Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Samenvatting

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Samenvatting

Enkele cel codetection van een gen, het RNA-product en cellulaire regulerende eiwitten is essentieel voor regulatie van genexpressie te bestuderen. Dit is een uitdaging op het gebied van de virologie, in het bijzonder voor nucleaire replicerende persistente DNA-virussen die dierlijke modellen voor de studie betrokken. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is een levenslange latente infectie in perifere neuronen. Latent virus dient als reservoir, waaruit reactiveert en veroorzaakt een nieuwe herpetische episode. De celbiologie van HSV-1 latency blijft slecht begrepen, mede door het ontbreken van methoden om HSV-1 genoom te detecteren in situ in diermodellen. We beschrijven een DNA-fluorescente in situ hybridisatie (FISH) aanpak efficiënt detecteren laag-kopie virale genomen binnen delen van neuronale weefsels van besmette dierlijke modellen. De methode is gebaseerd op warmte gebaseerde antigen ontmaskering, en direct gemerkt zelfgemaakte DNA-probes, of commercieel beschikbare sondes. We ontwikkelden een triple staiNing aanpak, waarbij DNA-FISH met RNA-FISH en immunofluorescentie, met behulp van peroxidase gebaseerd signaalversterking aan elke kleuring eis tegemoet te komen. Een belangrijke verbetering is het vermogen te verkrijgen, binnen 10 urn weefselcoupes, lage achtergrond signalen met hoge resolutie kan worden afgebeeld door confocale microscopie en wide-field conventionele epifluorescentie. Bovendien, de drievoudige kleuring werkte met een groot aantal antilichamen tegen cellulaire en virale eiwitten. Het volledige protocol duurt 2,5 dagen om antilichaam en sondepenetratie tegemoet in het weefsel.

Inleiding

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is een hardnekkige menselijke neurotropisch virus, oprichting van een lange-termijn latente infectie in neuronen van de nervus ganglia (TG) van het perifere zenuwstelsel, waaruit reactiveert periodiek te repliceren en te verspreiden. De HSV-1-genoom is een 150 kb dsDNA lokaliseren in de kern van het ontvangende neuron waar het blijft chromatinized multicopy plasmiden die niet integreren in het gastheercelgenoom ^1,2. Tijdens latentie wordt de HSV-1 replicatiecyclus genetisch programma sterk onderdrukt en genexpressie beperkt tot de latentie geassocieerde transcriptie (LAT) locus van latentie inrichting inleiding van reactivering ^3. LAT produceert een lange 8,5 kb niet-coderende RNA in een grote 2 kb stabiel lasso verwerkt en verschillende miRNA ^4-7. HSV-1 latentie wordt derhalve gekenmerkt door de aanwezigheid van het virale genoom DNA, RNA LAT en de afwezigheid van detecteerbare replicatiecyclus eiwitten.

NHOUD "> Animal modellen, voornamelijk muizen en konijnen, zijn experimentele modellen indient verschillende kenmerken van latency bij de mens. Een van de voornaamste belangen van deze modellen is dat ze het bestuderen van de fysiologische aspecten van HSV-1 latentie bij immuuncompetente gastheren. In de afgelopen decennia Veel experimenteel hulpmiddelen, zoals genetisch gemodificeerde virussen en muizen, zijn ontwikkeld om de fysiologie, genetica en celbiologie van HSV-1 latentie uit dierlijke weefsels te bestuderen. Tot nu werd viraal genomisch DNA gedetecteerd en gekwantificeerd door Southern blot en qPCR van gedissocieerd TG. Er is echter nog geen methode beschikbaar voor HSV-1-genoom te detecteren door in situ hybridisatie op weefselsecties ^8. Daarom wordt latentie routinematig beoordeeld op coupes door de detectie van LAT RNA door RNA in situ hybridisatie plaats virale genoom detecteren. Omdat het onmogelijk is om geïnfecteerde cellen te karakteriseren op basis van de aanwezigheid van virale genomen, this technische beperking is een belangrijk nadeel van de analyse van vele aspecten van de gastheer-virus interacties, zoals de relatie tussen het virale genoom en cellulaire en virale genexpressie of de gastheer-cel gemedieerde immuunrespons ^9,10.

Belangrijker, de cel-naar-cel heterogeniteit van de latente infectie blijft relatief onontdekt en is aangetoond dat een belangrijk kenmerk van latentie in muizen en menselijke sensorische ganglion neuronen geïmplanteerd in SCID muizen ^11-17. Typisch werd aangetoond door qPCR dat de HSV-1-genoom kopieaantal per cel varieert van 5 tot enkele honderden. Hoewel LAT verschijnt als een belangrijke regulator van latentie en reactivatie, qPCR gegevens over geïsoleerde neuronen en in situ PCR aangegeven dat slechts een subset van latent geïnfecteerde neuronen, zo laag als 30%, drukt de LAT locus ^11,12,18-21. Hoe de gastheercel en cellulaire omgeving in het weefsel effect van het virus latentie inrichting envirale genexpressie blijft onduidelijk. Hier beschrijven we een sterke fluorescente in situ hybridisatie (FISH) werkwijze voor de efficiënte detectie van laag copy HSV-1 genoom DNA in dierlijke neuronaal weefsel secties. Deze methode is ontworpen en door ons gebruikt om toegang tot hoge resolutie microscopie die nodig is om de interactie van het virale genoom studie met de gastheercel intra-nucleaire componenten ²² krijgen. Verder beschrijven we een meervoudige kleuring werkwijze voor de gelijktijdige detectie van het virale DNA met RNA en eiwitten, die een uniek instrument om de virus-gastheer interacties die virale genexpressie reguleren beschrijven. De werkwijze kan ook worden toegepast voor een breed scala van analyses die de detectie van HSV-1 latent genoom, zoals kwantificeren geïnfecteerde neuronen in groot aantal secties. Een belangrijke stap is antigenen behandelen op het virale DNA hybridisatie toegankelijk maken. Aldus kan dit protocol ook efficiënt voor het detecteren zijnvan andere dsDNA virussen, die momenteel niet gedetecteerd door conventionele DNA-FISH benaderingen binnen dierlijke weefsels.

Protocol

Deze methode werd gebruikt in een studie eerder gepubliceerd ^22. Voor algemene achtergrond en beschrijving van conventionele manipulatie op ISH, IF en FISH, raden wij u de volgende beschikbare literatuur ^23.

1. Animal Infectie

Alle procedures waarbij proefdieren gelijkvormig aan ethische kwesties van de Vereniging voor Onderzoek naar Visie en Oogheelkunde (ARVO) verklaring voor het gebruik van dieren in onderzoek, en werden door de lokale Ethische Commissie van UPR-3296-CNRS, goedgekeurd in overeenstemming met de Europese Gemeenschap Richtlijn 86/609/EEG van de Raad. Alle dieren kregen onbeperkt toegang tot voedsel en water.

Werkwijze muis infectie met HSV-1 hieronder beschreven is gebruikt in studies eerder gepubliceerde ^24-26.

1. Bereid de volgende oplossingen voor te bereiden voordat uitgangspunt:
   
   HSV-1-virus stockoplossing
   Verlamming oplossing - Ketamine-100 mg / kg en xylazine-10 mg / kg
   
2. Neem 1 ui virus (10 pfu ⁶⁾ in een 5 ui glazen injectiespuit verbonden met een micro pompinrichting levert 0,1 gl / sec. Opmerking: Resuspendeer de virusvoorraad in fenolrood-vrij medium om de grens tussen de rode olie bekijken presenteren het capillair en de virusoplossing en lucht injectie op de plaats van virusinoculatie voorkomen.
3. Leg de verdoofde muis (Ketamine-100 mg / kg en xylazine-10 mg / kg) op zijn rug naar boven.
4. Plaats de narcose muis hoofd onder een binoculair stereo-microscoop en steek de naald in de subepitheliale laag van de linker bovenlip aan de grens mucocutaan. Injecteer de virusoplossing in twee stappen (tweemaal 0,5 pl) met een snelheid van 0,5 ul per 5 sec. Opmerking: Houd een 10 sec pauze tussen de 0,5 ul injecties, de virussuspensie staat te absorberen de injectieplaats.
5. Plaats de muis ineen 37 ° C incubator tot ontwaken.
6. Laat de muis in de dierlijke faciliteiten herstellen gedurende de vereiste tijd. Opmerking: In het muismodel, HSV-1 induceert een primaire infectie, genaamd acute infectie, die minder dan 10 dagen duurt op de plaats van inoculatie en op verschillende neuronale weefsels waaronder TG, superieure cervicale ganglia (SCG) en dorsale wortel ganglia (DRG), afhankelijk van de plaats van inoculatie. Tekenen van primaire infectie geleidelijk verdwijnen en latency wordt beschouwd als volledig vastgesteld vanaf ongeveer 28-30 dagen na infectie (dpi). Neuronale weefsels kunnen meestal worden geoogst van 4 dpi voor studies over acute infectie, en van 28 dpi voor latency studies.

2. Muis perfusie-fix

1. Bereid de volgende oplossingen voor aanvang: 50 ml fysiologische zoutoplossing buffer
   
   60 ml 1x PBS
   150 ml vers bereide 4% paraformaldehyde in 1x PBS
   60 ml 20% sucrose in 1x PBS.
   
2. Bereid de perfusieslang: sluit de naald een capillair, die is verbonden met een peristaltische pomp.
3. Verdoven van de muis zoals hierboven (srep 1.2) beschreven en leg hem op zijn rug op een dissectie lade, bevestigd door de vier poten met pinnen.
4. Met een schaar knip de huid van de buik tot aan de keel *. Afscheuren de dunne weefsel laag die de organen. Open de ribbenkast van het snijden van de ribben aan de ene zijde van het borstbeen. Verwijder de huid door af te scheuren. Ga uit de buurt van elkaar links en rechts delen van de ribbenkast naar het hart te onthullen. Opmerking: Let op de darmen, longen en grote schepen (halsslagaders en halsaders), die perfuse-fixatie onmogelijk zal maken niet insnijden.
5. Breng de naald in de linkerventrikel *. Incise de rechter atrium met de schaar. Ga door leegbloeden door injectie van 20 ml fysiologische zoutoplossing in de bloedvaten door het hart. Laat de bloedstroom in de lade. Geente: Tijdens deze procedure, let niet te doorboren via de andere kant van het hart.
6. Perfuse met 150 ml 4% PFA in 1x PBS gedurende 15 min * (Let op: PFA is giftig, te bewerken onder zuurkast). Perfuseren 60 ml 20% sucrose in 1x PBS gedurende 6 minuten. In dat stadium de muis is klaar voor TG oogst. Opmerking: Stel de pomp 10 ml / min. Een goede doorbloeding is merkbaar wanneer de muis staart verstijft, verhef dan weer vallen.

3. TG Oogsten

1. Bereid de volgende oplossing voor het starten:
   
   20% sucrose in 1x PBS
   
2. Snijd de kop ter hoogte van de nek. Snij het puntje van de neus net achter de snijtanden om de neusholte onthullen. Incise de mond twee met schaar en elke kant van de mond weg te trekken. Opmerking: de TG wordt net onder de mond, twee wit en langwerpige massa van 2-3 mm lengte zich rechts enlinks en verbonden met de nervus trigeminus.
3. Snijd de nervus trigeminus takken aan weerszijden van de TG de TGs los van de hersenstam. Verwijder de TG's met chirurgische tangen en bewaar ze in een 20% sucrose steriele oplossing voor 24 uur. Opmerking: Gebruik twee verschillende ontvangers voor de linker en rechter TG's, om verwarring tussen de linker TG (geïnfecteerde) en het recht TG (niet of te vermijden zwak besmet). Incubeer de TG in 20% sucrose in 1x PBS gedurende 24 uur voor inbedding.
4. Embed TG's in een enkel blok in cryosectioning inbeddingsmedium en bevriezen bij -80 ° C.
5. WINKEL blokken bij -80 ° C tot snijden.

4. Cryosection Voorbereiding

1. Snijd de TG's in de lengte als 10 urn op een -20 ° C cryostaat, en leg ze op een beetje verwarmd (30 ° C) Superfrost glijbanen. Laat de plakken drogen gedurende 5-10 minuten dan bevriezen en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Opmerking: maximaal 4-5 profielen zijn placed op een dia, indien groot aantal secties tegelijkertijd te verwerken. We gaan als volgt: seriecoupes gedeponeerd op 3 reeks dia gemerkt A1, B1 en C1 dan A2, B2, C2 enzovoort. Daarom kan elke dia reeks (A, B, en C) worden verwerkt voor verschillende kleuring (in situ hybridisatie, FISH, in situ PCR LCM) en data verkregen met de verschillende technieken worden vergeleken wetenschap dat dia die hetzelfde nummer overeen tot dezelfde regio van de TG.

5. HSV-1 Probe Labeling

Het protocol hierna beschreven voor het detecteren van HSV-1-genoom door DNA FISH succes gebruikt met twee typen probes. De eerste is een home-made Cy3-gelabelde fluorescente probe die geschikt is voor de fijne analyse van de nucleaire organisatie in individuele cellen, door een sterke vergroting fluorescentie microscopie is. De tweede is een commercieel beschikbare gebiotinyleerde probe, te combinerend met peroxidase gebaseerde signaalversterking om een ​​helder signaal. De laatste is geschikt voor de identificatie en kwantificering van het virus bevattende neuronen bij een lage vergroting geheel sectie en voor de analyse van het HSV-1 genoom patronen. Eindgebruikers moeten beoordelen welke aanpak het beste het doel van hun studie past. De commercieel verkrijgbare sonde wordt vermeld in de sectie reagens, en de voorbereiding van de zelfgemaakte sonde wordt hieronder beschreven.

1. Bereid de volgende oplossingen voordat u begint:
   
   HSV-1 genoom bestaande vectoren (zie stap 1)
   70% ethanol, moleculaire biologie rang.
   
2. . Bereid cosmiden met 30 kb gedeelten van HSV-1 genoom (cosmiden nummer 14, 28 en 56 beschreven in referentie ²⁰ gebruikt zuivering kolommen gewijd aan grote vectoren Opmerking: andere type bibliotheken die HSV-1 genoom, zoals bacteriële kunstmatige chromosomen moet zo goed werkt, zolang de sondebedekkingen alarge gedeelte van het HSV-1-genoom om voldoende signaal ^27-29 produceren. In onze handen heeft probes gemaakt van de cosmide vector backbone geen signaal te produceren, en werden gebruikt als negatieve controle. Aldus volledige cosmide vectoren die HSV-1 sequentie werden in onze studie. Het is ook mogelijk uit te snijden het HSV-1 sequentie en gebruiken om de probe te bereiden.
3. . Label 2 ug van elk cosmid met Cy3-dCTP met een nick-vertaling kit volgens de richtlijnen fabrikant Opmerking: Voer labeling met een reactiemengsel dat alleen Cy3-dCTP en geen ongelabelde dCTP.
4. Stop de reactie door toevoeging van 3 pi 0,5 M EDTA in het mengsel en verwarming bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Afkoelen op ijs.
5. Zuiveren de sonde op een G50 gel uitsluiting minikolom. Voeg 150 pg zalmsperma DNA aan de probe en precipiteren de sonde door ethanolprecipitatie. De DNA-pellet moet roze vanwege Cy3 oprichting. Was de pellet met 70% ethanol en verwijder zoveel ethanolmogelijk met een pipet. Laat de pellet drogen.
6. Los het pellet met 100 ul van gedeïoniseerd formamide (Let op: formamide is giftig Manipuleer onder zuurkast.). De probe concentratie niet betrouwbaar gemeten op dit punt. De in de tekst genoemde probe hoeveelheden gelden voor de hoeveelheid van het matrijs-DNA gebruikt om de probe te maken. Het protocol is gebaseerd op 2 ug DNA template en 100 pl formamide, wordt het beschouwd als 20 ng / ul zijn. Bewaren bij -20 ° C. De gemerkte probe kan worden bereid in grote hoeveelheden en ingevroren bewaard gedurende enkele maanden.

6. DNA-FISH

Figuur 1 toont een overzicht van de belangrijkste stappen van de DNA-FISH protocol en hoe DNA-FISH voeren als deel van een meervoudige kleuring experiment RNA en eiwitten codetect, zoals beschreven in Protocols 7-9.

1. Bereid de volgende oplossingen voordat u begint:
   
   0,5% Triton X-100 in 1x PBS
   2x SSC en 0,2 x SSC buffer
   100 mM pH 6,0 citraatbuffer (10x voorraadoplossing) en 10 mM pH 6,0 citraatbuffer (werkoplossing)
   2x hybridisatie buffer (zie Protocol 4)
   
2. Op dag 1, plaats de dia's op een houder bij kamertemperatuur, en laat de secties drogen gedurende 10 minuten. Cirkel de secties met een hydrofobe pen. Rehydrateren de secties in 1x PBS gedurende 10 minuten. Incubeer de secties 20 min met 0,5% Triton X-100 in 1 x PBS om het weefsel permeabilize. Was 3x 10 minuten met 2x SSC en in 2x SSC totdat de ontmaskering buffer wordt verwarmd (zie hieronder).
3. Voor ontmaskering, bereiden een dia dienblad glas (20 dia capaciteit) gevuld met 200 ml 10 mM natriumcitraat buffer (pH 6,0). Plaats de plaat in een grotere pot gevuld met 500 ml gedestilleerd water. Deze instelling zorgt voor een betere controle van verwarmings-pulsen. Voor het plaatsen van de dia's in de lade, verwarm de buffer in de magnetron totdat de buffer bereikt fractie (ongeveer 8 minuten bij 800 W).
4. Plaats de dia's in de voorverwarmde citraat-buffer met lade en controleer of ze volledig zijn bedekt met buffer. Vuur ongeveer 20 seconden totdat de buffer bereikt kookpunt. Voorzichtig, laat niet de buffer dan kook, die het weefsel kunnen beschadigen. Afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Herhaal de verwarmings cyclus 6x (7 verwarmingscycli totaal) *. Afkoelen 2 min en de dia's over te dragen in 2x SSC voor 5min.
   * Opmerking: Dit is een van de meest kritische stappen. Het optimale aantal en de duur van verwarmingscycli moet empirisch worden bepaald en kan variëren afhankelijk van het type weefsel of het soort gebruikte sonde. De magnetron, bak, container en volume buffer in de lade en water in de container dient voor de reproduceerbaarheid van ontmaskering identieke bewaard. Overmatige koken kan leiden tot verlies van weefsel en beschadigde cellen. Voor elk CV puls, wordt het uiterlijk van kokende zorgvuldig bekeken, en warmteING moet stoppen bij de eerste tekenen van koken. Eenmaal ingesteld, verschijnt ontmaskering robuust en reproduceerbaar. Figuur 2A laat zien dat HSV-1-genoom kunnen worden gedetecteerd door ontmaskeren met verschillende buffers, wat aangeeft dat ontmaskering voorwaarden verder kan worden onderzocht. Citraat-gebaseerde ontmaskering bleek consequent goede FISH signaal, en weefsel bewaring, met delen uit verschillende laboratorium en diermodellen.
5. Incubeer de glaasjes in een methanol: azijnzuur: PBS mix (03:01:04) gedurende 15 minuten, dan in een methanol: azijnzuur mix (3:1) gedurende 15 minuten (Let op: azijnzuur is bijtend Manipuleer onder rook. kap en gebruik voldoende bescherming. Bereid deze oplossing vlak voor gebruik).
6. Dehydrateer de doorsnede van opeenvolgende 10 minuten incubatie in 70%, vervolgens 2x 10 min in 100% ethanol. Laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Droog houden tot sonderen.
7. Bereid de indringende oplossing als volgt: bereiden op voorhand een 20 ml voorraad van 2x hybridisatiebuffer containing 20% ​​dextransulfaat (MW 500.000), 2x Denhardt's oplossing, 4x SSC *. Aliquot de oplossing 500 ui in microbuisjes en bewaar bij -20 ° C. 1 glijbaan (dekglaasje van 22 mm x 50 mm), meng 90 ng HSV-1 Cy3 gemerkte probe (30 ng probe voor elk cosmide) en vul het volume op 40 ui met formamide. Voeg 40 ul 2x hybridisatiebuffer. Meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
   Opmerking *: Om de 2x hybridisatie buffer te bereiden, meng 4 g MW 500.000 dextraansulfaat in 10 ml gedestilleerd water. Het maakt een visceus mengsel die oplossen bij 3-4 uur bij 70 ° C. Mix regelmatig te helpen oplossen. Voeg 4 ml 20 x SSC, 400 gl 100x Denhardt's oplossing. Vullen tot 20 ml en meng goed met een vortex.
8. Drop 80 ul van het sonderen oplossing op de droge delen. Dek af met een 22 mm x 50 mm glas dekglaasje, en controleer of de indringende oplossing verspreidt zich overhet gehele oppervlak van het dekglaasje. Let op: er mogen geen luchtbellen. Aanwezigheid van bellen verlaagt hybridisatie efficiëntie. Dicht de dekglaasje met behulp van rubber cement, en laat het drogen. Bewaar de objectglaasjes in het donker bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur voor optimale hybridisatie signaal gedurende de dia.
   Opmerking: Rubber cement is handig omdat het snel droogt, is waterdicht en beschermt het monster tegen uitdroging tijdens hybridisatie. Het is ook gemakkelijk te pellen uit de dekglaasje na hybridisatie te verwijderen. Nagellak is een alternatieve efficiënt, maar minder handige optie.
9. Ga door denaturatie door het plaatsen van de glaasjes met een 80 ° C incubator gedurende slide 5 minuten. Als alternatief kunt u de dia's op een metalen lade en plaats de lade in een 80 ° C waterbad (de bak moet drijven). Dan snel de dia's overzetten op een metalen dienblad geplaatst op ijs. Laat gedurende 5 minuten. Breng de dia's bij 37 ° C (glijbaan verwarming of incubator) voor overnachting hybridisatie.
   Let op: Het is niet raadzaam korter hybridisatie, wat resulteert in een zwak of geen signaal.
10. Op dag 2, verwijder de rubber cement met een tang, met behoud van de glijbaan op de kachel naar de sectie bij 37 ° C te houden Verwijder het dekglaasje voorzichtig met de punt van een scalpel.
11. Was 3x met 2x SSC bij 37 ° C gedurende 5 min, en drie maal met 0,2 X SSC bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Eenmaal met 2 x SSC bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en verder met DNA kleuring en bevestigingsmiddelen (zie Protocol 10 hieronder).
    Opmerking: Deze methode maakt de detectie van cellulaire genoom doelstellingen met corresponderende probes in de indringende oplossing met HSV-1-specifieke probes zoals gepubliceerd centromere en pericentromeric sequenties ^22.

7. Dual RNA-DNA FISH

Zie figuur 1, groene vakjes voor een overzicht.

Voor meerderekleuringen zoals een RNA-FISH stap wordt algemeen geadviseerd RNA detectie eerst uitvoeren als zodanig doel is gevoelig voor afbraak door RNAse en chemicaliën. Bovendien DNA-FISH werkwijze omvat behandelingen die de efficiëntie van andere vlekken te verminderen. Voor RNA-FISH, kozen we een enzym gebaseerde detectie aanpak (tyramide Signal Amplification (TSA) met behulp van gebiotinyleerde probes en peroxidase (HRP) gekoppeld streptavidine). TSA is gebaseerd op een fluorescent tyramide substraat (zie tabel reagens voor details), die covalent is gebonden aan het weefsel door een peroxidase enzymatische reactie. Het RNA-FISH signaal wordt dus behouden tijdens DNA-FISH.

1. Bereid de volgende oplossingen voordat u begint:
   
   Vector voor in vitro transcriptie van LAT locus (pSLAT-2)
   1x PBS bevattende 2 mM RVC
   0,5% Triton X-100 in 1 x PBS bevattende 2 mM RVC
   3% H ₂ 0 ₂ in gedestilleerd water.
   70%, 80%, 95% ethanol, moleculaire biologie rang.
   4x RNA-hybridisatie-oplossing (zie Protocol 4)
   
2. Ten minste een dag voor de RNA-FISH experiment, bereiden de RNA FISH probe. De HSV-1 Wachttijd geassocieerde Transcript (LAT) te detecteren, stelt een gebiotinyleerde ribo-probe van de pSLAT-2 vector ³⁰ of een vector voor in vitro transcriptie van de LAT locus, zoals eerder beschreven in referentie ^26. Kort: lineariseren 10 ug pSLAT-2 met HindIII en zuiver het gedigereerde vector met een DNA-zuiveringskit. Synthetiseren een enkele streng ribo-probe van 2 ug verteerd pSLAT-2 met een T7 in vitro transcriptie kit in aanwezigheid van biotine-16-UTP *. Zuiver de probe met RNA mini-kolom en kwantificeren bij 260 nm met een spectrofotometer. Verdun de sonde 50 ng / ul in DNase / RNase vrij water en bewaar bij -80 ° C in kleine porties aan bevriezen-ontdooien cycli voorkomen.
   * Opmerking: de biotine-16-UTP: UTP werkzaam moet empirisch worden bepaald. We fond een 40:60 verhouding tot sondes efficiënt opsporen LAT door RNA-FISH bieden.
3. Op dag 1, plaats de dia's op een houder bij kamertemperatuur, en laat de secties drogen gedurende 10 minuten. Cirkel de secties met een hydrofobe pen. Rehydrateren de secties in 1x PBS met 2 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex (RVC) * gedurende 10 minuten. Incubeer de secties gedurende 20 minuten met 0,5% Triton X-100 in 1 x PBS bevattende 2 mM RVC het weefsel permeabilize. Was 3x 10 min. met 1x PBS, 2 mM RVC. Om endogene peroxidase activiteit te lessen, incubeer de sectie in 3% H ₂ O ₂ voor 2x 10 min, en dan een keer wassen met 1x PBS, 2 mM RVC.
   * Opmerking: Door de RNA-FISH procedure ribonucleoside vanadyl complex (RVC) wordt toegevoegd aan buffers en oplossingen RNA degradatie voorkomen.
4. Incubeer 2x 10 min in 70% ethanol. In dit stadium kunnen secties worden opgeslagen in 70% ethanol bij -20 ° C gedurende enkele weken. Dehydrateer de secties door incubatie in 80%, 95% en 100% ethanol, 5 minuten elk. Laat het gedeelte drogen tenminste 10 minuten.
   Opmerking: In sommige gevallen kan ethanolbehandeling schadelijk voor de detectie van andere doelen zijn. Een alternatieve protocol met behulp van een prehybridisatie stap in 50% formamide - 2x SSC kan worden gebruikt (zie hierna in Protocol nr. 9 voor meer informatie over triple kleuring). Echter, ethanol behandeling is de meest veelzijdige aanpak voor RNA-FISH en biedt de laagste achtergrond.
5. Bereid de indringende oplossing als volgt: bereiden op voorhand een 10 ml voorraad van een 4x RNA-hybridisatie-oplossing die 8x SSC, 20x Denhardt's oplossing, 4 mM EDTA, 40% dextran *. Aliquot de oplossing 500 ui in microbuisjes en bewaar bij -20 ° C. Voor 1 glijbaan bereiden 80 ul oplossing (dekglaasje van 22 mm x 50 mm), door mengen 20 ng gebiotinyleerd LAT riboprobe, 40 ng tRNA, 2 mM RVC, en volledig 20 pl water. Voeg 20 ul van 4x RNA hybridisatie-oplossing en 40 glformamide (50% uiteindelijke concentratie). Voor gemakkelijker pipetteren en mengen, is het raadzaam om de 4x RNA-hybridisatie-oplossing voorverwarmen op 75 ° C. Meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
   Opmerking *: De 4x RNA hybridisatie-oplossing te bereiden, mengen 4 g dextransulfaat (MW 500.000) in 3 ml gedestilleerd water en 4 ml 20 x SSC. Het maakt een visceus mengsel dat oplost na 3-4 uur bij 70 ° C. Mix regelmatig te helpen op te lossen. Voeg 2 ml 100x Denhardt's oplossing en 80 pi van een 0,5 M EDTA-oplossing. Vullen tot 10 ml met water en meng goed met een vortex. Let op: gebruik alleen RNAse / DNase-vrije producten.
6. Denatureren de sonde 10 min bij 75 ° C. Ondertussen, plaats de dia's op een dia incubator ingesteld op 65 ° C. Drop 80 ul van probe-oplossing op de secties en snel plaats een dekglaasje op de druppel. Let op: er mag geen zeepbel. Aanwezigheid van bellen afneemt hybridisatie efficiency. Incubatie moet plaatsvinden in een bevochtigde kamer omdat het dekglaasje niet is afgedicht. Gebruik of een glijbaan incubator die water kan vasthouden (zie materiaal tabel), of bereid een vochtige kamer in een verzegelde doos en plaats deze in een 65 ° C hybridisatie oven.
7. Incubeer overnacht bij 65 ° C. Opmerking: LAT RNA-FISH wordt uitgevoerd bij 65 ° C uitgevoerd specifieke binding van de probe, die is waargenomen bij 37 ° C te voorkomen Veel andere RNA-probes FISH zou moeten resulteren in goede signaal bij 37 ° C.
8. Op dag 2, alvorens wassen, bereiden detectie reagens volgens de instructies van de fabrikant van de TSA detectie kit. Detectie wordt uitgevoerd met een commerciële TSA detectie kit met een mierikswortel peroxidase (HRP) gekoppeld streptavidine en een groen of blauw fluorescent substraat.
9. Houd de dia's op de dia verwarming op 65 ° C. Verwijder voorzichtig het dekglaasje en snel toevoegen van 1 ml van 50% formamide in 2x SSC, een voorverwarmdet 65 ° C. Voorzichtigheid, laat niet de sectie droog. Was tweemaal 10 min bij 65 ° C in 50% formamide in 2x SSC en 2x 10 min in 2x SSC bij 65 ° C. Nogmaals wassen met 2x SSC en plaats de dia op een 37 ° C Schuif de kachel.
10. Ga verder met de detectie stap volgens de TSA detectie kit fabrikant instructie. De concentratie van HRP-streptavidine, moet de concentratie van fluorescerende substraat en de reactietijd empirisch bepaald *. Voor LAT RNA detectie we routinematig gebruikt de volgende voorwaarde: HRP-streptavidine verdund tot 1/500, fluorescerend reagens bij 1/100 voor blauwe fluorescentie en 1/500 voor groene fluorescentie en reactietijd van 10 minuten. Het signaal kan snel worden gecontroleerd met een omgekeerde fluorescentie microscoop zonder montage, alvorens verder te gaan met DNA-FISH.
    Opmerking *: De amplificatieprotocol zal ontwerp zijn volgens de belangrijkste doelstellingen van het experiment. Om bijvoorbeeld nauwkeurig lokaliseren het doel-RNA, is adVised korte reactietijd te gebruiken. In tegenstelling, om snel te identificeren en te tellen positieve cellen bij lage vergroting, reactietijd kan worden verhoogd tot een heldere genereren.
11. Voor DNA-FISH, volg dan de hierboven aangegeven procedure, vanaf de ontmaskering stap (stap 6.2).

8. Immuno-DNA FISH

Zie figuur 1, paarse dozen voor een overzicht.

Net als bij RNA-DNA-FISH, is het aangeraden om eerst de immunofluorescentie voeren, omdat DNA-FISH is waarschijnlijk eiwitten denatureren en hun detectie te voorkomen door antilichamen. De kwaliteit van immunofluorescentie signaal sterk afhankelijk van het antilichaam karakteristieken en verscheidene antilichamen moet mogelijk worden getest wanneer. Epitoop ontmaskering is een keer eerder de immunofluorescentie uitgevoerd om zowel de eiwitdetectie en DNA-FISH verbeteren. Om de immunofluorescentie signaal op het monster tijdens de DNA-FISH procedure te behouden is het noodzakelijk om cov isalently koppelen aan het weefsel. We presenteren hier twee benaderingen die goede resultaten die in onze handen, antilichaam post-fixatie en tyramide gebaseerde detectie (zie stap 8.5). De keuze moet worden aangestuurd door voorafgaande proeven voor elke doelgroep / antilichaam paar.

1. Bereid de volgende oplossingen voordat u begint:
   
   1x PBS dat 3% normaal geitenserum (NGS).
   2% PFA in 1x PBS (verdunning van de 4% voorraad-oplossing)
   
2. Op dag 1 wordt de eerste stappen zijn identiek aan DNA-FISH tot de ontmaskering stap (stappen 6,1-6,2).
3. Na ontmaskeren Incubeer de secties met 1 x PBS dat 3% NGS gedurende 1 uur.
4. Incubeer met het primaire antilichaam verdund in 1 x PBS dat 3% NGS gedurende 24 uur. Lagere incubatietijd kan worden gebruikt om het protocol te verkorten, hoewel we vonden dat een overnacht incubatie resulteert meestal in een sterker signaal. Tot 48-72 uur incubatie nodig kan zijn voor een lage affiniteit primaire antilichamen zoals IgM.
5. Op dag2, was 3x 10 minuten met 1x PBS.
6. Protocol met antilichaam post-fixatie: incubeer 1 uur met het secundaire antilichaam in combinatie met een groene fluorescente kleurstof, op 1/200 in 1x PBS dat 3% NGS. Was drie keer 10 minuten met 1x PBS. Na de fixatie wordt uitgevoerd met 2% PFA in 1x PBS gedurende 10 min *. Was 3x 10 min. met 1x PBS.
   Protocol met TSA detectie: incubeer 1 uur met de HRP-gekoppeld secundair antilichaam op 1/250 in 1x PBS dat 3% NGS. Was drie keer 10 minuten met 1x PBS. Ga verder met tyramide detectie volgens de instructies van de fabrikant. Zoals hierboven (stap 7.9), reagens verdunning en reactietijd aangegeven moet empirisch worden bepaald. Meestal is ons protocol gebaseerd op een 1/500 verdunning van het fluorescerende substraat en een 10 minuten reactietijd. Was 3x 10 min. met 1x PBS.
   Opmerking *: Post-fixatie is een cruciale stap in immuno-FISH, en vereist een zorgvuldige opzet. Hoe sterker de post-fixatie debeter het IF signaal en de onderste DNA-FISH efficiëntie.
7. Ga verder met DNA-FISH van de methanol-azijnzuur (stap 6.3). Duur van de immuno-DNA-FISH is meestal 3 dagen, met het eerste antilichaam overnacht geïncubeerd.

9. Dubbele DNA-RNA FISH combinatie met immunofluorescentie

Zie figuur 1, oranje dozen voor een overzicht.

RNA-FISH wordt eerst uitgevoerd, gevolgd door immunofluorescentie, en ten slotte DNA-FISH. Als immunofluorescentie gedetecteerd door tyramide reactie, is het belangrijk om volledig de HRP activiteit blussen van de RNA-FISH stap met H ₂ O _2, en controleren of quenching efficiënt. Dit gebeurt met behulp van een dia als "geen primair antilichaam" control.

Omdat op ethanol uitdroging is schadelijk voor sommige oplosmiddelgevoelige eiwitten kan deze stap RNA-FISH remmen immunofluorescentie. Zo ja, kan RNA-FISH w worden uitgevoerdith een alternatief protocol, zoals in STPE 9.3 hieronder.

1. Bereid de volgende oplossing voor het starten:
   
   50% formamide in 1x PBS bevattende 2 mM RVC
   
2. Op dag 1, bereiden RNA-FISH probe en ga als voor dual-RNA FISH tot H ₂ O ₂ quenching stap (stap 7.2).
3. Case 1, de immunofluorescentiekleuring werkt na ethanol uitdroging: doorgaan met RNA-FISH zoals hierboven aangegeven in de stappen 7,3-7,9. Ga dan naar beneden stap 9.6.
4. Case 2, wordt de immunofluorescentie kleuring voorkomen door ethanolbehandeling: Zet de objectglaasjes in een vochtige kamer op een dia verwarmer ingesteld op 65 ° C en incubeer gedurende 1,5 uur in een prehybridisatie-oplossing die 50% formamide, 1 x PBS en 2 mM RVC. Giet de prehybridisatieoplossing en drop 80 ul van hybridisatie-oplossing, zoals aangegeven in de stappen 7.4 en 7.5. Ga dan verder met RNA-FISH hybridisatie en detectie zoals aangegeven Above stapsgewijs 7,6-7,9 (dag 2 en 3).
5. Op dag 2 na RNA-FISH is voltooid, gaat met immuno-DNA-FISH beginnen met de ontmaskering stap (zie stap 6.2). Volg daarna de immuno-DNA-FISH protocol zoals hierboven aangegeven in de stappen 8,2-8,6.

10. Dia bevestiging en Imaging

1. Bereid de volgende oplossing voor het starten:
   
   Hoechst 33342 bij 0,5 ug / ml in 1x PBS
   
2. Stain kernen gedurende 10 minuten met DAPI of Hoechst 33342 * bij 0,5 ug / ml in 1x PBS gedurende 10 minuten. Was 3x 10 min. met 1x PBS.
   Nota *:. Let op Als een van de detectiesystemen gebruikt een fluorescerende blauwe kleurstof, gebruik geen DAPI of Hoechst. Gebruik in plaats daarvan een fluorescerende DNA kleurstoffen met een emissie spectra binnen de ver-rode golflengte zoals Topro3.
3. Tap zoveel vloeistof als mogelijk van de glijbaan. Drop 80 pl fixeermiddel dat een antifading agens aan een uiteinde van de schuif. Bedek de secties met een hoge optische kwaliteitdekglaasje (n ° 1.5 glas). Laat het dekglaasje gaan langzaam door onderhoud ervan aan een uiteinde met een tang, teneinde het fixeermiddel verspreid via sectie laten zonder luchtbellen.
4. Afdichting met nagellak en bewaar bij 4 ° C in een donkere dia doos.
5. Directe waarneming van DNA-FISH signaal van latente HSV-1 genoom een ​​40x of hogere vergroting olie immersie objectief, met een hoge numerieke apertuur (bijvoorbeeld 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) en een excitatie lichtbron vereist ten minste gelijkwaardig is aan een 100 W kwiklamp. Wij adviseren het gebruik van een zeer efficiënte transmissie microscoop zoals die door fabrikanten in de laatste 5 jaar (zie tabel van apparatuur). Confocale microscopie biedt tools om beelden met een lagere achtergrond als gevolg van auto-fluorescentie van het weefsel, zoals slijpplaatonderzoek of spectrale beeldvorming verzamelen.

Resultaten

Na enkele maanden van uitgebreide tests, ontdekten we dat warmte gebaseerde chemische ontmaskering gemaakt latent HSV-1 genoom beschikbaar voor fluorescente in situ hybridisatie. Tijdens het proces, we probeerden verschillende ontmaskering procedures en alleen warmte gebaseerde behandelingen (bijv. verwarmen van de onderdelen tot sub-kooktemperatuur in een magnetron) verscheen efficiënt. Vervolgens testten verschillende zoutbuffers die routinematig worden gebruikt in immunohistochemie (IHC) en elektron...

Discussie

De hier beschreven protocol maakt de detectie van HSV-1 genoom latent in neuronen van muizen neuronaal weefsel secties. Onze kennis van de trajecten reguleren virale genexpressie beperkt door een gebrek aan methode HSV-1 genomisch DNA te detecteren in situ in neuronale weefsels. Informatie over genoom kopie aantal en het aandeel van geïnfecteerde neuronen kwam vooral van PCR-analyse op los neuronen ^11,12. In het ophelderen van de rol van de gastheer-cel nucleaire architectuur op HSV-1 latentie, zette...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Balb/c muizen	Janvier, Frankrijk		6 weken oude vrouwtjes
HSV-1 stammen	SC16 stam (wild type)		Zie Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) voor details over HSV-1 stam en virus stock bereiding.
Ketamine hydrochloride	Sigma	K2753	Intraperitoneale injectie van een oplossing met Ketamine (100mg/kg) en Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Hang 4 g PFA op in 90 ml water. Voeg 50 µl van 1N NaOH toe, en verwarm op 60 °C in een waterbad met agiterende. PFA lost op in ongeveer 30 min. Voeg 10 ml van 10x PBS toe. Deze oplossing kan van tevoren worden bereid en opgeslagen bij -20 °C in 5 ml buizen. Voorzichtigheid. Manipulatie onder een afzuigkap.
Fysiologische zoutoplossing	Sigma	07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (steriele)	Life Technologies	10010-015
Sucrose	Sigma	84100	Bereid een 20% sucrose oplossing in 1x PBS.
Cryosectioning inbeddingsmedium - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583
Grote vector DNA zuiveringskit	Qiagen	12462	Voor het zuiveren van Cosmid of BAC vector bevattend HSV-1 genoom en bewaar bij -20 °C
Nick translatie kit	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Bescherm tegen licht
0.5 M EDTA	Sigma	E6758
G50 Mini spin column	GE Healthcare	27-5330-01
Salmon sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Ethanol moleculaire biologie kwaliteit	Sigma	87047	Bereid een 70% oplossing
Salmon sperm DNA	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Formamid moleculaire biologie kwaliteit	Sigma	F9037	Voorzichtigheid. Manipulatie onder afzuigkap.
HSV-1 biotinylerde commerciële sonde	Enzo Life Sciences	ENZ-40838
ImmEdge hydrofobe pen	Vector Laboratories	H-4000
20x Saline Sodium Citraat (SSC)	Sigma	S6639	Bereid een 2x SSC oplossing in ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Bereid een 10% stock oplossing in water en bewaar bij +4 °C. Bereid de 0,5% oplossing in 1x PBS vlak voor gebruik.
10 mM Natriumcitraat pH 6.0	Sigma	S1804	Bereid een 100 mM stock oplossing (10x). Weeg 10,5 g citroenzuur (MW 210,14). Voorzichtigheid, irriterend en toxisch, draag een geschikt masker en handschoenen), en los op in 400 ml water. Pas pH aan op 6,0 met 1 N NaOH (Voorzichtigheid, irriterend, draag handschoenen). Pas aan tot 500 ml met gedestilleerd water. Verdun 10x in gedestilleerd water voor gebruik.
Azijnzuur	Sigma	320099
Methanol, moleculaire biologie kwaliteit	Sigma	322415
Dextransulfaat - MW 500.000	Euromedex	EU0606-A
Denhardt's oplossing (100x)	Euromedex	1020-A
Rubber Cement "FixoGum"	Marabut	290110000
DNA zuiveringskit  - Qiaquick PCR zuiveringskit	Qiagen	28104
T7 in vitro transcriptie kit	Ambion Life Technologies	AM1314
Biotin-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910
RNA zuiveringsminikolom	Qiagen	73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	Bereid een 3% oplossing in gedestilleerd water. Bewaar bij +4 °C en bescherm tegen licht.
Gist tRNA	Invitrogen	15401011	bereid een 10 mg/ml oplossing in RNAse vrij water
Normaal geitenserum	Invitrogen	PCN5000
Primaire antilichamen	elke leverancier		De volgende primaire antilichamen werden gebruikt in de resultaat sectie: anti-muis CENP-A (konijn mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), en anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secundaire fluorescente antilichamen	Invitrogen Life Technologies		De fluorescente secundaire antilichamen die routinematig worden gebruikt in ons protocol zijn Alexa Fluor gelabelde geitenantilichamen (IgG H+L). Het antilichaam dat in de resultaat sectie werd gebruikt is een anti-konijn geitenantilichaam gelabeld met Alexa Fluor 488 (referentie A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blauwe fluorescentie)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	TSA kits zijn ook verkrijgbaar van Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (groene fluorescentie)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	Bereid een 0,5 µg/ml oplossing in 1x PBS direct voor