Simuleren Pancreatic Neuroplasticity:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neuron Plasticiteit Assay

Samenvatting

Neuronale plasticiteit is een steeds meer erkend, maar onvoldoende duidelijk kenmerk van de gastro-intestinale (GI) stelsel. Hier, in het voorbeeld van menselijke pancreas aandoeningen presenteren we een in vitro assay neuroplasticiteit voor de studie van neuronale plasticiteit in het maagdarmkanaal, zowel morfologisch en functioneel niveau.

Samenvatting

Neuroplasticiteit is een inherent kenmerk van het enterische zenuwstelsel en gastro-intestinale (GI) innervatie onder pathologische omstandigheden. Echter, de pathofysiologische rol van neuroplasticiteit in GI-aandoeningen blijft onbekend. Nieuwe experimentele modellen die simulatie en modulatie van GI neuroplasticiteit toe kunnen verbeterde waardering voor de bijdrage van neuroplasticiteit in het bijzonder GI ziekten zoals pancreaskanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) in te schakelen. Hier presenteren we een protocol voor de simulatie van de pancreas neuroplasticiteit onder in vitro omstandigheden met behulp van pasgeboren ratten ganglia (DRG) en myenterische plexus (MP) neuronen. Deze dual-neuron aanpak het mogelijk om niet alleen de monitoring van zowel orgel-intrinsieke en extrinsieke-neuroplasticiteit, maar vertegenwoordigt ook een waardevol instrument om neuronale en gliale morfologie en elektrofysiologie beoordelen. Bovendien maakt de functionele modulatie van de meegeleverde micro-omgeving van de inhoud voor het bestuderen van hun IMPACt op neuroplasticiteit. Eenmaal vastgesteld, de onderhavige neuroplasticiteit test draagt ​​de potentieel van toepassing op de studie van neuroplasticiteit in elk GI orgaan.

Inleiding

Veranderingen in gastro-intestinale (GI) zenuw morfologie en dichtheid hebben de aandacht van gastro-enterologen en pathologen gevangen voor een lange tijd, maar het belang daarvan voor de pathofysiologie van GI-aandoeningen blijft onbekend ^1-3. Sterker nog, een aantal zeer gemeenschappelijke GI aandoeningen zoals gastritis, refluxoesofagitis, colitis, diverticulitis en appendicitis worden geassocieerd met een verhoogde innervatie dichtheid in ontstoken weefsel gebieden ^1. Er is echter geen echte aandacht tot nu toe besteed aan de mechanismen en de betekenis van neuroplasticiteit in het maag-darmkanaal. Heeft morfologisch veranderde GI zenuwen afwijken van de normale GI zenuwen, dat wil zeggen de normale toestand van het enterische zenuwstelsel, in termen van hun functie? Wat zijn de gevolgen van veranderde neuropeptide / neurotransmitter inhoud in plastic enterische zenuwen? Ofwel perifere neuroplasticiteit brengen altijd veranderde signalering naar het centrale zenuwstelsel? En waar zijn de centrale projecties van plastic extriNSIC GI zenuwbanen? Een lange reeks van dergelijke belangrijke vragen kunnen eenvoudig worden gegenereerd als we kijken naar het gebrek aan kennis over de functionele aspecten van GI neuroplasticiteit.

De studie van GI neuroplasticiteit op functioneel niveau vereist geldige, reproduceerbare en nog steeds gemakkelijk toepasbaar experimentele modellen. In een tijdperk van toenemende populariteit en acceptatie van genetisch gemanipuleerde conditionele muismodellen (GECoMM), zoals in vivo instellingen dragen het potentieel om voorheen onbekende facetten van GI neuroplasticiteit te ontrafelen in een realistische manier ^1. Echter, het ontwerp en de productie van GECoMM blijft duur, arbeidsintensief en vooral tijdrovend. Bovendien, ze vereisen het a priori selectie van de doelstelling om voorwaardelijk worden gemoduleerd in de genetisch veranderde muis (zoals transgene overexpressie van zenuwgroeifactor / NGF in enterische epitheelcellen). Vandaar dat voor de desIGN van een succesvolle GECoMM, onderzoekers moeten sommige indicatoren (bv. vorige experimentele gegevens) van een waardevol doel, dat wil zeggen dat het molecuul van belang (hier NGF) ten minste kan worden verwacht om een aantal biologisch relevante effecten op de GI zenuwen uitoefenen.

Dergelijke indicatoren kunnen eenvoudig worden afgeleid uit geschikte in vitro modellen waarin geïsoleerde cel subtypes van het complex micromilieu van een in vivo systeem selectief kan worden gekweekt samen op heterotypische wijze ^4-7. De modulatie van eiwitten in dergelijke heterotypische cultuur instelling gemiddeld minder technisch omslachtig, sneller, en derhalve helpen bij het ​​voorfilteren van nuttige doelen voor verificatie in vivo studies.

Onlangs presenteerden we een in vitro neuroplasticiteit assay die werd ontworpen om te simuleren het verhoogde neurale dichtheid en hypertrofie van intrapancreatic nerves in menselijke alvleesklierkanker (PCA) en chronische pancreatitis (CP) weefsels. Hier neuronen afgeleid van pasgeboren rat dorsale wortel ganglia (DRG) of myenterische plexus (MP) werden blootgesteld aan weefselextracten van chirurgisch weggesneden PNA CP weefsels specimens en vergeleken met die gekweekt in normale humane pancreas (NP) weefselextracten ^5. In plaats van weefsel extracten, kan men ook gebruik maken van cellijn bovenstaande vloeistoffen om de impact van geselecteerde celtypen op neuroplasticiteit te bestuderen. In combinatie met een gestandaardiseerde morfometrische meting de gepresenteerde neuroplasticiteit test kan bruikbaar en reproduceerbare beoordeling van neuronale plasticiteit in reactie op verschillende micro-omgevingen alvleesklier. In het bijzonder, kan de simulatie van 1) morfologische neuroplasticiteit, dus de veranderingen in de neuriet uitgroei, vertakking en neuronale maat, en 2) functionele neuroplasticiteit, dus veranderingen in de prikkelbaarheid van perifere neuronen. Bovendien zijn niet alleen randapparaat (dwz Enterische), maar ook centraal (bijv. DRG en tweede orde spinale) neuronen kunnen in de onderhavige bepalingsmethode hun morfologische en functionele reactie op verschillende inhoud GI weefsel te beoordelen. In de huidige video tutorial laten we zien het technisch protocol voor het uitvoeren van deze test en bespreken de voordelen en zwakke punten. In het bijzonder vestigen wij de aandacht op de toepasselijkheid van de fundamentele notie van deze test aan de studie van neuroplasticiteit in een GI orgel.

Protocol

Alle dierlijke experimentele procedures in het protocol volgen het dier zorg richtlijnen van Technische Universität München, Duitsland.

1. Media / Extract Voorbereiding

1. Tissue homogenisering
   De kwaliteit van het weefsel homogenisering is cruciaal voor de daaropvolgende detectie van plastische veranderingen in de gekweekte neuronen. Hier wordt een homogenisator aanbevolen waardoor weefsel dissociatie mogelijk maakt zonder grote toename van de weefseltemperatuur.
   1. Transfer 5 mm x 5 mm x 5 mm blokjes pancreas weefsel direct van -80 ° C tot vloeibare stikstof en in een vaste fase in het weefsel homogenator. De ideale homogenator zou het weefsel snel genoeg distantiëren, zonder dat het te ontdooien.
   2. Onmiddellijk na dissociatie, resuspendeer de vaste, poedervormige homogenaat in 300-500 gl 0,1 x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Hier, gebruik geen lysis buffer (zoals RIPA) aangezien dit kan de neuronen lyseren.
   3. Centrifugeer de homogenaten gedurende ten minste 15 minuten op de maximale snelheid van uw bank centrifuge (bijv. 21.130 xg). Verzamel de heldere bovenstaande vloeistof, die het weefsel extract vertegenwoordigt.
2. Cellijn supernatanten
   1. Laat de cellen van belang ten minste 70 te bereiken - 80% samenvloeiing in normale groeimedium.
   2. Meestal zijn deze media bevatten serumcomponenten en kunnen oncontroleerbare effecten uitoefenen op de groei van neuronen. Daarom, na het bereiken van de gewenste cel dichtheid, was uw cellen minstens 3x met celcultuur graad PBS en plaats ze in serum-vrij medium (SFM) voor maximaal 48 uur.
      Opmerking: Hier, van mening dat sommige cellen (zoals alvleesklier stellaatcellen) serum kan nodig zijn in hun groei media om hun normale toestand en structuur te behouden. In dat geval voeren seriële verdunningen van het serum in het medium van de cel van belang om een ​​zo laag mogelijke serumgehalte noodzakelijk intacte cel functio voorbeeldn.
   3. Meet de eiwitconcentratie van het weefsel homogenaat of celsupernatanten via Bradford eiwittest. Hoewel deze waarden afhankelijk van het weefsel en celtype, voor alvleesklier weefselextracten, zou een concentratiebereik van 5-12 ug / ul verwacht, en cellijn supernatanten van 3-8 ug / ul.

2. Aliquot Extracten en celsupernatanten

Afhankelijk van de concentratie voor gebruik in de test, moet de uiteindelijke concentratie van het extract of supernatant in neuronale medium 100 ug / ml ^5,8.

Opmerking: Voor een test met neuronen groeien in 500 pi medium in elk putje van een 24-well plaat, moet men 50 ug eiwit uit elk extract of supernatant per putje. Bij een typische extract concentratie van ongeveer 10 ug / ul, zou een 5 pl extract / supernatant nodig voor elke wel. In elke setting uitgevoerd als een drievoud, zou dit overeenkomen met 15 ul extract / supernatant. Voor verschillende weefsel of celtypen, voeren seriële verdunningen van het uiteindelijke extract of de concentratie supernatant en de waargenomen neurotrofe effecten tussen verschillende concentraties extract / supernatant vergelijken.

3. Isolatie van neuronen

Zodra de collectie extract / supernatant klaar is, doorgaan met isolatie van neuronen.

1. Voor DRG neuronen, het verzamelen van de cervicale lumbale DRG van pasgeboren ratten tussen postnatale dag (P) 2-12 na onthoofding en stereomicroscopic dissectie van DRG (figuur 1A). Om voldoende DRG neuronen hebben voor een 24-well plaat, verzamel alle cervicale lumbale DRG van een pasgeboren rat (gelijk aan 52 DRG) per plaat.
   1. Knip de perifere (neurale) en centrale projecties (wortels) van DRG door middel van microscissors.
      Het verlaten van de projecties in plaats belemmert aanwrijven en verhoogt thij contaminatie risico van cultuur door de fibroblasten.
2. Voor MP neuronen, weggesneden het mesenterium van de dunne darm en de hand voorzichtig strip uit de seromuscular laag van de dunne darm (voor een gedetailleerd protocol op MP isolatie, zie Schäfer et al.. ^9, figuur 1B). Voor MP, het verzamelen van de plexus van twee ratten per 24-well-plaat.
   Opmerking: Probeer zo zacht mogelijk zijn om scheuren in de seromuscular laag te vermijden, omdat zij de succesvolle scheiding van de dunne darm te belemmeren.
3. Verzamel de DRG en seromuscular laag in ijskoud minimaal essentieel medium (MEM) met gentamicine (20 mg in 500 ml medium) en metronidazol (2.5 mg in 500 ml medium) geleverd.
4. Na verzameling van DRG, broeden ze in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met collagenase type II gedurende 20-30 min. geleverd. Voor MP isolatie incuberen bij type collagenase tussen 1-3 uur, afhankelijk van de leeftijdvan het dier (figuur 1C).
5. Voor MP, het verzamelen van de netto-achtige MP stukken onder stereomicroscoop en transfer naar ijskoude MEM.
6. Vermaal dan de DRG en MP door spuiten met afnemende diameter.
   Opmerking: Overmatige fijnwrijving kan de neuronen vernietigen, maar minder de gliacellen.
7. Zodra het medium dat de DRG of MP is geworden bewolkt, centrifuge de suspensie bij 93,9 g gedurende 5 min, gooi het medium en resuspendeer in Neurobasal medium (aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 0,5 mM L-glutamine en 2% B-27).
8. Tel het aantal cellen (bijvoorbeeld neuronen en glia) door middel van een hemocytometer.
   Opmerking: Het aantal benodigde cellen is afhankelijk van de parameter meting. Voor de kwantificering van neurieten dichtheid, moet men dichter culturen en dus een groter aantal cellen dan voor het meten van neuriet uitgroei perikaryonal maaten vertakking van individuele neuronen. Voor metingen neuriet dichtheid, gebruik bijv. 10.000 cellen (neuron + glia) / goed of 1500 neuronen / goed. Voor morfometrie op individuele neuronen, kort (1 minuut lang) trypsinatie van cellen en het zaaien van 2500 cellen / putje of 400 neuronen / goed wordt aanbevolen. De typische opbrengst van cellen verkregen van een rat is ongeveer 300.000-500.000 cellen.
9. Zaad de cellen op 13 mm dekglaasjes die eerder bekleed nacht en boven de putjes met Neurobasal medium (gesupplementeerd met 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 0,5 mM L-glutamine en 2% B-27) (Fig. 1D).
   Opmerking: Gebruik poly-D-lysine (40 mg / m ²⁾ OR-ornithine en laminine beklede (1 mg / ml elk) beklede dekglaasjes. Cellen hechten aan poly-D-lysine zeer snel, waardoor het geschikt is voor experimenten waarin vele cellen nodig (bijvoorbeeld neurieten dichtheidsmetingen). Gehechtheid aan laminin is in het algemeen een aantalwat zwakker, maar laminine is een sterke promotor van neuriet uitgroei. Daarom, voor metingen op neuronale vertakking en neurieten lengte liever ornithine / laminine-coating.
10. Toestaan ​​dat de cellen hechten aan de putjes 's nachts. Op de volgende dag bereiden extract aangevuld medium (in een eindconcentratie extract / supernatant van 100 ug / ml).
11. Zuig het zaaien medium, en het uitvoeren van een optionele, zeer zacht wassen met PBS, en dan langzaam pipet het extract /-supernatant aangevuld media (figuur 1E).
12. Laat de cellen groeien voor 48 uur. Zuig de media en vast te stellen in 4% paraformaldehyde voor immuunkleuring (Figuur 1F).
13. Voer dubbele immunofluorescentiekleuring behulp neuron-specifieke (bijv. beta III-tubuline) en glia-specifieke (bijv. gliale fibriallary zure eiwit / GFAP) markers (figuur 1G).
14. Voor morfometrie, gebruiken een omgekeerde lichtmicroscoop uitgerust met een CCD-camera in combinatie with geautomatiseerde software die meting van neuriet dichtheid mogelijk maakt (zie tabel).
15. De neurite dichtheid van neuronale culturen wordt gemeten op 4-5 representatieve microfoto bij 200x vergroting van 4 verschillende regio's van dichtste groei op elke dekglaasje door overlappen een 50 micrometer x 50 micrometer raster en het tellen van de vezel dichtheid per vierkante gemeten in de kruisende vezels. Neurietuitgroei, gemiddeld aantal takken per neuron, kan de gemiddelde tak lengte en perikaryonal maat worden gemeten van willekeurig geselecteerde 30 solitaire neuronen uit elke dekglaasje door het markeren van de neurieten en perikarya (Figuur 1H).

Resultaten

Morfologische neuroplasticiteit

In de aangegeven leeftijd van pasgeboren ratten (P2-12) en het zaaien dichtheden, MP en DRG neuronen reeds zeer neuronale netwerken op te bouwen na 48 uur (Figuur 2A). Vergelijking van neuriet dichtheid tussen neuronen gekweekt in prostaatkanker, CP, en NP extracten onthult groter neurite dichtheid van DRG neuronen in APC of CP-extracten dan in NP extracten (Figuur 2A) ^5. We hebben vooral de voorkeur MP neu...

Discussie

Het huidige protocol is bedoeld om de methode te illustreren achter de in vitro alvleesklier neuroplasticiteit test die onlangs werd ontwikkeld door onze groep om de mechanismen van neuroplasticiteit te bestuderen in PCa en CP ^5. Het protocol omvat een driedaagse procedure die gemakkelijk kan worden aangebracht nadat de uitvoerder voldoende ervaring in de isolatie en de cultuur van DRG en MP neuronen heeft opgedaan. Bovendien vormt het een waardevol instrument voor het bestuderen van de gelijktijdige...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1149
Ornithine/laminin	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Coverslips	Merck		Voor gebruik in 24-well platen
Dismembranator S	Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin-antilichaam	Millipore	MAB1637	1:200 concentratie
Anti-GFAP-antilichaam	DAKO	M0761	1:400 concentratie
RIPA buffer + protease remmer			Elke leverancier
Neurobasal medium	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Supplement	Gibco/Life Sciences	17504044	De kwaliteit van B-27 is bekend om afhankelijk te zijn van het lotnummer
Gentamicin/Metronidazol			Elke leverancier
Minimal essential medium	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	Verbetert collagenase-activiteit wanneer het Ca/Mg bevat
Collagenase type II	Worthington Biochemical	CLS-2	Verkrijg partij met minimaal 200 U/mg activiteit
Trypsin-EDTA 0,25%	Gibco/Life Sciences	25200056
4% Paraformaldehyde			Elke leverancier
analySIS docu software	Olympus