Listeria monocytogenes is een Gram-positieve bacteriële pathogenen vaak gebruikt als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasieten. Beeldvorming laat L. monocytogenes infectie fasen in het kader van kleine interfererende RNA schermen maakt de globale studie van cellulaire mechanismen vereist voor bacteriële infectie van target gastheercellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Bacteriële intracellulaire pathogenen kan worden opgevat als moleculaire technieken om cellulaire signaaltransductie cascades vanwege hun vermogen om prachtig te manipuleren en te ondermijnen cel functies die nodig zijn voor de infectie van gastheer doelwitweefsels ontleden. Onder deze bacteriële pathogenen, Listeria monocytogenes is een Gram-positieve micro-organisme, dat is gebruikt als een paradigma voor intracellulaire parasitisme in de karakterisering van cellulaire immuunrespons, en die instrumentele rol heeft gespeeld bij de ontdekking van de moleculaire pathways cytoskelet en membraantransport dynamiek beheersen van. In dit artikel beschrijven we een robuuste microscopische test voor de detectie van cellulaire infectie late stadia van L. monocytogenes basis van de fluorescente labeling van InlC, een uitgescheiden bacteriële eiwit dat accumuleert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, deze assay kan worden gekoppeld met geautomatiseerde high-throughput kleine interfererende RNA schermen om characterize cellulaire signaalwegen betrokken bij het up-of down-regulatie van infectie.
Inleiding
De Gram positieve bacterie Listeria monocytogenes is een voedsel overgedragen pathogeen dat gastheercellen valt, verstoort de internalisatie vacuole en repliceert in het cytoplasma van gastheercellen 1. L. monocytogenes gemak van manipulatie in het laboratorium context (snelle groei, een lage toxiciteit voor gezonde personen) in verband met het voortbestaan van bacteriële virulentie eigenschappen waargenomen in cellulaire en diermodellen (hemolytische activiteit, leukocytose) toegestaan het eerste gebruik in de jaren 1960 als een belangrijk model voor de studie van intracellulaire parasitisme en voor de oprichting van de theoretische ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van Cellulaire en bacterieculturen, Transfection Gereedschap en Primaire antilichamen
- Bereid een frisse agar plaat te isoleren individuele L. monocytogenes kolonies van een bacteriële glycerol voorraad (50% glycerol/50% verzadigd bacteriële vloeibare overnachtkweek) bewaard bij -80 ° C.
- Met een aluminium rek (bij -80 ° C gehouden) een bacteriële bevroren glycerolvoorraad, strook bacteriën op Brain Heart Infusion (BHI) agar plaat vervoeren.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 48 uur (of tot individuele bacteriële kolonies worden geïsoleerd).
- Bewaar deze werken plaat daarna bij 4 ° C gedurende een max....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Fluorescentielabelling van cytoplasmatische InlC biedt een robuuste uitlezing voor cel infectie door L. monocytogenes, zoals in figuur 1: de centrale cel in de microfoto is sterk besmet door de stam P14.PrfA * 23 zoals kan worden waargenomen in fase contrast beeld (pijlpunten figuur 1A) en wordt bevestigd door de DAPI signaal waar individuele bacteriën duidelijk onderscheiden (Figuur 1B). De InlC kleuring (gesuperponeerd op de DAPI kleuring in figuur.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Verschillende parameters zijn cruciaal voor het succes van onze InlC detectie protocol, inclusief het gebruik van gezonde cellijnen weergeven van een voldoende groot cytoplasma een eenduidige detectie van de InlC signaal mogelijk. In de test geven we in dit artikel stellen we het gebruik van CCL2 HeLa-cellen, die bijzonder geschikt voor onze assay door de uitbreiding van de cytosolische ruimte zijn, andere HeLa klonen zoals HeLa-cellen Kyoto een kleiner cytoplasma maar kan worden gebruikt met onze infectieprotocol (HeLa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Onderzoek in P. Cossart laboratorium wordt ondersteund door het Instituut Pasteur, het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, het Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), de Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), de Louis-Jeantet Foundation en de Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK is een ontvanger van een beurs van het Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot Maladies infectieuses. Wij danken Jason Mercer voor het optimaliseren van de cellulaire transfectieprotocol.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | Voor vloeibare BHI-voorbereiding |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Aanvulling op vloeibare BHI voor BHI-agarplaten |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Maak vers klaar voor elk experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Openbare software beschikbaar op http://www.cellprofiler.org/ |
Referenties
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 6/25/2014. Citeable Link.
A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).
