Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Samenvatting

Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.

Samenvatting

Vele weefsels, zoals de volwassen menselijke harten, zijn niet in staat om na schade adequaat te regenereren. ^2,3 Strategies in tissue engineering stellen innovaties om het lichaam te helpen bij het ​​herstel en reparatie. Bijvoorbeeld kan TE benaderingen kunnen hart remodeling na myocardiaal infarct (MI) verzwakken en kunnen verhogen totale hartfunctie een bijna normale pre-MI niveau. ⁴ Zoals met alle functionele weefsel succesvolle regeneratie van hartweefsel omvat de aanlevering van meerdere celtypen met omgevingsfactoren gunste integratie en het voortbestaan ​​van de geïmplanteerde cellen / weefsel transplantaat. Gemanipuleerde weefsels moeten aanpakken meerdere parameters, waaronder: oplosbare signalen, cel-cel interacties, en matrix materialen geëvalueerd als bestelauto's, hun effecten op overleving van de cel, materiaal sterkte, en faciliteren van cel-weefsel organisatie. Onderzoeken waarin de directe injectie van transplantaat cellen alleen deze essentiële elementen te negeren. ^2,5,6Een weefsel ontwerp combineert deze ingrediënten moet nog worden ontwikkeld. Hier presenteren we een voorbeeld van geïntegreerde ontwerpen middels lagen van patroon celvellen met twee verschillende types van biologisch afgeleide materialen die het type doelorgaan cellen en endotheelcellen voor het verhogen nieuwe vaartuigen formatie in het "weefsel". Hoewel deze studies richten zich op het genereren van hart-achtige weefsel, kan dit weefsel ontwerp worden toegepast op andere dan hart met minimalistisch design en materiële veranderingen veel organen, en is bedoeld om een ​​off-the-shelf product voor regeneratieve therapieën. Het protocol bevat vijf gedetailleerde stappen. Een temperatuurgevoelige poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) wordt gebruikt voor het bekleden weefselkweekplaten. Dan, weefselspecifieke cellen gekweekt op het oppervlak van de beklede platen / micropattern oppervlakken celvellen sterke laterale verklevingen vormen. Ten derde wordt een basismatrix gemaakt voor het weefsel door het combineren poreuze matrix met neovasculaire permissive hydrogels en endotheelcellen. Tenslotte worden de celvellen vanop PNIPAAm beklede schotels en naar het basiselement, waardoor het volledige construct.

Inleiding

Injectie van cellen en/of enkele materialen alleen heeft variabel succes getoond in andere orgaansystemen en beperkt succes in hartregeneratie.^5,7-12 Momenteel worden stamcel-afgeleide cellen afgeleverd aan beschadigd weefsel met behulp van verschillende afleveringsmethoden, inclusief: directe celinjectie in weefsel en perfusie in de bloedtoevoer.^13-17 Anderen hebben cellen alleen, materialen alleen en/of in combinatie met materiaaldragers geïmplanteerd om beschadigde organen te helpen regenereren.^18-21 Dit ontwerp combineert meerdere strategieën die materiaalsterkte, patterning in meerdere materialen en meerdere celtypen bieden.

Specifiek, de basis geacellulariseerde vezelige matrix biedt de fundamentele fysieke sterkte aan de constructie, waardoor deze geschikt is om indien nodig in de patiënt te worden genaaid. De lege ruimtes in de basismatrix worden gevuld met endotheelcellen in een neovasculair permissieve hydrogel²² voor het snel vestigen van vascularisatie van het geïmplanteerde construct. Dit composiet wordt vervolgens geïntegreerd met voorgepatternde cellagen die verbeterde cel-tot-cel communicatie toestaan, die het natuurlijke weefsel dichter benaderen.^1,23-25 Het algemene productieproces voor de gelaagde cellulaire patch wordt geschetst door de stroomdiagram in Figuur 1.

Protocol

1 Oprichting van PNIPAAm-gecoate platen

1. Los op in 2 ml van een 60% tolueen / 40% hexaanoplossing de 2,6 g PNIPAAm.
2. Verwarm het mengsel tot 60 ° C gedurende 10 minuten geroerd, totdat de PNIPAAm opgelost.
3. Snijd filtreerpapier in een 60 mm cirkel met een diameter en plaats papier in de Buchner-trechter.
4. Filtreer de oplossing door Buchner trechter in de vooraf gewogen glazen beker (gebruik geen kunststof, als hexaan kunststoffen smelten).
5. Plaats het bekerglas en de inhoud in een bel vacuüm (24 psi) O / N (16 uur). Let op: Tot het residu wordt omgezet met isopropyl zal oxideren dus zorg ervoor dat het niet in contact komt met zuurstof komen.
6. Weeg het bekerglas om het gewicht van de PNIPAAm vast.
7. Voeg isopropylalcohol aan de PNIPAAm, waardoor een 50/50 w / w oplossing.
8. Breng 2 ml van de oplossing op het oppervlak van de weefselkweekplaat en laag gedurende 5 minuten onder UV licht.
9. Was de plaat met 2 ml warm PBS tweemaalvoordat u voor celcultuur.

2 Oprichting van de Cel Sheets

Opmerking: Cell vellen primaire cellen voor het doelorgaan kan worden gemaakt met een aantal verschillende methoden, of door het bekleden weefselcultuuroppervlakken met thermo-responsieve polymeer zoals hier beschreven. Pre-coated thermo-gevoelige platen worden ook bij een aantal leveranciers.

Opmerking: Dit protocol is voor cultuur met behulp van een 35 mm schaal. In het kort worden cellen eerst geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ten minste 24 uur bij samenvloeiing zijdelingse verbindingen tussen aangrenzende cellen vastgesteld. Om celvellen vrijgeven, worden de platen blootgesteld aan temperaturen onder 32 ° C. De cellaag wordt dan overgebracht naar de sterke base vezelige matrix die een neovasculair permissieve hydrogel met vasculaire endotheelcellen.

1. Isoleer de celpopulatie. Opmerking: Deze methode is afhankelijk van de individuele procedures afleiding en het type cellen. Rat aorta gladde muSCLE cellen (RASMC) worden in dit voorbeeld. Dit zijn primaire gladde spiercellen geïsoleerd uit de abdominale aorta van een rat.
2. Was de cellen met 2 ml warm PBS.
3. Voeg 3 ml trypsine (of andere splitsen / disassociating oplossing) aan de cellen gedurende 5 minuten.
4. Remmen de trypsine door de toevoeging van 3 ml van het kweekmedium of fosfaatbufferoplossing (PBS) bevattende 10% foetaal runderserum (FBS).
5. Verzamel de cellen in een conische buis en telt een aliquot.
6. Draai de cellen bij 1000 rpm (228 xg) gedurende 5 minuten.
7. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in hun groei media (SmGM2 plus kogel kit kweekmedium wordt gebruikt voor RASMC).
8. Plaats het medium dat de cellen op een 35 mm thermisch gevoelige plate - PNIPAAm beklede plaat bij een concentratie die 100% confluentie te bereiken. Opmerking: Voor RASMCs werd dat aantal bepaald op 100.000 cellen / cm ² is. Vanwege celverlies tijdens het passeren, 120% van die va lue wordt gebruikt.
9. Plaatst in een incubator bij 37 ° CO / N. Opmerking: Het is belangrijk om de cellen te handhaven op 37 ° C om de celadhesie aan de plaat te handhaven.

3 Voorbereiding van Foundational Matrix

Opmerking: Verschillende 3D vezelachtige matrices kunnen worden gebruikt om sterke vezelachtige matrix laag tussen de delicate celvellen. Enkele voorbeelden zijn: Gelfoam, bioglas, natuurlijke materialen acellularized ²⁶ of nanospun materialen ^27,28 De varkens urineblaas matrix (UBM) die in deze studies werd royaal voorzien van onze medewerker, Dr Badylak ^29.

1. Voor gebruik bepalen matrix kenmerken, waaronder het gebrek aan cellulaire gehalte voor ontceld matrix wordt gebruikt, ^27,28 celspecifieke levensvatbaarheid en lege ruimte. ²²
2. Snijd de vooraf gesteriliseerde matrix in een gewenste grootte en vorm. Opmerking: Hier wordt een hole-punch gebruikt om een ​​4 mm cirkel diameter gesneden.

ve_title "> 4. Zaaien endotheelcellen in een Neovasculaire Tolerante Hydrogel

Opmerking: Endotheliale cellen kunnen worden verkregen uit diverse bronnen, waaronder differentiatie van stamcellen en progenitorcellen. Hier HUVEC gebruikt.

1. Gebruik een permissieve hydrogel (fibrine, collageen gels) zolang de verknoping is kort genoeg om de cellen levensvatbaar blijft. Opmerking: Hier, een hyaluronan (HA) gel verknoopt met een disulfidebrug wordt gebruikt.
2. Bereid de HA hydrogel overeenkomstig de vennootschap protocol.
3. Verzamel de endotheelcellen en verspreiden in een enkele cel oplossing met 1x trypsine. Opmerking: Accutase of Cell Dissociation Buffer kan ook worden gebruikt voor enkele cel dispersie.
4. Schakel de trypsine enzym met gelijkmatige sojaboon trypsine remmer (als het belangrijk dat cellen niet in contact met serum kan komen) of 10% FBS in PBS, het verzamelen van de oplossing / cellen in een 15 ml conische buis.
5. Conteer de cellen, en bereken de hoeveelheid die nodig is voor de patch afmetingen (voorheen gekwantificeerd). Opmerking: Voor een 4 mm patch, zijn hier 2 miljoen endotheelcellen gebruikt.
6. Extraheer 2 miljoen cellen en plaats in een nieuwe 15 ml conische buis.
7. Draaien op (228 xg) gedurende 5 minuten.
8. Zuig het supernatant, waardoor de cellen een pellet in een conische buis.
9. Meng de HA en gelatine vloeibare materialen in een 1: 1 verhouding. Voeg dan 80% van het totale volume in de conische buis met de pellet.
10. Resuspendeer de endotheelcellen in het 1: 1 HA / Gelatine mengsel
11. Plaats de gesuspendeerde cellen in de HA / gelatine mengsel in de basis vezelige matrix uit stap 2.
12. Voeg 1/5 (20 procent) van de totale gewenste van de verknoper volume
13. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.

5 Isolatie van de Cel Sheets

1. Verwijder de 35 mm PNIPAAm-behandelde platen die de cellen uit de incubator en in een celkweek kap bijRT.
2. Snel zuigen de media uit de cellen, en voeg 2 ml van 6% normale gelatine die tot 37 ° C is verhit.
3. Terwijl het nog warm gelatine, zet de metalen rooster in de gelatine, onder te dompelen onder het oppervlak van de normale gelatine (Film 1).
4. Plaats het gehele bord op ijs gedurende 5 tot 7 minuten, waardoor de gelatine uitharden.
5. Na 7 min, met een spatel de gelatine randen nauwkeurig scheiden van de zijkant van de plaat, en een tang om het metaalrooster van de plaat Opmerking lift: de 6% gelatine en de cellaag moet tillen met het rooster.
6. Verplaats de cellaag aan de schaal en boven op de basis vezelachtige matrix-hydrogel combinatie voorzichtig waarin het rooster bovenop het construct. Opmerking: de apicale zijde van de cellaag nog steeds in de bovenste positie.
7. Voeg 2 ml warm medium (37 ° C).
8. Incubeer O / N zodat het vel van de cellen om zich te houden aan de hydrogel oppervlak.
9. Verwijder thij metaalrooster na de oplossing opwarmt (ongeveer 1 uur) of de volgende dag.

Resultaten

Het stroomschema (figuur 1) toont de algemene werkwijze voor het maken het meerlagige patch. Cell vellen los van de PNIPAAm behandelde plaat laat vallen de temperatuur onder 32 ° C. Toen de cellaag wordt bovenop de verknoopte hydrogel die de endotheelcellen gezaaid in de onderliggende vezelachtige matrix (figuur 1). De voorbehandelde thermo-gevoelige platen kunnen ook worden gebruikt voor het maken van de celvellen. Speciale topologische oppervlakken worden gebruikt om specifiek patroon...

Discussie

De kritische stappen in het protocol zijn onder meer: ​​het coaten van de plaat oppervlakken met de warmteresponsieve polymeer en het manipuleren van de cel vellen na het afkoelen van de platen. Omdat verschillende cellen vertonen verschillende fysische eigenschappen, zoals kleefkracht, het opheffen tijd worden geoptimaliseerd voor elk ander celtype. De tweede, en meest significant uitdagende onderdeel van dit protocol, draait om het manipuleren van de cellaag, een cruciaal aspect van de methoden voor het weefsel montag...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Tolueen	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexaan	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsine	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filterpapier	Ahlstrom	6310-0900
Buchner trechter	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV-licht	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42