Dit artikel geeft een stap voor stap handleiding om de fluctuatie analysetechniek k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) voor het meten van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabelde plasmamembraan eiwitten in levende cellen van zoogdieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Laterale diffusie en compartimentering van plasmamembraan eiwitten worden strak gereguleerd in cellen en dus, het bestuderen van deze processen zullen nieuwe inzichten onthullen plasmamembraaneiwit functie en regulatie. Onlangs, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) 1 is ontwikkeld om routinematige metingen van diffusiecoëfficiënten staat rechtstreeks van beelden van fluorescent gelabelde plasmamembraaneiwitten, dat systematische fouten geïntroduceerd door sonde fotofysica vermeden. Hoewel de theoretische basis voor de analyse is complex, kan de werkwijze worden uitgevoerd door nonexperts met een vrij verkrijgbaar code diffusie coëfficiënten van proteïnen te meten. KIG berekent een tijd correlatie functie van een fluorescentie microscopie afbeelding stapel na Fourier transformatie van elk beeld om wederzijdse (k-) ruimte. Vervolgens circulaire middeling, natuurlijke logaritme transformeren en lineaire past om de correlatie functie levert de diffusiecoëfficiënt. Dezepapier zorgt voor een stap-voor-stap handleiding voor de beeldanalyse en meting van diffusiecoëfficiënten via KIG's.
Eerst wordt een hoge framesnelheid beeld sequentie van een fluorescent gemerkt plasmamembraaneiwit verkregen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Vervolgens wordt een regio van belang (ROI) te vermijden intracellulaire organellen, bewegende blaasjes of uitstekende membraan regio geselecteerd. De ROI stack wordt geïmporteerd in een vrij beschikbare code en een aantal gedefinieerde parameters (zie methode sectie) ingesteld voor de KIG analyse. Het programma genereert vervolgens een "helling pistes" plot van de k-ruimte tijd correlatie functies, en de diffusie coëfficiënt wordt berekend uit de helling van het perceel. Hieronder is een stap-voor-stap KIG procedure om de diffusie coëfficiënt van een membraan eiwit meten met behulp van de renale waterkanaal aquaporine-3 gelabeld met EGFP als een canonieke voorbeeld.
Inleiding
De vierdimensionale spatiotemporele organisatie en laterale mobiliteit van plasmamembraaneiwitten zijn strak gereguleerd en kan een rol spelen in eiwitfunctie, activiteit en eiwit-eiwit interacties. Laterale diffusie van plasmamembraan eiwitten, is van oudsher bestudeerd door het berekenen diffusiecoëfficiënten voor enkele deeltjes van time-lapse imaging van quantum dot of kleurstof gelabelde plasmamembraaneiwitten 2-4. Deze benadering vereist het inbrengen van een extracellulair tag in de plasmamembraan eiwit quantum dot of kleurstof etikettering, die eiwitvouwing en functie kunnen beschadigen en derhalve niet kan worden bereikt voor sommige eiwitten. Het sterische volume van een quantum dot is aangetoond vertragen diffusie van het proteïne 5 en bovendien slechts een fractie van de eiwitten in de populatie zijn gelabeld met quantum dots, en het is niet bekend of deze fractie is representatief voor de totale pool van plasmamembraaneiwitten. Enkel deeltje tracking (SPT) metingen van diffusiecoëfficiënten uit beeld-serie van quantum dot gelabelde eiwitten betreft het in kaart brengen van de afgebeelde top posities van de deeltjes met twee dimensionale Gauss-fits gevolgd door uitgebreide analyse algoritmen. De analyse is computationeel zeer intensief, die uitgebreide niet-lineaire curve fitting in elk beeld frame van een time-lapse volgorde om benaderingen van de microscoop puntspreidingsfunctie (meestal twee dimensionale ruimtelijke Gaussians) en daaropvolgende koppeling van deeltje posities in deeltjestrajecten beschrijven van de beweging van enkele moleculen 6,7.
Een recent ontwikkelde beeldcorrelatie techniek, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) maakt relatieve eenvoudige metingen van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabeld plasmamembraan eiwitten. De mogelijkheid om routinematig berekenen diffusiecoëfficiënten van membraaneiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten door KIG is een unieke tool die houdteen aantal voordelen ten opzichte van traditionele quantum dot SPT analyse: geen invoeging van extracellulaire tags en tijdrovend extracellulaire etikettering vereist (cellijnen die fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt); diffusie coëfficiënten worden uit de totale verzameling van fluorescente proteïnen ten opzichte van een subset gelabeld met quantum dots; analyse is eenvoudig zonder dat enige proteïnen volgen en de analyse kan worden uitgevoerd met een bestaande code zonder behoefte aan extra gebruikersprogrammering. De werkwijze is snel omdat het een gemiddelde techniek die snelle berekening en de berekening van diffusiecoëfficiënten maakt. Deze snelle verspreiding metingen voor het eiwit bevolking aanvulling op de meer gedetailleerde informatie moleculair transport voor een subset van de populatie verkregen door het zorgvuldige SPT methoden.
KIG tijd correleert fluorescentie microscopie afbeelding sequenties die van tevoren zijn omgevormd tot Fourier ruimte, en daardoor scheidt fluorescence schommelingen als gevolg van fotofysica uit die als gevolg van moleculaire vervoer 1. Hierdoor kan het aantal KIG dichtheid te bepalen, luchtsnelheid en verspreiding van fluorescent gelabelde moleculen terwijl onpartijdige door complexe fotobleken of knipperen van de fluoroforen. Dit maakt KIG een nuttig hulpmiddel voor het snel de verspreiding dynamiek van fluorescent gelabelde celmembraan eiwitten bepalen zonder aangepaste schrijven algoritmen. Naast fluorescent gelabelde eiwitten KIG kan ook worden toegepast op quantum dot-gemerkte membraaneiwitten 8.
Dit document biedt een stap-voor-stap introductie van hoe KIG gebruiken om diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten halen door aan te tonen hoe het gewas te plaatsen, hoe je de code en hoe u de gegenereerde percelen, te evalueren gebruiken waaruit diffusie coëfficiënten worden gewonnen. Als voorbeeld, gegevens verkregen door het draaien van schijf-microscopie set in semi-totale interne reflectie fluorescerenNVU (TIRF) modus van een nier waterkanaal eiwit aquaporin-3 (AQP3) getagged met EGFP wordt gepresenteerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Verwerving van EGFP-gelabeld eiwitten in de plasmamembraan van KIG analyse kan worden uitgevoerd op een epifluorescentie microscoop, een TIRF setup of op een draaiende schijf microscoop ingesteld om beelden van het membraan plaats verwerven. De camera pixelgrootte en de tijd tussen beeldframes nodig is voor de analyse. Afbeelding sequenties van 100-1200 frames met een beeldsnelheid van 4-30 Hz kan worden gebruikt voor de analyse. Tijdens de overname, is het belangrijk om het membraan in focus tijdens de duur van de beeldvorming en focus op een fractie van de vlakke membraan waarin de fluorescentie wordt gelijkmatig verdeeld. Moving blaasjes, uitstekende membraan regio's en celorganellen kan later in het analyseproces worden uitgesneden. De acquisitie tijd moet worden gekozen dat er geen drift of beweging van de cel.
Om de KIG code scripts voor MATLAB krijgen, contact opnemen met Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). De eerste keer dat de KIG code wordt gebruikt, geopend MATLAB en klik file en stel pad, klik voegen met submappen en vind de map op de computer waarin de KIG code zich bevindt. Klik vervolgens op OK, opslaan en sluiten. Ga nu verder met de analyse van gewassen in de volgende punten beschreven.
1. Importeer de afbeelding sequentie van belang in een Imaging Analysis Program als een TIFF Stack
Sla het bestand met de naam: stack1.tif.
- Selecteer een rechthoekig gebied van belang (ROI) op het vlakke gedeelte van het membraan zonder bewegende celorganellen en uitstekende membraan regio. Het gewas omvang wordt gekozen, zodat er voldoende statistieken worden gegenereerd ten goede k 2 percelen.
- Snijd de regio en sla het gewas als een TIFF-bestand in een geschikte map. Als er verschillende gewassen uit dezelfde film, gebruiken een aantal increment, bijvoorbeeld "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
- Plaats de map met de gewassen lokaalop de computer, niet op een server, terwijl het doen van KIG analyse.
2. Importeer de gewassen in de Analysis Software One by One om de analyses uit te voeren
- Open MATLAB en typ "icsgui" in het commando venster en druk op ENTER. ICS GUI is het uitvoerbare naam voor de afbeelding correlatie spectroscopie grafische gebruikersinterface programma.
- In de ICS GUI klik op het tabblad "KIG's". Een beeld van het analysevenster wordt getoond in figuur 1.
- Zoek de map met de naam van de map "MATLAB-code" en blader naar het bestand met de bestandsnaam "Scripts" en open deze door erop te dubbelklikken. Of klik rechtermuisknop op het bestand en kies "openen met MATLAB" of ga naar bestand, open in MATLAB en open de scripts bestand. Dit bestand heet Editor.
- In de Editor scroll naar "Load KIG data sets", deze te kopiëren of naam bestandstype en de map locatie in de opdrachtregel die begintmet img = bijvoorbeeld "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". In de opdrachtregel onder de map locatie stelt u het aantal frames te analyseren - bijv. [1:500]. Gebruik dezelfde instellingen voor alle opeenvolgende films in de gegevensreeks. Als er aandacht drift in latere frames, moeten deze van de analyse uitgesloten.
- In de editor klik op "opslaan" en klik vervolgens op "cel te evalueren". De dataset is nu geladen in in de analyse software.
- In het venster KIG Analyse in de GUI, voert u de instellingen voor de analyse:
- Unclick "T-cel" dozen.
- Voer het aantal vertragingen te analyseren. Het aantal keer dat vertragingen (τ) zal effect hebben op de verspreiding perceel en moet worden gekozen dat de diffusie perceel is lineair. Begin met het invoeren van 25 en dan af naar de plaats waar de diffusie plot is lineair. τ is het aantal er tijd verloopt de KIG analyse vergelijkt en een vertraging is de tijd bussen een frame en het volgende. De kleinste waarde die een lineaire grafiek geeft worden gekozen. Het maximum aantal vertragingen wordt gekozen dat een lineaire passing wordt verkregen, het kiezen van een hogere waarde gegevens die niet lijn worden gemonteerd produceren.
- Voer de maximale k 2-waarde (zie cirkel 1 in figuur 1), is het meestal 20-50. Een goede k 2 perceel is een perceel waar er veel datapunten die zijn verdeeld langs een lijn. Begin met het invoeren van 70 en dan af na de k 2 en diffusie percelen te hebben geëvalueerd en kies de laagste waarde waar de datapunten cluster rond een rechte lijn. De k2 waarde is de gekwadrateerde grootte van de ruimtelijke k-vector in Fourierruimte.
In eerste instantie moet de analyse worden herhaald tot de beste waarden worden bepaald, gebruik dan dezelfde instellingen voor alle opeenvolgende films in de data-serie, maar altijd controleren of de geselecteerde instellingen geven een goede match met de gegevens: goede k 2 percelenen een lineaire diffusie plot. - Klik op "Instellingen opslaan en verder".
- Klik op "ja" om alle grafieken tonen.
- Klik op "Load image serie" (zie cirkel 2 in figuur 1) en klik op 'werkruimte'.
- Selecteer "imgSerCrop", klik op "Importeren uit Workspace".
- Voer het imaging systeem collectie instellingen. In het vak "pixelgrootte" voer het geprojecteerde pixelgrootte voor de imaging-systeem waarin het beeld stapels worden verworven. Voor AQP3-EGFP, 0.111 gebruikt. In het vak "Voer de tijd (s) tussen frames", 0,1150 werd gebruikt voor AQP3-EGFP.
- Klik op "selecteer ROI", voert u "1", klik op OK en "gebruiken gehele beeld".
- Klik op "Do KIG analyse" en klik op Ja om "immobiel filtering" doen. De resultaten zullen automatisch open als afbeeldingen.
- Het venster instellingen te minimaliseren, het minimaliseren van de cel info Window, en het minimaliseren van het venster fotofysica. In het venster dynamiek, controleer dan of de dynamiek plot geeft grafisch weer een lineaire fit van de gegevens aan een lijn met een negatieve helling betekent dat de gegevens correleren en gratis verspreiding kan worden aangenomen. Noteer de diffusiecoëfficiënt van de specifieke vertraging en k 2 instellingen (het is niet nodig de standaardafwijking van de pasvorm noot). De gegevens in de k 2 percelen moet worden geclusterd rond de lijn voor de gegeven tijd loopt.
- Vakje "Opslaan geopend cijfers als afbeeldingen" en klik op 'Opslaan geopend cijfers als afbeeldingen "te redden leiden bestanden. Opslaan in een nieuwe map onder C: Users Documents AQP3diffusion. Klik op "clear huidige gegevens" en ga verder met de analyse van de volgende oogst.
3. Gemiddelde van het berekende diffusiecoëfficiënt wordt berekend om een overzicht van de geanalyseerde gegevens ophalen
- Voer de individuele diffusiecoëfficiënten uit elke ROI in een SPREadsheet (zorg ervoor dat de τ noot en k 2 waarden), gebruik maken van de namen van de gewassen zoals hierboven uiteengezet.
- Bereken de gemiddelde diffusiecoëfficiënt en de standaarddeviatie met behulp van een spreadsheet programma.
- Voer een Kolmogorov-Smirnov test of een student t-test statistische verschillen te evalueren met behulp van een 5% significantie niveau. Kwantitatieve vergelijkingen tussen cellen (bijvoorbeeld behandelde versus onbehandelde) kunnen worden gemaakt.
- Open de spreadsheet versie van de diffusie percelen die werd gegenereerd door de analysesoftware voor elk gewas en de gemiddelde gegevens voor elke voorwaarde voor elke vertraging. Genereer een nieuwe gemiddelde diffusie plot voor de presentatie in kranten of presentaties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om geschikte afbeelding stapels worden geanalyseerd met de KIG te verwerven, kunnen verschillende microscoop systemen worden gebruikt. Het is mogelijk om beeldsequenties van een epi-fluorescentiemicroscoop en een TIRF of draaiende schijf opstart analyseren. Het membraan moet vlak zijn, zonder grote bewegende celorganellen of bewegende blaasjes / objecten. Dit document presenteert een time lapse sequentie van beelden van AQP3 gelabeld met EGFP in levende MDCK cellen afgebeeld op een draaiende schijf microscoop met focus ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze paper gepresenteerd uitvoerige stap-voor-stap overzicht van hoe de KIG analysemethode gelden voor diffusie coëfficiënt te bepalen van microscopie beelden van eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten. De analyse is onafhankelijk probe keuze met een zeer breed dynamisch bereik etikettering dichtheid en kan dus ook worden toegepast op eiwitten gelabeld met quantum dots en kleurstoffen en fluorescerende eiwitten zoals EGFP.
Geldige diffusie coëfficiënten voor de berekening van eiwitten...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een Lundbeck Junior groepsleider Fellowship te LNN. PWW erkent subsidies steun van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC). We danken ook de Deense Molecular Bioimaging Center aan de Universiteit van Zuid-Denemarken voor de toegang tot spinning disk microscopie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 31600-083 | |
| FBS | Invitrogen | 10082147 | |
| Peniciline | Sigma | 13752 | |
| Kanamycine | Gibco | 15160070 | |
| Streptomycine | Gibco | 11860038 | |
| Fenolr Rood Vrij medium | Gibco | 11880-028 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Apparatuur | |||
| Spinning Disk Microscoop | Nikon | Ti Eclipse | |
| EMCCD Camera | Andor | Ixon+ |
Referenties
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
