Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten

12.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51085

⸱

15 november 2013

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Ketoconazol bindt aan en antagoniseert pregnaan X Receptor (PXR) activering. Gist high throughput screens van PXR mutanten definiëren een unieke regio voor ketoconazol bindend. Dit op basis van gist genetische methode ontdekt nieuwe nucleaire receptor interacties met liganden die associëren met oppervlakte bindingsplaatsen.

Samenvatting

Als een kritische regulator van metabolisme en ontsteking, pregnaan X receptor (PXR), speelt een belangrijke rol bij de ziekte pathofysiologie koppelen metabolisme en ontsteking (bijvoorbeeld hepatische steatose) 1,2. Er is veel vooruitgang geboekt in het identificeren van agonist liganden voor PXR, echter, zijn er weinig beschrijvingen van drug-als antagonisten en hun bindingsplaatsen op PXR 3,4,5. Een kritische barrière het onvermogen om efficiënt te zuiveren eiwit van volledige lengte voor structurele studies met antagonisten hoewel PXR werd gekloneerd en gekarakteriseerd in 1998. Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high throughput op basis van gist two-hybrid is een antagonist, ketoconazol definiëren, bindend residuen op PXR 6. De werkwijze omvat het creëren mutatiepatronen bibliotheken die het effect van afzonderlijke mutaties op de AF-2 oppervlak van PXR interactie verwacht tussen ketoconazol zou redden. Reddings-of 'gain-of-function "second mutaties kunnen zodat conclusies over de genetische interactie van ketoconazol en het oppervlak residu (en) op PXR haalbaar worden gemaakt. Zo, een high throughput two-hybrid gist scherm van PXR mutanten interactie met haar coactivator, SRC-1 ontwikkelden we. Met deze aanpak, waarbij de gist werd gewijzigd om de studie van het antimycoticum ketoconazol tegemoet kunnen we aantonen specifieke mutaties op PXR verrijkt klonen niet binden aan ketoconazol. Door omgekeerde logica, concluderen we dat de oorspronkelijke resten zijn directe interactie residuen met ketoconazol. Deze test is een roman, handelbaar genetische test voor het screenen op antagonist bindingsplaatsen op nucleaire receptor oppervlakken. Deze test kan worden toegepast op elk geneesmiddel ongeacht de cytotoxische gist en cellulaire eiwit (ten) die niet kunnen worden onderzocht met behulp van standaard structurele biologie of proteomics gebaseerde methoden. Mogelijke valkuilen onder de interpretatie van gegevens (complementaire methoden bruikbaar), reliAnce op enkele Y2H methode, deskundigheid in het omgaan met gist of het uitvoeren van gist twee-hybride assays, en test optimalisatie.

Inleiding

De gist twee-hybride (Y2H) test wordt veel gebruikt om eiwit-eiwit interacties ontdekken en meer onlangs voor ontdekking van nieuwe kleine moleculen die eiwit-eiwit interactie complexen 7, 8, 9, 10, 11 verstoren. De conventionele benaderingen van deze test gebruikt voor drug discovery of "hits", niet mogelijk voor de detectie van allosterische interactie residuen van chemische verbindingen in eiwit-eiwit oppervlak, dat bij nog veranderde interactie en zorgen voor ondervraging van de veranderde residuen 11 . Immers, een dergelijke methode (n), indien mogelijk ontwikkelen, zou een handelbaar gist voor hoge doorvoer beoordeling van allosterische interactie residuen essentieel voor eiwit-eiwit interactie verstoring mogelijk. In het kader van het geneesmiddelenonderzoek, zou de meest directe manier om wisselwerking van verbindingen vast eiwitten structuurbepaling (bv. kristallisatie eiwit-remmer complex) omvatten. Deze methoden zijn cumbersome, gebruik uitgebreide middelen en het technisch niet haalbaar is om structurele studies van elk eiwit uit te voeren.

Tractable genetische drug screening systemen zijn in bacteriën 1, 2 en andere modelsystemen zoals zoogdier twee-hybride vastgesteld. Echter, deze systemen moeten optimalisatie en alternatieve systemen zoals Y2H zijn nog steeds de meest getest in drug discovery. Er zijn beperkingen die slechte gevoeligheid en betrouwbaarheid van interacties met bijzondere werkwijzen 13 omvatten echter een Y2H test kan worden aangepast aan specifieke vragen over interactie residuen beantwoorden. Op het gebied van nucleaire receptor onderzoek is Y2H gebruikt om interagerende eiwitten 14 definiëren, maar deze eiwitinteracties zelden gebruikt om de natuur waarin liganden / antagonisten interageren met nucleaire receptor-eiwitcomplexen definiëren. Aldus ons laboratorium gericht op pogingen het definiëren van een werkwijze, vooral voor receptoreiwitten die nietgemakkelijk vatbaar voor gebaseerde methoden proteomics, dat zou nieuwe ligand / antagonist interactie resten behulp van een omgekeerde Y2H gebaseerd discovery platform ontgraven.

Op basis van onze eerdere bevinding dat ketoconazol verstoort PXR en de activator SRC-1, ontwikkelden we een nieuwe reverse Y2H systeem dat ons in staat stellen om ketoconazol interactie resten te definiëren en te ondervragen op PXR 6. Onze methode is gebaseerd op de eigenschappen van de gist GAL4 eiwit dat bestaat uit scheidbare domeinen die verantwoordelijk zijn voor DNA-binding en transcriptionele activatie. De PXR LBD proteïne wordt uitgedrukt als een fusie met het LexA DNA-bindingsdomein (DNA-BD), terwijl de volledige lengte co-activatoren SRC-1 (steroïdereceptor coactivator 1) zijn proteïnen tot expressie als fusies aan het GAL4 activeringsdomein (AD ). Interactie tussen PXR en SRC-1 fusie-eiwitten leidt tot de transcriptionele activering van GAL4-bindingsplaatsen bevattend reportergen β-Lac Z die is geïntegreerd in de gist genome. Ketoconazol, een PXR antagonist, verstoort PXR en SRC-1 interactie 15, 16, 17 en kunnen we de interactie van PXR detecteren en SRC-1 bij aanwezigheid of afwezigheid van ketoconazol na kleuren kolonies op filters voor X-gal activiteit. Het principe van Y2H wordt geïllustreerd in figuur 1 en de experimentele procedure wordt samengevat in figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bouw van PXR en SRC-1 Fusies in gistvectoren

  1. PCR-amplificatie van Human PXR LBD (107-434 aminozuren) en Human SRC-1 volledige lengte (1-1401 aminozuren).
    1. Gebruik pSG5-hPXR plasmide 8 als PXR LBD sjabloon, gebruiken pCMX-SRC1 plasmide als SRC-1-sjablonen.
    2. Dooi PCR SuperMix, DNA templates en primers (zie materialen), bewaar ze op ijs.
    3. Voeg 0,25 ug / ul DNA-matrijs 1 ui, 10 mM primerparen 2 pi elk PCR Supermix 45 ui en voeg H2O aan totale volume op 50 ui te brengen.
    4. Stel PCR bij een cyclus van 94 ° C gedurende 2 min, 20 cycli van 94 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 2 minuten, daarna een cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten tot verlenging. Controleer PCR producten door lopen op 1% agarosegel.
  2. PCR producten klonering in Y2H vectoren.
    1. Zuiver PCR producten van 1% agarosegel. Digest PXR, LBD, PCR, en Y2H vector pSH2-1 metBamHI en Sali; verteren SRC-1 PCR en Y2H vector pGADNOT met NotΙ en SalΙ. Hiertoe voeg 1 ug DNA, 3 pl 10x reactiebuffer, 1 ui restrictie-enzymen, en tenslotte H2O aan totale volume op 30 ui te brengen.
    2. Zet digestie monsters 37 ° C waterbad gedurende 1 uur. Controleer digestie door het uitvoeren op 1% agarosegel.
    3. Zuiver digestie monsters van 1% agarosegel ligeren gedigereerde PCR-producten en Y2H vectoren en te transformeren om DH5a competente cellen.
    4. Kies de koloniën en isoleren het plasmide DNA.
  3. Identificeer pSH2-1-PXR plasmide-DNA met BamHI / SalI digestie, identificeren pGADNOT-SRC-1 plasmide DNA door NotI / SalI digestie. Controleer of alle positieve plasmide-DNA door sequencing.

2. Gist twee-hybride assays

  1. Inoculeren de giststam in 5 ml YPAD en incubeer gedurende de nacht door constant roeren (220 tpm bij 30 ° C). Opmerking: De Saccharomyces cerevisiae stam was CTY10-5d(Mat A ade2 trp 1-901 leu2-3, 112 his3-200 ga l4 - GAL80 - URA3 :: lexA-lacZ) dat een geïntegreerde GAL1-lacZ gen met lexA operator 10 bevat. Om levensvatbare gistcellen resistent ketoconazol verkrijgen, maar die niet transporter veranderingen heeft dragen als een oorzaak van azoolresistentie 18-20, nieuwe stammen van CTY10-5d gist werden verkregen door eerst verwijderen ERG3 (erg3 Δ) en invoering van aanvullende deletie in ERG11 (erg3 Δ / ERG11 Δ) genen door homologe recombinatie. De constructie details zijn beschreven in een eerder gepubliceerde manuscript 6.
  2. De volgende dag ('s morgens), inoculeren gist (01:20) in 5 ml YAPD en incubeer een OD 600 ~ 0,2 verkrijgen door constant roeren (220 rpm bij 30 ° C).
  3. Pellet de cellen bij 2000 rpm in een microcentrifuge gedurende 2 min en de bovenstaande vloeistof. Was daarna de pellet tweemaal met geautoclaveerd water en een keer met 0,1 M LiAc.
  4. Na de laatste wasbeurt, gooi supernatant en voeg de volgende reagentia aan de celpellet: 240 pl PEG 3500 50% w / v, 36 gl 1 M LiAc, 50 ui 2 mg / ml gekookt zalmsperma ssDNA, H2O 34 pl. Vortex te mengen, voeg 1 ug PSH-PXR en 1 ug pGADNOT-SRC-1 DNA en meng.
  5. Breng het mengsel op rondbodem polystyreen buizen, schud de transformatie mengen (220 rpm bij 30 ° C) gedurende 30 minuten. Zet de buis tot 42 ° C waterbad en incubeer gedurende 30 minuten.
  6. Centrifugeer de buis bij 2000 rpm gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant. Was de pellet een keer met geautoclaveerd water.
  7. Pipetteer 100 ul steriel water in de buis, resuspendeer de cellen door zachte vinger te tikken en pipetteren, dan plaat op platen van -His/-Leu Dropout Medium (Formulering per een liter -His/-Leu Dropout Medium: 20 g dextrose, 1,7 g YNB, 0,67 g CSM-His/-Leu, 5 g ammoniumsulfaat, 1,5% agar) en meerderUbate bij 30 ° C gedurende 3-4 dagen om transformanten te isoleren.

3. X-gal Filter Assay

  1. Knip nitrocellulosemembraan de grootte van een deel van een petrischaal. Label de nitrocellulosemembraan om de oriëntatie te markeren.
  2. Plaats voorgemarkeerde nitrocellulose membraan op gistkolonies, zorg ervoor dat het membraan in contact is met het oppervlak van de plaat medium.
  3. Verwijder het membraan, plaats het kolonie kant naar boven op een 3 mm filtreerpapier en plaats het membraan en filtreerpapier bij -80 ° C gedurende 15 minuten.
  4. Zorg X-gal oplossing. Voeg 50 ul 20 mg / ml X-gal en 15 ul β-mercapto-ethanol tot 5 ml Z-buffer (1 L buffer bevat 16,1 g Na 2 HPO 4 7H 2 O, 5,5 g NaH 2 PO 4 H2O, 0,75 g KCl, 0,25 g MgSO4 • 7H 2 O). Als Z buffer bij 4 ° C werd gehouden, breng het op kamertemperatuur voor het toevoegen van deze reagentia.
  5. Plaats twee cirkels van 3 mm filterpapierin een petrischaal en week ze met 5 ml X-gal oplossing. Afvoer overtollige buffer van de petrischaal en plaats de nitrocellulose membraan met de kolonie kant naar boven.
  6. Sluit het deksel, ervoor zorgen dat het membraan is het maken volledig contact met de filter papier en het is helemaal nat. Wikkel de petrischaal in folie en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten tot overnacht.

4. Vloeibare β-gal Assay

  1. Groeien Gist in -His/-Leu Dropout vloeibaar medium om OD 600 0.7.
  2. Breng 1 ml medium in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant.
  3. Voeg 1 ml buffer Z om de pellet te resuspenderen centrifuge bij 3000 rpm nogmaals 2 minuten. Verwijder het supernatant.
  4. Voeg 150 pi van Z buffer met 2ME de celpellet opnieuw in suspensie, meng voeg 50 pl chloroform en 20 ul 0,1% SDS. Krachtdadig vortex het monster gedurende 15 sec.
  5. Voeg 700 ul ONPG-oplossing (1 mg / ml in Z buffer). Stel de timer, incubeer bij 30 ° C toereikend is om de gele kleur aan totale reactietijd ontwikkelen en toelichting.
  6. Voeg 500 ul van 1 M Na 2 CO 3 om de reactie te stoppen en bepalen de absorptie bij 420 nm. De blank is 700 pi ONPG oplossing plus 500 ul 1 M Na 2 CO 3.

Bereken Miller Units als volgt: Miller Units = (A420 * 1000) / (A600 * min * ml)

A420: absorptie-eenheden bij 420 nanometer; A600: absorptie-eenheden bij 600 nanometer, min: de reactietijd in minuten, ml: de reactie volume in ml

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We voerden een test om te zien of we een colorimetrische uitlezing van de vereniging van PXR en steroïde receptor coactivator-1 (SRC-1) kunnen detecteren. Omdat gist aanzienlijke sterol productie is eerder aangetoond dat lacZ expressie in gist kan worden opgewekt zonder extra exogeen ligand. We vonden dat lacZ expressie (blauwe kolonies) ook wordt geïnduceerd in de giststam getransformeerd met PXR en SRC-1, maar er is geen inductie van LacZ expressie (witte kolonies) in gist getransformeerd met lege vectoren, PXR of SRC...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In onze gewijzigde Y2H test, hebben we belangrijke residuen voor ketoconazol interacties op PXR 6 geïdentificeerd. Omdat SRC-1 een coactivator (en werd gekloneerd in de vector pGADNot), hebben we ook getest of SRC-1 lacZ expressie kan activeren wanneer gekloneerd in de PSH vectorsysteem en of de activatie profiel zou veranderen en / of beïnvloeden van leakiness de gist two-hybrid. Met onze vernieuwde plasmiden voerden we twee-hybride assays erg3 Δ / ERG11 Δ gist. Zoals wordt aangetoond dat l...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies CA127231 en The Damon Runyon Stichting Clinical Investigator Award (CI 1502) (SM). Wij willen professor Zdenek Dvorak bedanken van Palacky Universiteit Olomouc, Tsjechië voor zijn nuttige inzichten in de bespreking van de overdraagbaarheid van deze techniek om hun instelling en standaardisatie van het protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Giststam CTY10-5d erg3Δ/erg11ΔOns labGiststam CTY10-5d was dubbel uitgeschakeld ERG3 en ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genen6 .
YPD-groeimediumBD Biosciences630409
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) zonder aminozuren en ammoniumsulfaatBD Biosciences233520
Bacto AgarBD Biosciences214010
CSM-His/-Leu Complete Supplement MixtureMP Biomedicals4250-412
ONPG (o-Nitrofenyl Β-D- Galactopyranosid).Sigma-AldrichN1127
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Luria Broth (LB)Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
Gesonikerd zalmsperma-DNA gekookt (10 mg/ml)Life Technology156-017
AmpicillinAcros Organics61177
KetoconazolSigma-AldrichK1003
N,N-DimethylformamideAcros Organics326871000
LithiumacetaatSigma-AldrichL4158
50% PEG-3350 oplossing, filtergesteriliseerdeSigma-AldrichP-3640
Nitrocellulose MembraanWhatman10402091
10 cm Petri-schaalFisher875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'onze labPXR LBD voorwaarts primer voor pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'onze labPXR LBD omgekeerde primer voor pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'onze labSRC-1 voorwaartse primer voor pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'onze labSRC-1 omgekeerde primer voor pGADNOT
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
BamHIonze labR0136
SalIonze labR0138
NotIonze labR0189

Referenties

  1. Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
  2. Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
  3. Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
  4. Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
  5. Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
  6. Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
  7. Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  8. Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
  9. Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
  10. Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
  11. Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
  12. Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
  13. Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
  14. Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
  15. Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
  16. Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
  17. Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
  18. Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
  19. Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
  20. White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
  21. Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
  22. Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
  23. Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Yeast two hybrid assayinteractie van nucleaire receptorenligandbinding van PXRbindingsplaatsen van ketoconazolSRC 1 coactivatorscreening van mutationele bibliothekenvloeistof b tagalactosidase assayfilterkolonie assayantagonist bindingsplaatsenhigh throughput screening
Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.