lengte (voor aansluiting op P1), verbinding in een tweede draad een "Y" vormen. Op de uiteinden van elke draad soldeer een gouden BNC pin, die is inbegrepen bij de versterker.
- Sluit de vijf Ag / AgCl pellets gesoldeerd aan 24 AWG draad aan de Bath / Guard headstage (P1, P2, CC, GS1 en GS2). Sluit de "I" Ag / AgCl pellet aan de "I" headstage en de tweede draad loskomen van P1 naar de V2 headstage.
- Sluit de versterker aan op de data-acquisitie eenheid volgens de aanwijzingen in de handleidingen.
- Plaats en epoxy de temperatuurregelaar thermistoren. Rijg het blok thermistor door een gat in de metalen scaffold direct boven het midden van de verwarming / koeling element. Plaats en epoxy het bad thermistor in een gat geboord in het lichaam van de temperatuur geleidende onderste kamer zeer dicht, maar niet met de oplossing.
2. De eicel en de Voorlopige Voorbereiding
- Om een heteroloog tot expressie kanaal zoals HNA V 1.5 opnemen, synthetiseren mRNA (afgeleid van hSCN5a) en injecteren in een Xenopus eicel ongeveer 4-5 dagen voor het uitvoeren van Protocol 4. Voor hSCN5a wordt piek expressie verkregen na incubatie gedurende 4-5 dagen bij 19 ° C. Raadpleeg Richards en Dempski 14 en Cohen et al.. 15 voor gedetailleerde instructies voor de eicel, mRNA voorbereiding en eicel injectie.
- Chloride de AgCl draad en AgCl pellets voor het begin van Protocol 4. Hiertoe plaatst een uiteinde van de draad en de pellets in bleekmiddel minimaal 20 minuten en zolang O / N. Nadat de korrels zijn Chlorided, brengen ze naar het spruitstuk met behulp van lijm.
Opmerking: Het drijven stroom door de draden kunnen ook worden gebruikt om de draad en pellets chloride. Deze techniek zal de snelheid van chloridation vergroten, maar ook de benodigde apparatuur. Zie Technieken voor Chloriding Zilveren Draden voor verdere instructie 16.
3. Agar Bridge Voorbereiding
- Voeg ten minste zes agar bruggen door verhitting een uiteinde van een boorsilicaat capillair in een medium vuur. Zorg ervoor dat het uiteinde van de capillaire buis in het bovenste gedeelte van de blauwe vlam. Maak extra bruggen in geval van schade aan de originelen.
- Zodra de capillair is opgewarmd, een tang om een hoek van 90 ° bocht in de buis maken. Doel van een bocht met een gladde kromming plaats van een abrupte hoek of het kan aanzienlijk verminderen de inwendige diameter van het glas, waardoor het vullen moeilijker en verhoogt de weerstand van de brug.
- Een tweede 90 ° bochtin dezelfde richting 25 mm beneden het capillair van de eerste bocht met dezelfde stappen.
Opmerking: De exacte lengte van de brug niet zolang de brug omvang consistent toe, maar uiteindelijk de lengte moet op het platform worden ze gebruikt worden. Houd in gedachten dat de brug weerstand is evenredig aan de lengte en moet worden geminimaliseerd. - Zodra de capillaire buisjes zijn afgekoeld, gebruik dan een gediamanteerde glassnijder aan de "benen" van de brug trimmen tot ongeveer 5 mm.
- Steek lengtes van platina draad in de capillairen van de drie "huidige-leveren" bruggen om de prestaties te verbeteren door het verminderen van de weerstand in de agar 17. Knip overtollige platina draad, zodat er geen draad buiten de buis blootgesteld.
Opmerking: Vanwege de hoge kosten van platina, ophalen en hergebruiken een draad uit gebroken bruggen. - Duw de platina draad verder in de capillaire buis met een puntig voorwerp zoals een micropipet tip zodat de draad 1 mm korter dan het glas aan beide uiteinden van het capillair.
- Voeg 100 ml van 1 M NMDG gebufferd met 1,2 g HEPES. Met een pH-meter en voeg MES hydraat poeder tot een pH van 7,4 is bereikt (~ 10 g). Wanneer een pH van 7,4 is bereikt, verwijdert de elektrode. Zet opzij 40 ml van de oplossing als een storage-oplossing te houden.
- Voeg gegranuleerd agar een 2-3% agar mengsel te produceren. Roer en verhit tot de agar-oplossing wordt opgelost en duidelijk. Niet oververhit of kook de oplossing als het overdreven viskeuze en het vullen van de bruggen zal moeilijk zijn zal worden.
- Verplaats de agar oplossing voor een nieuwe beker en voeg een kleine roerstaafje. Blijven verwarmen en roeren bij een matige snelheid.
- Voeg de capillaire bruggen een voor een met de benen omhoog. Na verloop van tijd de bruggen zal vullen met agar. Als alternatief, vul de bruggen door te drukken agar oplossing door middel van een injectiespuit bevestigd aan een kleine pipet tip.
- Zodra er geen luchtbellen in de briDGES, halen de bruggen van de agaroplossing en plaats de bruggen op een papieren handdoek om te drogen. Elke bruggen met een resterende bubbels kunnen worden geschud met een pincet te borrelen afrit vergemakkelijken.
Opmerking: Geregeld agar met bellen kan volledig worden verwijderd door onderdompeling van de bruggen in kokend water. Zodra de agar wordt verwijderd, gebruik dan een vacuüm lijn om restwater te verwijderen. Bruggen kunnen dan worden hergebruikt voor agar behandeling. - Verwijder overtollig agar van de bruggen als het droog. Voeg 60 ml water toe aan de 40 ml reserve-oplossing en plaats de bruggen in de storage-oplossing.
4. Opengesneden Rig Voorbereiding
- Schakel de waterbron voor de temperatuurregelaar en vervolgens de schakelaar in de temperatuurregelaar. Wacht tot de temperatuur van het bad de aangegeven temperatuur (19 ° C) heeft bereikt.
- Trek micro-elektroden van borosilicaat capillaire buis met een micro-elektrode trekker om een weerstand van 0.2-0.5 MQ.
Opmerking: Verlaging pipette weerstand verbetert vastklemmen snelheid. Echter, lagere weerstand pipetten hebben meer kans om de eicel beschadigen. Experimentation moet de beste pipet weerstandswaarde voor elke toepassing bepaald. - Bereid de saponine-oplossing door het mengen van 0,125 g droog saponine met 50 ml interne oplossing. Dit leidt tot een 0,25% oplossing. Omkeren voorzichtig te mengen.
- Onder een dissectiemicroscoop een kleine hoeveelheid vaseline rond de rand van de opening aan de bovenzijde van de middelste kamer en de onderzijde van de bovenste kamer met een puntig voorwerp.
Opmerking: de "donut" vaseline zal helpen om de eicel plaats via gat en zal helpen bij de vorming van de afdichting. Echter, te veel vaseline zal val bellen en te voorkomen dat de oplossingen van het bereiken van de eicel oppervlak. - Voeg 3 M KCl oplossing in het verdeelstuk sleuven met Ag / AgCl pellets zodat er geen overloop van de sleuven, maar de pellets en brug been uiteinden inhamrood. Opruimen extra KCl druppeltjes om ongewenste elektrische verbindingen tussen slots te voorkomen.
- Voeg externe oplossing voor de lagere en middelste bad kamers.
- Plaats de agar bruggen in de sleuven van het AgCl pellet spruitstuk zodat een been per brug in elk slot. Het andere been van de bruggen later in de respectieve kamers worden geplaatst (P1, P2, CC bovenkant, GS1, GS2 midden (guard), I bodem). Zorg ervoor dat platina draad bruggen zijn in de GS2, P2, en ik slots.
Opmerking: Zorg bruggen worden gewassen met gedestilleerd water en volledig droog is voordat u deze in de kamer bad. - Zet de data-acquisitie systeem en de PC. Start de opname software.
5. Opengesneden Procedure
- Installeer de bovenste en middelste eicel kamers zonder een eicel. Schuif de bovenste kamer excentrisch zodat de gaten in de twee kamers niet overlappen. Vul alle kamers met externe oplossing en plaats alle elektroden in hun respectievelijke kamers.
Opmerking: Druk niet op de bovenste kamer helemaal naar beneden bij het installeren van de kamers. Zorg ervoor dat een zeer kleine opening blijft tussen de twee kamers. De excentrische opstelling verhoogt de weerstand van de kamer systeem de aanwezigheid van een cel beter simuleren. Dit proces, genaamd "het balanceren van de bruggen", compenseert de offset mogelijkheden die kunnen voortvloeien uit inhomogeniteit onder de agar bruggen.- Schakel de externe opdracht en beide klemmen. Controleer de huidige waarde van de versterker. Stel met een kleine schroevendraaier de P offset aan de achterkant van het bad / guard head-fase nul stroom.
- Schakel het bad / bewaker schakelaar op de versterker om actief en de GS offset op nul huidige verkrijgen passen.
- Herhaal tussen "actieve" en "passieve" totdat beide zijn redelijk dicht bij nul (<100 nA).
- Verwijder de bovenste kamer en breng een eicel in het midden bad kamer met een pipet pomp. Zorg ervoor dat de oocyte zich boven het gat in het midden van het bad.
Opmerking: Bij het opstellen van een eicel voor VCF, plaatst u de gelabelde cel in de kamer met het dier paal (donkere kant) naar boven. Cel oriëntatie maakt niet uit of VCF niet wordt uitgevoerd. - Verwijder overtollig externe oplossing uit de bodem bad met een aspirator om een afdichting tussen de eicel en bad oppervlak te creëren.
- Plaats de top bad kamer over de eicel, zodat het gat in de kamer is gericht op de top van de eicel. Met een duim en middelvinger langzaam druk uitoefenen beneden op de kamer totdat het strak wordt gedrukt tegen de eicel zodat slechts een klein gedeelte van de membraan bloot te stellen aan het bovenste bad door het gat.
Opmerking: De eicel kan uitpuilen onder de druk van de bovenste kamer. Oefen geen overmatige kracht uit op de bovenste kamer, omdat dit zal leiden tot de eicel te scheuren. Pincet tips bovenaan diagonale hoeken van de bovenste kamer kan worden gebruikt als alternatief voor vingers apply neerwaartse druk. - Voeg externe oplossing voor de bovenste en onderste baden tot ze bijna vol.
- Plaats de vrije benen van de agar bruggen in de externe oplossing van elk bad zoals in figuur 2 (brug plaatsing). Zorg ervoor dat elke brug is rust in de juiste bad locatie. (Ik overbruggen in bodem bad, GS1 en GS2 bruggen in midden bad, en P1, P2, en CC bruggen in de bovenste bad). Schakel het bad / bewaker schakelaar op de versterker actief.
Opmerking: Zorg ervoor dat er geen 3 M KCl verbindingen tussen de bruggen, de putten, en de opname kamers. Zorg er verder voor bruggen worden gevormd, zodat ze boven de opname kamer oplossingen worden verhoogd.
Figuur 2. Agar Bridge Setup Locatie Diagram. Plaatsing locaties van de vrije uiteinden van de agar bruggenin de verschillende baden. Klik hier voor grotere afbeelding . - Start een testprotocol in de opnamesoftware. Als de puls toont verticale verplaatsing van het horizontale gedeelte tussen de twee pieken bij toepassing van een 100 mV puls die groter is dan 100 nA (overeenkomend met 0,3 MQ met het bad / guard passieve) verhoog de dichtheid van het bad deksel. Zie figuur 3 een voorbeeld van de ideale testpuls.
Opmerking: Het testprotocol geeft een spanningspuls of de baddeksel strak genoeg en alle componenten correct zijn gemonteerd. Alternatief kan de testfunctie van de versterker gebruikt.
Figuur 3. Ideaal Testpuls van de Recording Software. De test pulsmoet gelijk zijn aan de bovenstaande puls afhankelijk van de protocol toegepast kijken. Het bedrijf huidige (midden nullijn) moeten dicht bij nul zijn. Klik hier voor grotere afbeelding . - Verwijder de externe oplossing in de bodem bad en vervangen saponine-oplossing. Wees voorzichtig om te voorkomen dat bellen tijdens het toevoegen van de saponine. Om maximale vervanging gelden, afzuigen aan de andere kant van het onderste bad tijdens het toevoegen van de oplossing.
- Na de saponine-oplossing is toegevoegd, acht de herhalende testpuls. Als de piek van het testprotocol vermindert of verdwijnt dan is dit een teken dat er een luchtbel onder de eicel bevindt. In dit geval volledig saponine oplossing te verwijderen en vervangen.
Opmerking: Permeabilisatie neemt gewoonlijk binnen 30 sec met verse saponine oplossing. De oplossingen kunnen moeilijk bij de cel als er opgesloten luchtbellenof wanneer de folliculaire laag blijft een slecht verteerd eicel. De eicel is permeabel (geopend) wanneer de helling van de spanningspiek afneemt (toename tijdconstante van verval).
Figuur 4. Testpuls Sporen Tijdens Eicel Permeabilisatie. Geselecteerde sporen uit de test puls-protocol na een 0,25% saponine oplossing in de bodem eicel kamer werd geïntroduceerd. De toename van de tijdconstante van verval zien in de sporen toont een stijging van eicel permeabilisatie. Klik hier voor grotere afbeelding . - Zodra de cel is permeabel, verwijder de saponine oplossing en vul het bad met interne oplossing. Stop het testprotocol.
Opmerking: Hoewel saponine biedt toegang tot hetinwendige van de cel door het membraan permeabilisatie, evenwichtsinstelling van de ionenconcentraties tussen de onderste bad en het cytoplasma van de eicel door diffusie is een langzaam proces. Dit proces kan tientallen minuten in beslag, afhankelijk van de omstandigheden (Figuur 5). - Controleer of er een hoge mate van oplossing in de baden en gekristalliseerd KCl tussen de putten van het spruitstuk als deze kunnen kortsluiting en onvoorspelbaar gedrag veroorzaken.
- Gebruik de aangepaste spuit 3 M KCl injecteren in een micro-elektrode. Flick de micro-elektrode meerdere malen met een vinger terwijl schrap met de andere vingers.
Opmerking: Deze stap is nodig om eventuele luchtbellen in de micro-elektrode te verwijderen. - Monteer de KCl-gevulde elektrode op de micromanipulator arm door het invoegen van de gloeidraad in de open micro-elektrode einde. Duw het uiteinde van de micro-elektrode in de houder filament en zorg ervoor dat de elektrode is niet los. Draai de elektrode sluiting.
Let op: Make ervoor dat de draad heeft een nog AgCl coating voor de elektrode om normaal te functioneren. - Draai de arm in positie over de eicel baden en draai de klemmen om verdere beweging arm te voorkomen.
- Met behulp van de manipulator knoppen, lopen de elektrode naar beneden in het bad. Zorg ervoor dat geen test puls wordt toegepast en dat het membraan-test functie is op dit moment niet geactiveerd.
Opmerking: Voordat de punt van de elektrode in de vloeistof wordt ingebracht, V1-V2 op de spanning klem zal een positieve spanning te lezen. Wanneer de elektrode in de vloeistof wordt ingebracht, moet de voltmeter aan de spanningsklem veranderen naar een waarde dicht bij nul. Voor VCF opnames, de elektrode moet de cel te benaderen op een vrij kleine hoek om ruimte te laten voor de doelstelling. Gespietst de cel met de elektrode uit het midden, dichter bij de rand van de geïsoleerde membraanplaat helpt ook om de botsing van het doel met de elektrode te voorkomen. - Stoppen met lopen de elektrode naar beneden. Zet de elektrode offsetpotentieel tot nul door op de V1 knop en vervolgens het verminderen van de V1 spanning tot nul door het aanpassen van de V1 compenseren. Daarnaast voert u dezelfde aanpassing voor V2. Het potentiaalverschil V1-V2 moet 000 mV lezen.
- Schakel terug naar V1 en draai Z-test om de weerstand elektrode meten. De waarde zal geleidelijk dalen en de aanpak van de werkelijke weerstand. Streef naar een weerstand waarde van 0.2-0.5 MQ.
- Loop de elektrode naar beneden richting de zichtbare patch van de eicel in het bad. Zodra de micro-elektrode is zeer dicht bij de eicel, bekijk de V1-V2 lezen om te zien wanneer de elektrode komt in de eicel, de V1-V2 spanning zal negatief worden wanneer de micro-elektrode de cel ingaat.
Opmerking: Het is in dit point is de membraanpotentiaal van de cel en wordt beïnvloed door de kanalen tot expressie gebracht en de gebruikte oplossingen. Het plaatsen van de micro-elektrode te ver zal het celmembraan beschadigen. - Open de dataverzameling protocol in deopname software.
- Flip op de klem schakelaar op de spanning klem en het potentieel om de opdracht (bv. -100 mV) overeenkomen met door het aanpassen van de knop op de "I" headstage passen.
- Flip op de capaciteit en weerstand compensatie schakelaar.
- Flip de "Test" schakelen in de "Commands" regio van de voltage-clamp. Gebruik de oscilloscoop om het signaal te visualiseren. Pas de Cm compensatie knoppen in de signaal-conditioning segment aan de capacitieve transiënten op de oscilloscoop te verminderen. Niet te compenseren de pieken tot het punt waar bovendien een omgekeerde pieken optreden of de toppen beginnen te ontwikkelen een sigmoïdale kromming, die artefact kan introduceren in de opname.
- Zodra de capaciteit handmatig is teruggebracht tot een bevredigend niveau, zet de test schakelaar.
- Beginnen de gegevensregistratie protocol in de opnamesoftware.
6. Schoonmaken
- Bij opnames hebben been, schakelt u alle verschillende schakelaars op de spanning klem inclusief de klem en bad / bewaker schakelaars.
- Gebruik een tang om de agar bruggen uit de verschillende baden te verwijderen.
- Verwijder de bovenste bad en zuig alle oplossingen en eicel uit alle baden.
- Gebruik een fles gedemineraliseerd water om alle baden spoelen en daarna zuig het baden met een stofzuiger. Herhaal deze stap 3-5x.
- Veeg gekristalliseerde KCl van de bruggen en plaats de bruggen in de storage-oplossing. Bruggen kunnen worden hergebruikt voor vele weken zolang ze goed worden opgeslagen.
- Zuig het KCl-oplossing van het spruitstuk putten en spoel het spruitstuk met gedemineraliseerd water meerdere malen.
- Schakel alle diverse apparatuur waaronder de temperatuurregeling en de opnamesoftware.
7. Toevoeging van Voltage Clamp fluorometrie
- Volg de stappen in hoofdstuk 1 tot en met 6 in een eerder gepubliceerde Jupiter protocol 16 Examining de Conformationele dynamica van membraaneiwitten in situ met Site-directed fluorescentielabeling: Klik hier om de pagina te bekijken.
- Voer de stappen in hoofdstuk 4 tot en met 5.22 van de voornoemde COVG protocol met behulp van een VCF microscoop ingesteld op 4X focus.
Opmerking: VCF opnamen vereisen grotere eicel bad kamers dan vereist in COVG metingen. (De afmetingen van het aangepaste VCF kamers worden in de lijst materialen.) Deze grotere VCF kamer moet kunnen gelijktijdig opnemen van de objectieflens, micro-elektrode en agar bruggen zijn. Daarnaast is het dier paal (donkere kant van de eicel) moet naar boven gericht in de kamer voor lage achtergrond VCF opnames. - Breng het bovenste gedeelte van de eicel in beeld met behulp van een water-immersie 40X objectief.
Opmerking: Het schakelen van de 4X tot 40X de doelstelling vereist een specifieke geometry van opengesneden componenten en aandacht om niet aan de elektrode, bruggen of kamers slaan wanneer verlagen van de 40X objectief. Bovendien, vanwege het toegenomen volume van de bovenste wacht, zodat badvolume van boven beschermkap is niet verbonden met de middelste hoede als het 40x objectief wordt opgezet. - Focus op een ring rond de omtrek van het blootgestelde oppervlak eicel, zodat de top van de eicel is iets boven het vlak van focus.
Opmerking: Aanpassing in het xy-vlak kan het nodig zijn, zodat het gezichtsveld meestal is gevuld met membraan en niet de kamer. XY translatie wordt het gemakkelijkst bereikt door plaatsing van de microscoop op een vertaling podium. - Verplaats de filter kubus in het optische pad en zet het lichtpad van het oculair naar de detector (diode).
- Schakel de VCF lichtbron.
- Uitschakelen van de lampen, de vezel schijnwerper, en andere lichtbronnen.
Opmerking: Ideaal, VCFopnamen moeten worden uitgevoerd in een volledig donkere kamer. - Voer een fluorescentie-protocol in de opnamesoftware.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 4 toont de verandering in permeabiliteit van de eicel als saponine-oplossing wordt aangebracht op het onderste gedeelte van de eicel. Figuur 5 toont de snelheid van intracellulaire oplossing uitwisseling door diffusie saponine na permeabilisatie. 20-40 min zijn verplicht om een steady-state 2,18 te komen.
Figuur 6A toont sporen gegenereerd vanuit de opname-protocol. De figuur toont ionische stromen (na P/-8 lek aftrekken) i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De opengesneden eicel Vaseline kloof voltage clamp techniek zorgt voor een snelle oplossing van gegevens, lage ruis, meer controle over interne oplossing en externe oplossing compositie en stabiele opnames over relatief lange protocollen 19. Deze voordelen stellen deze techniek naast de standaard twee-elektrode voltage clamp en patch clamp technieken. Hoewel gespecialiseerde apparatuur nodig is en het protocol is relatief moeilijk, heel weinig problemen optreden zodra het systeem is geoptimaliseerd. Dit maakt...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Alle leden van de Washington University in St. Louis Cardiac Molecular Engineering Lab. Een Burroughs Welkom Fonds Career Award op het Wetenschappelijk Interface - 1010299 (JS).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| External Solution | Merk | Catalogusnummer | [Final], gewicht of volume |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variabel (pH tot 7.4) |
| Internal Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variabel (pH tot 7.4) |
| Depolarizing Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| Calcium Chloride | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin Solution | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Internal Solution | Zie hierboven | 50mL | |
| Agar Bridge Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml van 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variabel (pH tot 7.4) |
| Granulated Agar | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Hydrate oplossing | zie hierboven | 40ml | |
| Water | 60ml | ||
| Naam van materiaal/ apparatuur | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen/Beschrijving |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan | CA-1B | |
| Data Acquisition System | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 210 | |
| Rack Power Filter | APC | G5 | |
| Heating/Cooling Bath Temperature Controller | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Vibration Control TableTop Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Vibration Control Air Table | TMC | 20 Series | |
| V1/I Electrode Data Collector | Dagan | part of CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath/Guard (I/V) Headstage (met geschikte connectoren) | Dagan | part of CA-1B | |
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Control Bath | Custom of Dagan | Custom of HE-204C | Custom kamer gemaakt van materialen van Cool Polymers (D-serie). Dagan biedt ook een prefabricated stage (HE-204C). |
| Custom AgCl Pellet Container | Custom | Custom | Custom gemaakt |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| External Oocyte Bath | Custom of Dagan | Custom of CC-1-T-LB | Custom gemaakt of gekocht bij Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom of Dagan | Custom of CC-TG-ND | Custom gemaakt of gekocht bij Dagan |
| Capillaries voor Agar Bridges en getrokken Elektrodes | Warner | G150T-4 | |
| Rotatable Mounts voor de Microscoop, Micromanipulator en Bath | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (seksueel volwassen vrouwtjes) | |
| 90 Na+ External Solution | Zie Solutions sheet | ||
| 10 Na+ Internal Solution | Zie Solutions sheet | ||
| 3 M KCL | Zie Solutions sheet | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | Zie Solutions sheet | ||
| 5mL transfer pipetten | SciMart | GS-52 | |
| Gemodificeerde KCl elektrode injector | BD | 309659 | Kunststof spuittip gesmolten om het injecteren van oplossing in de elektroden mogelijk te maken. Als alternatief kan een Microfil van WPI worden gekocht. |
| Microvaccum | Custom | Custom | |
| Forceps | VWR | 63040-458 | |
| Oocyte Handling Tools (Pipette Pump) | VWR | 53502-222 | |
| Deionized Water Squirt Bottle | VWR | 16649-911 | |
| Vaseline Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Aanvullende materialen vereist voor VCF-opnames: | |||
| VCF Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR Objectief | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Translator System voor Fixed-Stage Upright Microscopes | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| External VCF Oocyte Bath | Custom | Custom gemaakt. De afmetingen van de kamer zijn 2.7 x 1.9 x 0.4 cm. | |
| Internal VCF Oocyte Bath | Custom | Custom gemaakt. De afmetingen van de kam |
Referenties
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).
- Muroi, Y., Chanda, B. Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel. J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).
- Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents. Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).
- Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes. J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).
- Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function. J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle. Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I). J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).
- Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes. Biophys. J. 61, 78-82 (1992).
- Clare, J. J., Trezise, D. J. Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening. , Wiley-VCH. (2006).
- Susan, G. A. Methods in enzymology. 296, Academic Press. 566-578 (1998).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19, 1127-1140 (1997).
- Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J. Vis. Exp. , (2009).
- Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf (1999).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents. J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).
- Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter. J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).
- Pantazis, A., Olcese, R. Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
