Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro cel-migratie en invasie assays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Migratieverschijnselen zijn een belangrijk kenmerk van levende cellen en essentieel voor normale ontwikkeling, immuunrespons en ziekteprocessen zoals kankermetastase en ontsteking. Methoden om celmigratie te onderzoeken zijn zeer nuttig en belangrijk voor een breed scala aan biomedisch onderzoek zoals kankerbiologie, immunologie, vasculaire biologie, celbiologie en ontwikkelingsbiologie. Hier gebruiken we tumorcelmigratie en -invasie als voorbeeld en beschrijven twee verwante assays om de meest gebruikte, gemakkelijk toegankelijke methoden te illustreren om deze processen te meten. De eerste methode is de wondsluitingstest in celcultuur waarbij een kras wordt gemaakt op een confluent celmonolayer. De snelheid van wondsluiting en celmigratie kan worden gekwantificeerd door met een regelmatige inversiemicroscoop op verschillende tijdsintervallen momentopnamen te maken. Gedetailleerder celmigratiegedrag kan worden gedocumenteerd met behulp van het time-lapse microscopiesysteem. De tweede methode die in dit artikel wordt beschreven, is de transwell celmigratie- en invasie-assay die het vermogen van celbeweeglijkheid en invasiviteit richting een chemo-attractant gradiënt meet. Het is ons doel om deze methoden op een zeer toegankelijke manier te beschrijven, zodat de procedures met succes kunnen worden uitgevoerd in onderzoekslaboratoria, zelfs alleen met een basisopstelling voor celbiologie.
Inleiding
Beweeglijkheid is een essentieel kenmerk van levende cellen. Celmigratie wordt betrokken bij het ontwerp van het leven, embryonale ontwikkeling, immuunrespons en vele pathologische processen zoals kanker metastase en ontsteking 1-9. Daarom methoden naar cel trekkende gedrag te bestuderen zijn zeer nuttig research tools voor een breed scala van disciplines in de biomedische wetenschappen, biologie, biotechnologie en aanverwante gebieden.
De studie van celmigratie in kankeronderzoek is van bijzonder belang als de belangrijkste doodsoorzaak bij kankerpatiënten is gerelateerd aan metastatische progressie. Om voor kanker door het hele lichaam te verspreiden en te verspreiden, moet kankercellen migreren en bedreigen via extracellulaire matrix (ECM), intravasate in de bloedcirculatie, hechten aan een verre plaats, en uiteindelijk extravaseren naar verre brandpunten 1,10-12 vormen. Verschillende biologische methoden kunnen worden toegepast om deze gebeurtenissen in detail te onderzoeken. De celkweek wond-sluiting eend de transwell migratie en invasie assays worden veel gebruikt in de wetenschappelijke gemeenschap 1,10. Deze tests kunnen de noodzakelijke gegevens die kunnen zorgen voor een goed begrip van hoe goed een bepaald celtype spontaan kunnen migreren of te reageren op een chemo-lokstof en directioneel migreren richting daarin te voorzien. Verschillende trekkende fenotypes beschreven. Cellen kunnen migreren in een enkele cel vorm, zoals te zien in mesenchymale of amoeboid-achtige beweging of door meercellige beweging bestempeld collectieve migratie of mobiele streaming 13. Werkwijze beweging in beweeglijke cellen kunnen gemakkelijk worden waargenomen met de celcultuur wondsluiting assay.
Onder de talrijke manieren om celmigratie te bestuderen, de cel wondsluiting assay is een van de eenvoudigste. Deze werkwijze is nuttig om de migratie vermogen van gehele cellen massa bepalen. Wanneer genomen een stap verder kan worden gebruikt om de morfologische kenmerken individuele cel te observeren tijdens de migratie 14. Na de analyse van de wondsluiting vele fenotypes kan worden geopenbaard. Het meten van de gesloten afstand in de tijd bij het vergelijken met een controlegroep kan specifieke migratie verandert of een verminderde trekkende fenotype die voorheen onbekend was onthullen. Bovendien kunnen enkele cel lamellipodium vorming, staart intrekken en gerichte beweging aanwijzingen voor wat kan verminderd of versterkt in de cellen van belang 14 geven.
De transwell migratie en invasie assays kunnen worden gebruikt om het vermogen van enkelvoudige cellen tot directioneel reageren op de verschillende chemo-aantrekkende of zij chemokines, groeifactoren, lipiden, of nucleotiden 4,5,8,15,16 analyseren. Het kan ook differentiële vermogen tot migratie te beoordelen als gevolg van de over-expressie van een receptor 1,14. Deze testen kunnen ook worden gebruikt om de belangrijkste regulatoren van celmigratie zoals de Rho familie van kleine GTPases 2 te identificeren en karakteriseren. Na deze korte en gemakkelijk acceslijk proeven en de wijze van celmigratie en het vermogen van een cel binnen te dringen in een 3-D-matrix kan ook worden vastgesteld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cell Culture Wound Closure Assay
- Los cellen uit de weefselkweek plaat met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Pellet cellen in een 15 ml conische buis door centrifugeren, het supernatans aspireren, en opnieuw te schorten cellen in cultuur media. Plate het juiste aantal cellen in een 6-wells plaat 100% confluentie in 24 uur.
Opmerking: Tests nodig zijn om de tijd en aantal cellen 100% samenvloeiing bereiken door het celtype en de omvang van de put wordt gebruikt bepalen (bijvoorbeeld 1 x 10 6 B16F10 melanoma cellen worden gezaaid in een putje van een 6-well platen 24 uur voor de wond generatie). Alternatief kan 12 putjes of 24 putjes gebruikt.
Opmerking: Indien beschikbaar, kunnen cellen in een cultuur-Insert (vanaf ibidi LLC) worden gezaaid op een behandeld weefselkweek plaat maken de wond pre-gegoten. Een cultuur-Insert kan het oppervlak van de weefselkweek plaat te beschermen tegen schade veroorzaakt door de pipet tip. Als een cultuur-Insert wordt gebruikt weglaten stap1.2. - In een steriele omgeving (meestal een bioveiligheid kap) maken gebruik van een 200 ul pipet tip om stevig tegen de bovenkant van de weefselkweek plaat en snel maken een verticale wond naar beneden door de cel monolaag. Een verschillende grootte pipetpunt kan worden gebruikt om de wond grootte die gewenst maken. Niet te veel kracht te gebruiken tegen de weefselkweek plaat met de pipet tip als het het oppervlak kunnen beschadigen. Als de wond vooraf gegoten, kan deze stap worden overgeslagen.
- Aspireren de media en mobiele puin zorgvuldig. Genoeg kweekmedia Voeg langzaam tegen de putwand de bodem van de put te dekken en te voorkomen losmaken extra cellen. Na de generatie en de inspectie van de wond een eerste beeld moeten worden genomen. Plaats de weefselkweek plaat in een incubator ingesteld op de geschikte temperatuur en CO2-concentratie (gewoonlijk 37 ° C en 5% CO2).
- Op verschillende tijdstippen, bijvoorbeeld elke 3 uur, verwijder de plaat uit de incubatof en plaats het onder een omgekeerde microscoop om een momentopname foto te nemen en te controleren op wondsluiting. Indien een time-lapse microscopie beschikbaar is, neem een foto elke X aantal minuten (meestal beginnend met elke 5 minuten) voor een tijdsduur in een temperatuur-en CO 2-geregelde kamer. Afhankelijk van het celtype kan wondsluiting variëren.
- Om de resultaten van snapshot foto's te analyseren, meet de afstand van de ene kant van de wond naar de andere met behulp van een schaal bar. Te analyseren en duidelijk aanwezig wondsluiting na verloop van tijd met behulp van een spreidingsdiagram of staafdiagram, bijv. figuur 1.
- Om de time-lapse foto's te analyseren, importeert u de foto's in de ImageJ software (vrij verkrijgbaar bij http://rsb.info.nih.gov/ij/) om een video te maken. Om deze open ImageJ doen, klikt u op Bestand, Importeren en Image Sequence. Zoek het bestand met foto's; Klik op de eerste foto in het bestand. Besparen video door Bestand, Opslaan als, en AVI. Single migrerende cellen kunnen worden waargenomen aan characterize gerichte beweging. Bovendien kunnen morfologische kenmerken zoals lamellipodia vorming en achterrand terugtrekking ook bestudeerd (Figuur 2 en de aanvullende video).
2. Transwell Cel Migratie en invasieanalyse
- In een steriele (gewoonlijk een bio kap) los cellen uit de weefselkweek plaat met een niet-enzymatische cel dissociatie buffer of 0,25% trypsine-EDTA, pellet cellen door centrifugeren, en zuig de bestaande media waardoor de gepelleteerde cellen. Re-schorten cellen in serum vrije media voor celkweek met 0,1% BSA (bovine serum albumine).
Opmerking: Afhankelijk van de cellijn onderzocht 0.25% trypsine-EDTA celmigratie en invasie beïnvloeden door de splitsing van diverse receptoren op het celoppervlak 17.
Opmerking: Het aantal cellen per ml afhankelijk van de grootte van de cellen. Verdere tests kunnen nodig zijn om een seeding dichtheid die pro vindenVides de beste resultaten. Meestal 1 x 10 6 cellen / ml is een goed uitgangspunt voor de meeste celtypen bij gebruik van de 24-well Transwell voegen. Er is een scala van Transwell insert afmetingen en het aantal toegevoegde cellen worden dienovereenkomstig aangepast. - Plaat 100 pl celoplossing bovenop het filtermembraan in een transwell inzetstuk en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 om de cellen te vestigen.
Opmerking: het poriegrootte van de transwell gebruikte membraan is afhankelijk van de individuele grootte van de cellen in het monster. Bijvoorbeeld, als de cellen te klein ook passeren door de poriën zonder migratie te vergemakkelijken of als ze te groot zij past niet door de poriën. Er zijn verschillende Transwell inzetstukken poriegrootten die variëren van 3 urn, 5 um en 8 urn voor celmigratie testen. De transwell inserts zijn verkrijgbaar bij bedrijven zoals Corning.
Opmerking: De transwell migratie test kan eenvoudig worden aangepast om de cel invasie assay. Hiertoe voeg extracellulaire matrix (ECM) materiaal bovenop de transwell membraan cellen en voeg vervolgens bovenop de ECM. Zo wordt Matrigel ontdooid en vloeibaar op ijs en vervolgens 30-50 gl Matrigel wordt toegevoegd aan een 24-well transwell invoegen en gestold in een 37 ° C incubator gedurende 15-30 minuten een dunne gellaag gevormd. Celoplossing toegevoegd bovenop de Matrigel coating te simuleren invasie door de extracellulaire matrix.
Let op: Er zijn duidelijke verschillen tussen de transwell cel migratie en de transwell celinvasie assays. De transwell cel migratie assay meet de chemotactische vermogen van cellen in de richting van een chemo-lokstof. De Transwell invasie assay echter meet zowel chemotaxis en de invasie van cellen door extracellulaire matrix, een proces dat gewoonlijk wordt gevonden in kanker metastase of embryonale ontwikkeling. - Met behulp van een pipet, zeer carefully voeg 600 ul van het gewenste chemo-attractant in de bodem van de onderste kamer van een 24-wells plaat. Voeg de chemo-lokstof zonder het verplaatsen van de transwell insert en vermijd het genereren van bubbels. Controleer de chemo-attractant vloeistof in de bodem goed contact maakt met het membraan in de bovenste put een chemotactische gradiënt vormen. Incubatietijd is afhankelijk van celtype en chemo-attractant gebruikt.
Opmerking: Verdere tests nodig zijn om de incubatietijd te bepalen.
Opmerking: Voor hechtende cellen, zal de gemigreerde cellen hechten aan de andere zijde van het membraan 1,8. De kwantificering van gemigreerde cellen kunnen worden uitgevoerd als volgt 2,4-2,8 (2,4-2,8 stappen hoeven niet in een steriele omgeving worden uitgevoerd). Voor niet-hechtende cellen, zal de gemigreerde cellen vallen in de media in de onderste kamer. Het aantal gemigreerde cellen kunnen worden geteld met behulp van hemocytometer of stromingscytometer 5. - Verwijder de transwell insert van de plaat. Gebruik een wattenstaafje zo vaak als nodig is om de media en de resterende cellen die niet zijn gemigreerd van de bovenkant van het membraan zonder beschadiging zorgvuldig verwijderen.
- Voeg 600-1000 ul van 70% ethanol in een putje van een 24-wells plaat. Plaats de transwell inzetstuk in de 70% ethanol gedurende 10 minuten naar cel fixatie mogelijk te maken. Verwijder Transwell insert uit de 24-wells plaat en gebruik een wattenstaafje om de resterende ethanol uit de bovenkant van het membraan te verwijderen. Laat de transwell membraan drogen (gewoonlijk 10-15 minuten).
- Voeg 600-1000 ul van 0,2% kristalviolet in een putje van een 24-wells plaat en plaats het membraan in het voor kleuring. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
- Verwijder voorzichtig de kristalvioletoplossing vanaf de bovenkant van het membraan met een pipet tip of wattenstaafje. Heel voorzichtig, om te voorkomen dat het wassen af vaste cellen, dompel de membraan in gedistilleerd water zo vaak als nodig is om het overtollige kristal viole verwijderent. Laat de transwell membraan te drogen.
- Alles onder een omgekeerde microscoop en tel het aantal cellen in verschillende gezichtsveld gemiddeld bedrag cellen dat gemigreerd door het membraan naar de chemo-attractant en bevestigd aan de onderzijde van het membraan (Figuur 3) krijgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De wondsluiting assay en de transwell celmigratie test hier gepresenteerd werden uitgevoerd met muizen B16F10 melanoma cellen als modelsysteem. In de wondsluiting test werden B16F10 cellen uitgezaaid in 6-well weefselkweek plaat en gekweekt tot 100% confluentie in 24 uur. Een wond van ongeveer 700 micrometer breed werd gegenereerd met behulp van een pipet en de sluiting van de wond (cel migratie) werd opgenomen met de time-lapse microscopie. Als alternatief kan wondsluiting ook bestudeerd worden door het nemen van momen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Celmigratie is een belangrijk aspect voor een studie in kankeronderzoek en het kan ook worden toegepast voor ontwikkeling, immunologische en wondgenezing studies. De celkweek wondsluiting assay en de transwell celmigratie en invasie assays tonen details cel migrerende gedrag en kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van celmigratie 1,2,10,14 onderzoeken. Onze studie gebruikte deze cel beweeglijkheid assays om de migratie snelheid en invasie mogelijkheden van een B16F10 melanoomcellijn bepalen.
...Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Mike Myles, Sam Saunders en C.W. Elton van de ECU Multimedia & Technology Services voor hun hulp bij de videoproductie. We erkennen de subsidieondersteuning van North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association en ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. en M.J.R.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Opgelost in water bij 0,2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalognummer varieert afhankelijk van het type kweekplaat |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalognummer varieert afhankelijk van de poriegrootte van de membraan |
Referenties
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
