Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De neurale (NC) is een voorbijgaande dorsale neurale buis populatie cellen een epitheel naar mesenchym transitie (EMT) eind neurulatie ondergaat, migreert uitgebreid naar verschillende organen en differentieert in vele soorten derivaten (neuronen, glia, kraakbeen en bot, gepigmenteerde en endocriene cellen). In dit protocol beschrijven we hoe te ontleden de premigratory craniale NC van Xenopus laevis embryo's, met het oog op NC ontwikkeling te bestuderen in vivo en in vitro. De kikker model biedt vele voordelen voor de vroege ontwikkeling te bestuderen; overvloedige partijen beschikbaar zijn, embryo's ontwikkelen zich snel, in vivo winst en verlies van functie strategieën mogelijk manipulatie van genexpressie voorafgaand aan NC dissectie in donor en / of gastheer embryo's. De NC explanten kan worden uitgeplaat op fibronectine en gebruikt voor in vitro studies. Ze kunnen worden gekweekt gedurende enkele dagen een serumvrij gedefinieerd medium. We beschrijven ook hoe NC explants terug te entenin gastheercellen embryo voor het bestuderen NC migratie en differentiatie in vivo.
Inleiding
De neurale (NC) is een voorbijgaande embryonale celpopulatie dat uit de neurale buis eind neurulatie in gewervelde embryo. De signalering en genetische gebeurtenissen die NC specificatie controle zo vroeg gastrulation. De NC wordt gespecificeerd bij de grens tussen de neurale en niet-neurale ectoderm door signalen van omringende dorsale weefsel. Eind neurulatie, NC cellen een epitheel naar mesenchym transitie (EMT) ondergaan en migreren uitgebreid in het embryo volgende stereotype routes door te reageren op omgeving leidende signalen. Zodra ze hun eindbestemming hebben bereikt, ze differentiëren tot een breed scala van derivaten, bijvoorbeeld neuronen, glia, bot, kraakbeen, en gepigmenteerde cellen 1-5. Door hun bijdrage aan vele soorten cellen en embryonale weefsels, gebreken bij elke schakel van NC cellen ontwikkeling, van inductie tot de uiteindelijke differentiatie, kan aangeboren syndromen genoemd neurocristopathies 6 veroorzaken. EXperimental manipulatie van de ontwikkeling van NC in verschillende stadia - specificatie, EMT, migratie en differentiatie - zal ons begrip van neurocristopathies verbeteren en laat het ontwerp van potentiële therapeutische strategieën.
De Xenopus laevis embryo is een model van de keuze om NC ontwikkeling te bestuderen. Grote aantallen embryo's zijn eenvoudig te verkrijgen en externe bemesting geeft toegang tot de eerste stappen van de ontwikkeling. Veel tools zijn beschikbaar om experimenteel te manipuleren X. laevis embryonale ontwikkeling. Gene gain-of-functie en knockdown zijn eenvoudig uit te voeren door microinjecting individuele cellen van de vroege blastulas. Embryonale weefsels kunnen voor in vitro reassociatie 7-11 of back-enten assays 12,13 worden gesneden.
In dit protocol beschrijven we hoe te ontleden premigratory craniale NC in X. laevis laat neurulas, voorafgaand aan de migratie. Deze explantaten kunnen worden gekweekt op fibronectine bekld platen migratie en differentiatie bestuderen gecontroleerde in vitro experimentele omstandigheden. NC explanten kan ook worden geënt op normale of gemanipuleerd gastheer embryo's om hun migratie en differentiatie te bestuderen in vivo.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimenten voldoen aan de nationale en Europese regelgeving inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en met de internationaal vastgelegde beginselen van vervanging, vermindering en verfijning.
1. Bereiding van fibronectine gecoate Gerechten 14
- Pipetteer 500 ml 10 mg / ml kweek rang fibronectine verdund in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een standaard plastic petrischaal (Ø 40 x 11 mm). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: bij gebruik van glazen schalen of glazen dekglaasjes voor latere beeldvorming, gebruik maken van een 100 mg / ml fibronectine oplossing.
- Spoel driemaal met 1x PBS.
- Vervang PBS met 500 ml 1x PBS/0.1% runderserumalbumine (BSA). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Spoel driemaal met 1x PBS.
- Vul met 1x PBS en bewaar bij 4 ° C tot gebruik (gewoonlijk 24-48 uur).
2. Dissectie van de NC Explantaten
- Bereid 3/4 Normaal Amphibian Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml Gentamycine 10,15). Neem niet meer dan 1 week niet te houden voor dissectie, bewaren bij 4 ° C. Oudere NAM kan worden gebruikt voor het bereiden-agarose gecoate dissectie gerechten (hieronder).
- Bereid 60 mm petrischaaltjes voor dissectie, bekleed met 10 ml van 2% agarose in 3/4 NAM.
- Verzamel dissectie-instrumenten: plastic pasteurpipetten, een beste insect pin gemonteerd op pin houder (zie materialen tabel als referentie), een "wenkbrauw mes" (gemaakt met wenkbrauwhaar ingebed in paraffine op het puntje van een glas Pasteur pipet 16), twee fijne dissectie pincet, P1000 pipet en tips, een verrekijker stereoscoop met vergroting 8-40X tot 50, een heldere lichtbron met optische vezels gidsen. Alle ontleden gereedschap moet schoon worden gehouden; na elk experiment, spoel ze tweemaal met gedestilleerd water, eenmaal with 100% ethanol en laat drogen. Uit de buurt van stof.
- Vul de dissectie schotel met verse NAM bijna tot aan de top.
- Verkrijgen X. laevis embryo's volgens standaard procedures 10 en ze ouder worden tot ze neurula stage 16 bereiken (volgens ontwikkelingsstoornissen tafel 17 Nieuwkoop en Faber).
- Plaats stadium 16 embryo's in de dissectie schaal met de plastic Pasteur pipet.
- Verricht alle volgende stappen onder de binoculair scope. Verwijder de vitelline membraan met twee paar pincetten. Wees voorzichtig het dorsale gedeelte van de embryo's niet te beschadigen.
- Wacht tot de embryo stadium 17 hebben bereikt om de ontleding te beginnen. Stage 17 is nodig omdat de neurale duidelijk onderscheiden van de neurale buis, in tegenstelling tot eerdere fasen. Na de etappe van 17, NC begint migreren en vermenging met de omringende mesenchym.
- Graaf een klein gaatje in de agarose met een tang om een niche voor de embryo's te maken om te handhavenhen tijdens de dissectie. Plaats een embryo dorsale kant naar boven. Opmerking: boetseerklei kan worden gebruikt om de embryo plaats graven van een gat in de agarose te handhaven.
- Maak een insnijding in de zijkant van het voorste neurale plooi met de wenkbrauw mes en insecten pen. Wees voorzichtig niet te diep in het embryo: doel via 2-3 cellagen (nooit bereiken zo diep als de archenteron!) Te snijden. Gedurende het gehele proces dissectie nooit toestaan dat de ontleed weefsel in contact met de lucht-vloeistof interface daar X. te openen laevis embryonale weefsels worden gelyseerd door oppervlaktespanning.
- Een tweede parallelle insnijding in de meer dorsale gedeelte van de neurale vouw dezelfde methoden gebruikt.
- Indien nodig is, zet de schotel ongeveer 90 °. Maak een derde loodrechte incisie met de wenkbrauw mes en insecten pen, aan de achterste zijde van de eerste twee incisies. De NC is een dikke massa cellen onder de gepigmenteerde buitenste laag van het ectoderm, lateralede neurale buis.
- Gebruik de punt van de wenkbrauw mes om de gepigmenteerde ectoderm laag los van de onderliggende NC, vanaf de derde snijrand.
- Gebruik de zijkant van de wenkbrauw mes NC weefsel vanaf de derde incisie los. De NC weefsel is nogal grijzig, terwijl de onderliggende cefalische mesoderm is wit. Scheiden de NC voorzichtig uit het mesoderm.
- Maak de NC weefsel naar voren uit de optische blaasje, en snij op dit niveau aan de explantatie te bevrijden. Als controle voor de eerste experimenten controle snail2 expressie (canonieke NC marker) in sommige explantaten door in situ hybridisatie wordt aanbevolen.
3. Plating Explantaten op Fibronectine
- Fill-in-the-fibronectine gecoate schaal met Gewijzigde Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mm, Na2CO 3 5 mm K Gluconate 4,5 mM, Na Gluconate 32 mm, MgSO4 1 mM CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, aan te passen pH tot 8,3 met 1 M Bicine 18).
- Breng de explantaten in de fibronectine gecoate schaal met een P1000 pipet. Laat nooit de explantaten om de lucht-water grensvlak raken. Eerste, pipet wat vloeistof in de punt, dan is de explantaten, dan komen er weer vloeistof. Gebruik geen lucht niet toe dat in de punt tijdens de overdracht van de explantaten in de fibronectine gecoate schaal. Zodra de tip is in de vloeistof van de fibronectine gecoate schaal, laat de explantaten langzaam naar beneden gaan door de zwaartekracht, of duw heel voorzichtig. Vermijd het uitwerpen van de explantaten te snel.
- Plaats 10-30 explantaten in de schaal met de wenkbrauw mes. Vermijd de wanden van de capsule, die niet voldoende voor verdere beeldvorming.
- Probeer niet om de schotel te bewegen totdat de explantaten op de fibronectine hebt aangesloten (dit duurt ongeveer 15-30 minuten). Desgewenst kunt u de schotel zeer zorgvuldig.
- De schaal in een gekoelde incubator (tussen 15-20 ° C, temperatuur grafiek zie 17). Wanneer geplaatst bij 15 ° C, cellen are meestal migreren efficiënt en verstrooiing na 6 uur incubatie (deze timing kan variëren tussen de experimenten).
4. Enten Explantaten in Host Embryo
- Snijd een goed glas dekglaasje in zeer kleine stukjes met behulp van grof tang. De grootte van de stukken moeten ongeveer 1,5 mm2 zijn. Dompel de stukjes in een petrischaal met 3/4 NAM of PBS behulp van een tang.
- Voorbereiding van de gastheer embryo: ontleden de gastheer NC in 3/4 NAM zoals beschreven in 3) met speciale zorg de gastheer embryo niet beschadigt tijdens het verwijderen van de vitelline membraan en het ontleden van de NC. Het weefsel spanning neiging om de grootte van het ablatie verhogen: laat de ontvangende embryo genezen gedeeltelijk tijdens het ontleden van de donor embryo.
- In een andere agarose gecoate schaal of ander deel van dezelfde schotel, ontleden de NC explantaat uit de donor embryo zoals beschreven in protocol 3. Breng de NC transplantaat in de schaal met de gastheer met zorg, zoals beschreven inProtocol nr. 3.
- Plaats direct het NC explant op de host ablated gebied met behulp van een tang. De explant moet gedeeltelijk hechten. Leg een stuk glas dekglaasje op de geënte embryo om het transplantaat op zijn plaats te houden. Kies een stuk glas groter is dan het embryo om beschadiging te voorkomen. Het embryo zal een beetje afgeplat zijn.
- Wacht minstens 15-20 minuten, verwijder dan voorzichtig het dekglaasje. Laat het embryo herstellen gedurende nog 10 min en voorzichtig pipetteren deze in een schone bak gevuld met 3/4 NAM via de plastic Pasteur pipet.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer uitgeplaat op fibronectine, de neurale explantaten hechten snel (15-30 min) en de explantatie verspreidt vlakke binnen 2 uur (Figuur 1A). Na 3-6 uur cellen beginnen te verspreiden. Na 24 uur bij 15 ° C, zijn vele cellen begonnen vanaf de explantatie (figuren 1B en 1C) migreren. Dooier maakt cellen zeer helder onder fase-contrast (Figuur 1B). Cel uitsteeksels (filopodes en lamellipodes) zijn duidelijk zichtbaar na phalloidin kleuring van het acti...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een eenvoudige techniek om premigratory craniale NC explanteren in X. laevis embryo's. De embryo's die voor dergelijke experimenten moeten robuust te zijn en goed te genezen. Gooi alle partij van ongezonde embryo's. Bovendien groeien embryo bij verschillende temperaturen (van 12 tot 18-20 ° C), om neurale accijns in stap 17 en uiterlijk. Na stap 17, kunnen neurale worden gemengd met cephalic mesoderm en kan niet volledig worden verwijderd. Xenopus weefsels snel genez...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Adeline Dolly voor de foto's van explantatie op fibronectine, Eric Theveneau voor nuttige discussies en de Animal Facility van het Institut Curie. CM is een postdoc van de regio Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Universite Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche) en Agence Nationale de la Recherche. Dit werk werd gefinancierd door de Universite Paris Sud (Attractivite 2011), het Centre National de la Recherche Scientifique (Actie Thematique et stimulerend van aard sur-programma), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, en Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche programma Blanc).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fibronectin uit bovien plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovien Serum Albumine, Fractie V | Euromedex | 04-100-811-C | Lager kwaliteitsniveau kan geschikt zijn voor deze toepassing |
| Roestvrijstalen Insectenpins, Maat 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 pincet 0,05 mm x 0,02 mm | FST | 11252-20 |
Referenties
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
- Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
- Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
- Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
- Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
- Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).
- Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
- Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
- Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
- Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. New York. (1994).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
- Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
- Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
- Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
- Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
- Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
- Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
- Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
- Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
