Ablatie van een enkele cel van acht-cel embryo&#39;s van Amphipod Crustacean<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Samenvatting

De amphipod Parhyale hawaiensis is een veelbelovend model organisme voor studies van schaaldieren embryologie en vergelijkende geleedpotigen ontwikkeling en evolutie. Dit protocol beschrijft een methode voor het handmatig verwijderen van enkele blastomeren van vroeg decollete stadium embryo's van Parhyale.

Samenvatting

De amphipod Parhyale hawaiensis is een klein schaaldier gevonden in intertidale mariene habitats wereldwijd. In het afgelopen decennium, heeft Parhyale ontpopt als een veelbelovende modelorganisme voor laboratoriumonderzoek van ontwikkeling, een nuttig outgroup vergelijking met de goed bestudeerd geleedpotige modelorganisme Drosophila melanogaster. In tegenstelling tot de syncytieel splitsingen van Drosophila, de vroege breuklijnen van Parhyale zijn holoblastic. Lot in kaart brengen met behulp van tracer kleurstof ingespoten in de vroege blastomeres hebben aangetoond dat alle drie de kiem lagen en de kiembaan worden vastgesteld door de acht-cellig stadium. In dit stadium zijn drie blastomeren gedoemd aanleiding geeft tot het ectoderm, drie gedoemd aanleiding geeft tot het mesoderm, en de resterende twee blastomeren zijn de voorlopers van het endoderm en kiemlijn respectievelijk. Echter, blastomere ablatie experimenten aangetoond dat Parhyale embryo belangrijke regulerende capabiliti bezitten ookes, zodanig dat het lot van blastomeren geablateerd bij de acht-cellig stadium kan worden overgenomen door de nakomelingen van enkele van de resterende blastomeren. Blastomeer ablatie is eerder beschreven door een van twee methoden: injectie en daaropvolgende activatie van fototoxische kleurstoffen of handmatige ablatie. Echter, fotoablatie doodt blastomeren, maar niet de dode cel lichaam te verwijderen van het embryo. Volledige fysische verwijdering van specifieke blastomeren kan daarom een ​​voorkeurswerkwijze ablatie voor sommige toepassingen. Hier presenteren we een protocol voor handmatig verwijderen van enkele blastomeren van de acht-cellig stadium van embryo Parhyale illustreren de instrumenten en handmatige procedures voor volledige verwijdering van het cellichaam terwijl de resterende blastomeren levend en intact. Dit protocol kan worden toegepast op elk Parhyale cel acht-cellig stadium, of blastomeren andere vroege stadia splitsing. Bovendien, in beginsel dit protocol voor vroege reini kanvage stadium embryo's van andere holoblastically klieven ongewervelde zeedieren.

Inleiding

De amphipod schaaldier Parhyale hawaiensis heeft in het afgelopen decennium ontpopt als een veelbelovende modelorganisme met een groot potentieel voor gebruik in de evolutionaire ontwikkelingsbiologie onderzoek ^1. Onder de geleedpotigen, meest modelsystemen insecten en de meest uitgebreid bestudeerde van deze is de fruitvlieg Drosophila melanogaster. D. melanogaster is een lid van de insectenorde Diptera, en als zodanig laat verschillende embryologische functies die zijn afgeleid met betrekking tot die van basaal vertakking insecten ^2. Bovendien zijn insecten genest binnen de subphylum Pancrustacea ^3, betekent dat insecten hun naaste verwanten in de "natuurlijke" group langdurige genoemd pancrustaceans en dat deze groep paraphyletic. Dit suggereert dat naast basaal vertakking insecten modellen, zijn studies van andere schaaldieren vereist om een ​​breder zicht op de evolutionaire geschiedenis van de ontwikkelingskarakteristieken krijgen eennd moleculaire mechanismen die zijn zo goed bestudeerd in D. melanogaster. Maar heel weinig schaaldieren zijn goed ingeburgerd voor experimentele laboratoriumanalyse van ontwikkeling. De amphipod P. hawaiensis is een zeer handelbaar laboratoriummodel systeem vatbaar voor een aantal experimentele technieken. Amphipoden weer vele unieke eigenschappen binnen hun ouder superorder Peracarida (strand hoppers, Scuds, en goed garnalen), en worden daarom gedacht dat relatief afgeleid worden binnen deze groep van kreeftachtigen. Toch is de relatieve gemak van embryologische en functionele genetische manipulatie aangeboden door Parhyale maken dit amphipod een waardevolle aanvulling op de huidige inventaris van modelorganismen.

Als een proefdier, P. hawaiensis biedt vele voordelen. Dieren zijn tolerant voor een breed scala aan temperaturen en zoutgehaltes, en te overleven goed in de grote culturen van kunstmatig zeewater ^1. Het is gemakkelijk om tuss onderscheidenEEN mannen en vrouwen op basis van duidelijke morfologische verschillen, met name, de grote, verslaafd, voorste romp appendages die mannetjes gebruiken om de vrouwtjes te grijpen tijdens de paring. Voor embryologische en ontwikkelingswerk, P. hawaiensis heeft een aantal zeer aantrekkelijke eigenschappen. Embryogenese duurt ongeveer 10 dagen en de tijd om geslachtsrijp is ongeveer zes weken bij 28 º C (maar let op dat Parhyale overleeft goed bij temperaturen van ongeveer 20-30 º C, en dat nadere ontwikkelingsstoornissen enscenering informatie is beschikbaar voor embryo verhoogd bij 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, en 26 º C ^5,6). Volwassenen paren het hele jaar door in het laboratorium, zodat de embryo's zijn beschikbaar op elk moment van het jaar. Vrouwtjes 2-20 (afhankelijk van de leeftijd van de vrouw) bevruchte eieren in een ventrale broedbuidel gelegen tussen de eerste verscheidene paren benen (Figuren 1A en 1B), en het is mogelijk deze embryo verzamelens zeer vroeg in de ontwikkeling zonder het doden van de vrouw of beschadiging van de embryo's (figuur 1C). De embryo's overleven in gefilterd kunstmatig zeewater tot aan het uitkomen, voor daaropvolgende genexpressie of histologische analyse ⁷ kan worden vastgesteld, en een gedetailleerde stagingtabel maakt nauwkeurige identificatie van de vooruitgang door ontwikkeling ^5. Robuuste protocollen zijn gebruikt om genexpressie analyse uit te voeren door in situ hybridisatie ^8-15 of immunokleuring ^4,16,17, functionele knockdown door RNA interferentie ^13,15 of morfolino ¹² en stabiele kiemlijn transgenese ^18. De transgenese systeem, induceerbare expressie ¹⁴ en enhancer trap ¹⁹ werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om genfunctie in P. onderzoeken hawaiensis. Terwijl een openbaar genoomopeenvolging is momenteel niet beschikbaar, een transcriptome met transcripten geproduceerd tijdens oögenese en embryogenese heeft been de novo geassembleerd en geannoteerd ^20, en gedeponeerd in een doorzoekbare database ^21, faciliteren genontdekking. Kortom, blz. hawaiensis is een zeer soepel model organisme geschikt voor meerdere experimentele en genetische benaderingen voor het begrip ontwikkeling.

In tegenstelling tot de eerste syncytieel splitsingen D. melanogaster, P. hawaiensis embryo's kleven holoblastically na de bevruchting (Figuur 2A). Lineage tracing analyse heeft aangetoond dat door het derde splitsing, elk van de derde splitsing blastomeren is speciaal voorbestemd aanleiding geeft tot een van de drie kiemlagen of germinale ⁶ (figuur 2B). Deze gegevens, samen met de microarray data ^22, cellijn analyseert ^6,23 en blastomere isolatie experimenten ⁴ hebben gesuggereerd dat ontwikkelings mogelijkheden zijn gescheiden op zijn minst enige derde splitsing blastomeres door asymmetrische erfenis van cell lot determinanten. Dienovereenkomstig, in blastomeer ablatie experimenten waarin de kiembaan precursor (aangeduid met "g" in de Parhyale cellijn nomenclatuur ⁶⁾ werd onder de acht cel stadium embryo ontbrak kiemcellen in latere ontwikkelingsstadia ^4, zoals aangegeven door de afwezigheid van cellen uiting van de eiwit Vasa, dat is een kiem lijn marker in de meeste metazoa ^24. Daarentegen somatische blastomeer ablatie experimenten toonden aan dat P. hawaiensis embryo's bezitten ook belangrijke regulerende functies, zodanig dat het lot van mesoderm of ectoderm voorloper blastomeren weggenomen bij de acht-cel stadium kunnen worden overgenomen door de afstammelingen van enkele van de resterende blastomeren ^25. Hoe regulatieve lot van de cel vervanging kan optreden, en de mate van autonome cellot goedkeuring door somatische blastomeren, blijft onbekend. Experimentele embryologische technieken zoals blastomere ablatie kan nuttig zijn in Understanding van de relatieve autonomie en nonautonomy cel beslissingen over het lot ^26,27 en zijn daarom van belang bij de studie van P. hawaiensis embryogenese.

In de experimenten die regulatieve vervanging van ectodermale en mesodermaal geslachten aangetoond, werd blastomere ablatie uitgevoerd door injectie ²⁸ en daaropvolgende excitatie van fototoxische kleurstoffen ^25. Hoewel deze techniek is effectief bij het doden van de geïnjecteerde blastomeer (pen) niet volledig dode cellichaam uit het embryo. Bovendien zijn verschillen waargenomen tussen cellijn gegevens die tot gastrulatie stadia van embryogenese door injectie blastomeren met fluorescerende tracers lijn ^28,29 en gegevens verzameld door volgende onverstoord blastomeren door de ontwikkeling van dezelfde embryonale stadia ^23. Volledige fysische verwijdering van specifieke blastomeren kan daarom een ​​voorkeurswerkwijze ablatie voor sommige toepassingen.

We hebben eerder de resultaten van cellijn gepubliceerde analyses van embryo's waarin de afzonderlijke cellen handmatig werden weggenomen ^23. Echter, de delicate handelingen die nodig zijn om enkele blastomeren van vroeg decollete stadium verwijderen van embryo's nog niet volledig beschreven. Hier presenteren we een protocol voor de verzameling van P. hawaiensis embryo's en handmatige ablatie van een blastomeer uit een acht-cellig stadium embryo. Het doel van deze methode is om volledige verwijdering van het cellichaam van het embryo bereiken, waardoor waarneming van de cellulaire gedrag en cellot bevoegdheden van de resterende cellen gedurende embryogenese en post-embryonale ontwikkeling. Het protocol duidelijk verwijdering van de kiembaan precursor g (figuur 2C), maar kan worden toegepast op een cel acht-cellig stadium, of blastomeren van eerdere klieving fasen. In principe zou dit protocol worden toegepast op enkele cellen van de vroege splitsing stadium embryo's van Othe verwijderenr holoblastically klieven ongewervelde zeedieren.

Protocol

Reacties die nuttig kan zijn in het uitvoeren van bepaalde stappen zijn cursief weergegeven.

1. Dag 1: Voorbereiding van Materialen

1. Bereid de volgende materialen (zie tabel van materialen en apparatuur):
   • 15 cm en 22 cm pasteurpipetten
   • Diamond schrijver
   • gefiltreerd kunstmatig zeewater (zoutgehalte tussen ,0018-,0020) bevattende 1 mg / ml amfotericine B (1:100 van 100 mg / ml voorraadoplossing), 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (01:50 van een voorraadoplossing met 5.000 eenheden / ml penicilline en 5.000 mg / ml streptomycine)
   • gefilterd kunstmatig zeewater (zoutgehalte tussen ,0018-0,0020) zonder toevoegingen
   • een grote plastic container voor huisvesting stellen (ten minste 15 cm x 15 cm x 5 cm)
   • klein (3 cm of 5 cm) Petrischaaltjes gevoerd met Sylgard
   • klein (3 cm of 5 cm) petrischaaltjes
   • een horlogeglas of glas multi-well plaat
   • pincet (we gebruiken stompe tang afgeleid weerm oude Dumont # 5 tang die per ongeluk zijn beschadigd in andere laboratoriumprocedures die wij hergebruikt met een tang slijpsteen zodat de uiteinden van de forceps zijn glad, dat beide tanden dezelfde lengte, en dat zij niet langer scherpe punten. Uiterst fijne tang, zoals nieuwe Dumont # 5 tang, zijn ongewenst omdat ze embryo's en / of vrouwtjes kunnen verwonden.)
   • een Pasteur pipet met het einde verbreed (zie stap 1.2 hieronder)
   • embryo herwinningshulpmiddel bestaande uit een dunne, gebogen wolfraam draad ingebed in het dunne uiteinde van een Pasteur pipet (kan worden vervangen door een alternatieve uitvoering, zie 1.3)
   • mondpipet met een kleine opening (zie stap 1.4 hieronder)
   • een glazen naald gemaakt van een getrokken glas capillair (zie stap 1.5)
   Geen materialen giftig voor de mens worden in dit protocol. Toch moet de onderzoekers ervoor zorgen dat ze dragen handschoenen of andere beschermende kledij zoals vereist door het risicobeheer guidelines van hun instelling.
2. Om de verbrede Pasteur pipet, eerste score op ongeveer 15 cm Pasteur pipet op het punt waar de pipet begint te verkleinen met een diamant schrijver, wikkel de scoorde regio van de pipet in een Kimwipe of keukenpapier om de vingers te beschermen, en vervolgens zorgvuldig maken afbreken van de tip aan de breuklijn. Houd het gebroken uiteinde van de pipet op een bunsenbrander vlam enkele seconden ingedrukt om de randen glad. De opening moet iets smaller dan de maximale breedte van de pipet.
3. Om de wolfraam draad dissectie-instrument te maken, plaatst u een wolfraam draad in het einde van een 15 cm glas Pasteur pipet, kort ingedrukt boven een bunsenbrander vlam om het glas te smelten, de vaststelling van de draad op zijn plaats. Gebruik een tang om voorzichtig curve het einde van de draad in een haakvorm. Zie figuur 3 een voorbeeld van een geschikte vorm voor dit instrument.
4. Om een ​​kleine opening voor de mond pipet te maken, trekt u het dunne uiteinde van een 22 cm Pasteur pipet in twee delen over een vlam, en breek de punt van het smalle uiteinde. Plaats in het uiteinde van de mondpipet houder.
5. Maak de glazen naald die wordt gebruikt om de blastomeren plaats prikken tijdens de ablatie procedure met een naald trekker. Een geschikt gevormde naald is getoond in figuur 4. Deze naald werd getrokken op een Sutter P97 naald trekker met behulp van een programma met parameters 2x (warmte = 566, trek = 100, snelheid = 20 tijd = 250) + 1X (warmte = 566, trek = 100, snelheid = 100, tijd = 250). Het specifieke programma en instrument gebruikt om de naald te maken kan variëren, maar de naald moet een fijne punt hebben, maar ook stevig genoeg om niet te breken wanneer geduwd tegen het chorion van het embryo.

2. Dag 1: Verzamelen Parhyale Koppelen stellen

1. Gebruik de verbrede Pasteur pipet (stap 1.2) te verzamelen paring P. hawaiensis paren uit de grote cultuur container, en overbrengen naar een aparte container met cleunen kunstmatig zeewater. Het is niet noodzakelijk dat zeewater worden gefilterd. Het beste is om paring paren in de late namiddag verzamelen en laat de paren bij kamertemperatuur (20-23 ° C) gedurende de nacht, zodat de volgende ochtend meeste embryo's zijn onlangs bevrucht en gedeponeerd en dus vroeg in splitsing stadia voor ablatie. Verzamel minstens 20 paren paren om te zorgen dat sommige vrouwtjes gaat uitvoeren vroeg decollete stadium embryo's door de volgende ochtend.

3. Dag 2: Gathering Parhyale Embryo

• De volgende ochtend, bezielen gefilterd kunstmatig zeewater (FASW) met CO _2. Een deel van de vrouwtjes tijdens de nacht vrij gezwommen uit hun mannetjes; innen deze gescheiden vrouwen en verdoven ze in FASW / CO _2. De resterende ongepaarde mannetjes van de parende container verwijderd en aan de grote cultuur. Resterende paring paren kunnen later worden opgeslagen voor het embryoop de dag of de volgende dag.
• Transfer een enkele verdoofde vrouwelijke dragende embryo's om een horloge glas in FASW / CO _2. Alle gescheiden vrouwen zal waarschijnlijk hebben neergelegd eieren, die zichtbaar zal zijn op het oog als bleke roze of paarse bolvormige deeltjes door de transparante coxale platen van de vrouwen (figuur 1A). Om te bepalen of de embryo's in een vroeg stadium decollete en dus geschikt voor blastomeer ablatie, zal de onderzoeker moeten de embryo's uit de broedbuidel verwijderen en onderzoeken ze onder een microscoop.
• Het bekijken van de procedure van een dissectie microscoop, pakt de coxale platen langs een kant van het lichaam met een tang. Embryo's zullen zichtbaar zijn in het ventrale broedbuidel tussen deze coxale platen (Figuur 1B).
• Plaats de dunne, gebogen draad gereedschap (figuur 3; stap 1.3) in het achterste einde van de broedbuidel, en til de draad in de richting van het voorste einde van de broedbuidel om het broed te scheidenzakje bekledingen (deze worden gewijzigd ventrale appendages genoemd oostegites ^30), het openen van het zakje en de embryo's losmaken. Embryo's die binnen het eerste uur of zo worden gelegd allemaal ingesloten in een zeer dunne, transparante membraan dat gemakkelijk kan worden verstoord door de draad gereedschap, dit membraan verdwijnt ongeveer 2-3 uur na leg, en embryo's niet gebonden aan elkaar of aan de vrouwelijke op enigerlei wijze vanaf dit punt de hele embryogenese. Als onderzoekers vinden het lastig of moeilijk te manoeuvreren de gebogen draad gereedschap embryo's uit het broed zakje te verwijderen, een alternatief werktuig kan worden gebruikt, zolang de bewegingen zijn zacht en geen agressieve druk wordt aangebracht op de embryo's of het broed zakje. Andere hulpmiddelen zijn geschikt voor het verwijderen van embryo's uit de broedbuidel omvatten stomp pincet of een glazen capillair met een afgesloten en gladgestreken einde.
• Gebruik een ongewijzigd 15 cm Pasteur pipet om het water te spoelen door de geopende broedbuidel, duwen thij embryo's, die moet naar de bodem van het horlogeglas. Breng de vrouwelijke schoon FASW (zonder CO ₂₎ om het herstel gewacht voordat herinvoering van haar naar de belangrijkste cultuur. Meerdere vrouwen kan worden geplaatst in dezelfde herstel gerecht, maar laat vrouwen om volledig te herstellen alvorens terug te keren ze naar het station cultuur, omdat ze door andere dieren kan worden gegeten als ze nog gedeeltelijk verdoofd.
• Gebruik een ongewijzigd 15 cm Pasteur pipet om de embryo's over te dragen aan een petrischaal met schone FASW en bekijken onder de microscoop om hun embryonale stadium te bepalen. Afzonderlijke embryo die op de derde splitsing (fase 4 ^5), die geschikt zijn voor deze procedure. Het moet ook mogelijk zijn om dit protocol van toepassing op elke splitsing fase voorafgaand aan kiem disc vorming (stadia ^7-08 mei).

4. Dag 2: ablatie enkele cellen

1. Vul Sylgard gevoerde petrischaal met een ondiepe laag van FASW. Gebruik een ongewijzigd 15 cm Pasteur piPette een single embryo transfer naar de plaat.
2. Met stompe tang voorzichtig rol de embryo de cel te geablateerd (figuren 2A en 2B) te identificeren. De kiem lijn voorloper g kunnen worden geïdentificeerd als de kleinste micromere, die zit op de top van de kleinste macromere Mav. Bovendien wordt g niet rechtstreeks contact opnemen met de cel en, dat is de micromere direct tegenover het, zoals de mesoderm voorloper micromeres ml en mr delen een cel grens in het midden van het embryo. Mr is de blastomere rechts van g en ml is micromere links van g. De zuster macromeren van mr, ml, en en zijn de ectoderm voorlopers Er, El, en Ep respectievelijk.
3. Met tang in de LEFt de hand als de onderzoeker rechtshandig is (of in de rechterhand als de onderzoeker is linkshandig), oriënteren het embryo met de cel van belang om de juiste (of naar links als de onderzoeker is linkshandig), en zachtjes begrijpen het embryo tussen de tang om het te stabiliseren.
4. Met behulp van een getrokken glazen naald (stap 1.5 hierboven; Figuur 4), voorzichtig doorboren de cel van belang. Steek de naald te ver, om niet om de naald te duwen in de cellen naburige of onder de cel van belang. De naald hoeft alleen het chorion en onderliggende celmembraan doorboren, en hoeft niet te diep tot in de cel te worden geablateerd.
5. Wisselen de naald gebruikt om het embryo voor de glas-einde van een mond pipet met een fijne prikken trok Pasteur pipet (stap 1.4). Houd de punt van de pipet dicht bij het gat gemaakt in de cel van belang en toepassing zeer zachte zuigkracht.
6. Zeer knijp het embryo met de tang. Als de inhoud van de blastolouter wordt uit het chorion geduwd door het gat gemaakt in stap 4.4, zuig het in de mond pipet om een ​​vrij uitzicht op het embryo mogelijk te maken. Als het gat groot genoeg is, kan de kern van de cel doorboord worden gezien ook ontstaan. Dit is een goede controle om ervoor te zorgen dat de gehele inhoud van de cel zijn verwijderd en kan niet worden geregenereerd.
7. Neem zorgvuldig het embryo als de blastomere van belang wordt verwijderd. De rand van de lekke cel wijken naar het gat in de chorion, waardoor de snijpunten van de onderliggende cellen zichtbaar. Blijven toepassen druk totdat alle blastomere van belang is verwijderd. Gebruik een tang om het embryo te rollen van links naar rechts en visueel bevestigen dat alle blastomere belangstelling verdwenen is.
8. Met ongewijzigde 15 cm Pasteur pipet het embryo te reinigen FASW + (FASW + 1 mg / ml amfotericine B, 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine).
9. Hef-blastomere ablatie embryo's in afzonderlijke putjeseen schone 48 putjes plaat in FASW +, verandert 50% van antibiotica aangevuld FASW + per dag. In onze handen te overleven en ontwikkelen goed, zelfs na ablatie, bij een bereik van temperaturen 18-28 º C. embryo Onderzoekers moeten de embryo verhogen bij een temperatuur waarvoor zij een schoon (maar niet noodzakelijk aseptisch) oppervlak waarop de embryo's met minimale verstoring verhogen. Om te kunnen vergelijken met de timing van ontwikkelingsgebeurtenissen in-blastomere ablatie embryo's met controles, verwijzen we naar de gedetailleerde ontwikkeling enscenering informatie die beschikbaar is voor embryo verhoogd bij 18 º C ^4, 25 º C ⁴ is, en 26 º C ^5,6.

Resultaten

Na succesvolle ablatie van enkele derde splitsing P. hawaiensis micromeres zoals beschreven in dit protocol, geleidelijk de resterende micromeres verschuiven hun positie lichtjes zodat de ruimte vroeger bezet door de geablateerde blastomere gedeeltelijk bezetten. Bijvoorbeeld, wanneer g wordt verwijderd, de naburige blastomeren mr en ml enigszins verschuiven en kom naar de laterale randen van cellen die vroeger in direct contact met g (vergelij...

Discussie

We beschrijven een protocol voor handmatige ablatie en volledige fysieke verwijdering van enkele blastomeren van de vroege stadia van de splitsing amphipod P. hawaiensis. We demonstreren het gebruik van dit protocol door het verwijderen van de enkele kiembaan voorloper cel g van een acht-cellig stadium embryo, en laten zien dat ablatie succesvol door te bevestigen ontbreken van g 's dochter cellen in latere embryogenese is geweest. Dit protocol kan worden gebruikt om elk va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630 VWR	Voor het overbrengen van intacte en blastomeer-ablate embryo's van schotel naar schotel.
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632 VWR	Voor het maken van mondpijpenpunten.
3 cm Petri schotels	Thermo Scientific	25382-334 VWR	Gebruik een aantal ongewijzigde om embryo's te verzamelen en op te slaan; bedek sommige met een laagje Sylgard (zie hieronder) om een werkoppervlak voor blastomeer-ablatie te creëren.
48-putjes platen	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	Voor het kweken van embryo's na ablatie.
Flesdopfilters 0,2 µm	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	Voor het creëren van FASW (Zie hieronder).
Bunsen-brander	VWR	89038-530 VWR	Voor het maken van tungsteendraadgereedschap en de fijne punt van een mondpijp.
Diamantschrijver	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	Voor het maken van brede Pasteur pipetten voor het verzamelen van koppels.
Pincetten	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	Voor het vasthouden van verdovde vrouwtjes tijdens het verwijderen van embryo's uit de broedzak. Dit hoeven geen fijne Dumont-pincetten te zijn - de uiteinden kunnen ten minste zo stomp zijn als die van de pincetten waarvoor het catalogusnummer hier is vermeld.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	Voeg toe aan FASW tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/ml, en gebruik deze oplossing om blastomeer-ablate embryo's te kweken.
Glazen capillairen 4 inch lang, 1/0,58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	Voor het maken van naalden voor het puncteren van de blastomeer die moet worden ablateerd.
Glazen horlogeglas 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30 Electron Microscopy Sciences	Voor het verwijderen van embryo's uit de broedzak van verdoofde vrouwtjes.
Instant Ocean Kunstmatige Zeewater (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Maak ASW door zout op te lossen in gedeïoniseerd water tot een saliniteit van 1,022-1,024.
Instant Ocean Gefilterd Kunstmatig Zeewater (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	Gebruik 0,2 µm filters om ASW te steriliseren. Maak kleine hoeveelheden (< 250 ml) aan zoals nodig.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	Voor het veilig breken van het fijne uiteinde van Pasteur pipetten gemodificeerd voor het verzamelen van koppels.
Mondpijp adapter	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	Plaats de fijn getrokken Pasteur pijptip in dit uiteinde, om te worden gebruikt voor het verwijderen van uitgedreven celinhoud tijdens de ablatieprocedure.
Mondpijp buis	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	Snijd deze zodat hij lang genoeg is om comfortabel om je nek te hangen tijdens de ablatieprocedure.
Naald Puller	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	Voor het maken van naalden uit glas capillairen voor het puncteren van de blastomeer die moet worden ablateerd.
Penicilline-Streptomycine Oplossing	Mediatech	45000-650 VWR	Voeg toe aan FASW tot een uiteindelijke concentratie van 100 eenheden/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine, en gebruik deze oplossing om blastomeer-ablate embryo's te kweken.
Rubberen kop	Electron Microscopy Sciences	100488-418 VWR	Voor het gebruik van Pasteur pipetten om embryo's van schotel naar schotel over te brengen.
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	Maak volgens de instructies van de fabrikant. Giet een laag van 2-5 mm dik in een 3 cm petrischaal om een werkoppervlak voor blastomeer-ablatie te creëren.
Tungsteendraad 0,004 inch diameter	A-M Systems	719000 A-M Systems	Gebruik dit om een gereedschap te maken voor het verwijderen van embryo's uit de broedzak van verdoofde vrouwtjes.