Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren Chlamydia Vacuole groeidynamiek in levende cellen

Samenvatting

Een methode op basis van fluorescente eiwitten in levende cellen voor het verlichten van cellulaire vacuolen (insluitsels) die Chlamydia bevatten, wordt beschreven. Deze strategie maakt een snelle, geautomatiseerde bepaling van Chlamydia-infectiviteit in monsters mogelijk en kan worden gebruikt om de groeidynamiek van insluitsels kwantitatief te onderzoeken.

Samenvatting

De obligate intracellulaire bacterie Chlamydia levert een grote belasting op de wereldwijde volksgezondheid. C. trachomatis is de belangrijkste bacteriële oorzaak van seksueel overdraagbare infecties en ook de belangrijkste oorzaak van voorkombare blindheid in de wereld. Een essentiële bepalende factor voor succesvolle infectie van gastcellen door Chlamydia is het vermogen van de bacterie om signaalroutes van gastcellen te manipuleren vanuit een nieuw, vacuolair compartiment genaamd de inclusie. Vanuit de inclusie verwerven Chlamydia voedingsstoffen die nodig zijn voor hun 2-3 dagen durende ontwikkelingsgroei, en ze scheiden bovendien een reeks effector-eiwitten uit op het cytosolische oppervlak van het vacuolemembraan en in het gastheercytosol. Gaten in ons begrip van de biologie van Chlamydia vormen echter aanzienlijke uitdagingen voor het visualiseren en analyseren van dit intracellulaire compartiment. Onlangs werd een reverse-imagingstrategie beschreven voor het visualiseren van de inclusie met behulp van GFP-expresserende gastcellen. Deze benadering maakt rationeel gebruik van de intrinsieke ondoorlaatbaarheid van het inclusiemembraan voor grote moleculen zoals GFP. In dit werk beschrijven we hoe GFP- of mCherry-expresserende gastcellen worden gegenereerd voor daaropvolgende visualisatie van chlamydiale inclusies. Bovendien wordt aangetoond dat deze methode effectief kan worden gebruikt als vervanging voor dure antilichaamgebaseerde telmethoden, kan worden gebruikt in tandem met andere fluorescente labels, zoals GFP-expresserende Chlamydia, en kan worden gebruikt om belangrijke kwantitatieve gegevens over inclusiemembraangroei te verkrijgen van een reeks Chlamydia-soorten en -stammen.

Inleiding

Infectieziekten veroorzaakt door species van de intracellulaire bacterie Chlamydia wekken grote belasting voor wereldwijde gezondheid, waaronder seksueel overgebrachte ziekte, eileiderontsteking, blindheid, longontsteking en eventueel atherosclerose ^1-4. Het vermogen van Chlamydia om met de gastheercel, vanuit een vacuole (genaamd de opname), is een bepalende factor voor hun succesvolle infectie van cellen en de gastheer. De opname is een nieuwe pathogene compartiment dat chlamydia groei mogelijk maakt en wordt dynamisch aangepast gedurende de hele 2-3 dag ontwikkelings cyclus van Chlamydia ^5. De obligate intracellulaire aard van chlamydiae presenteert talrijke uitdagingen voor de onderzoeksgemeenschap, in het bijzonder voor het direct bestuderen van de unieke biologie van de integratie. Een grote handicap is het onvermogen om efficiënt te visualiseren ofwel intracellulaire Chlamydia of hun opname door TL-aanpakes in levende cellen. Een recente ontdekking heeft eindelijk onthuld de middelen om GFP tot expressie C. genereren trachomatis ^6; echter, is deze bevinding nog niet geleid tot de specifieke kenmerken van de integratie. Sommige technieken zijn beschreven voor labeling van bacteriën en insluitsels ^7,8, maar ze vertonen tekortkomingen zoals niet-specificiteit, vergankelijkheid en gevoeligheid voor fotobleken. Een belangrijke ontdekking door onze groep werd een nieuwe strategie voor het verlichten van de opname met behulp van GFP tot expressie gastheercellen ^9. Deze strategie rationeel exploiteert de intrinsieke ondoordringbaarheid van de opname membraan moleculen groter dan 520 Da ^10. Wanneer cellen worden gemanipuleerd om stabiel drukken een bepaald cytosolische fluorescent eiwit (bijvoorbeeld GFP of mCherry), Chlamydia insluitsels zichtbaar met opmerkelijk heldere hun volledige uitsluiting van fluorescentie. Deze omgekeerde beeldvorming strategie maakt directe visualisatie van insluitsels voor alle Chlamydia species en kan gemakkelijk worden aangepast voor de meeste gastheercellen van belang. Als een demonstratie van het nut ervan, werd deze methode eerder gebruikt te onthullen en te definiëren de cellulaire exit routes voor Chlamydia spp ^9.

Hier hebben we verder aan te tonen hoe deze methode wordt uitgevoerd, en kan worden benut om belangrijke kwantitatieve gegevens over de groei inclusie dynamiek ontlenen. Bovendien kan het effectief vervangen dure antilichamen gebaseerde inventarisatie werkwijzen en kan worden gebruikt in combinatie met andere fluorescente labels, zoals mKate2-expressie Chlamydia ^11. Deze krachtige combinatie van instrumenten mogelijk maakt onderzoek van de fysische eigenschappen van de chlamydiale membraan integratie binnen levende gastheercellen.

Protocol

1. Generatie van Fluorescent gastheercellijnen

1. Dag 1. Plaat 293T cellen (of andere retrovirale verpakkingslijn) op 6-putjes platen bij 2 x 10 ⁶ cellen / putje, worden ~ 75% confluent de volgende dag. Desgewenst plaat duplo putjes voor elk retrovirus te gebruiken.
2. Dag 2. Zuig cellen en voeg 2 ml vers groeimedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine). Transfecteren van cellen met 5-8 ug per retrovirale vector (bevattende GFP) en verpakkingsvector (bv., PVSVg) met gebruik van Lipofectamine 2000 of soortgelijke reagentia en de instructies van de fabrikant.
3. Incubeer de cellen met DNA voor 4-6 uur in een 37 ° C _CO2 incubator, en vervolgens vervangen door medium met 1 ml groeimedium.
4. Incubeer cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C CO ₂ incubator.
5. Dag 3. Plaat doelcellen (bv., HeLa) op 6-putjes platen bij een geschatte dichtheid van 10 ⁵ cellen / putje, worden ~ 50% confluent dede volgende dag. Controleer positieve transfectie in 293T-cellen door het volgen GFP fluorescentie op een omgekeerde microscoop.
6. Dag 4. Collect retrovirus-bevattende supernatanten uit 293T cellen met behulp van een pipet en filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 urn spuitfilter celluloseacetaat.
7. Verwijder medium uit HeLa-cellen en voeg 0,5 ml kweekmedium dat 16 ug / ml polybreen. Voeg ~ 0,5 ml gefiltreerd retrovirus cellen druppelsgewijs en incubeer cellen in een 37 ° C _CO2 incubator gedurende 24 uur. Slaan alle resterende retrovirus (dwz van zowel het dupliceren) bij 4 ° C.
8. Dag 5. Indien duploputjes werden gemaakt om extra retrovirus Herhaal stap 1,7 genereren om serieel te infecteren met de rest van retrovirale deeltjes.
9. Dag 6. Passage getransfecteerde HeLa-cellen 1: 1 in een 10 cm schotel met selectie antibioticum (bijvoorbeeld 500 ug / ml neomycine).
10. Wacht voldoende tijd getransduceerde cellen om terug te groeien in aanwezigheid van selectie antibiotic, waarna de cellen kunnen worden vermeerderd door standaardtechnieken met een lagere concentratie selectie antibioticum (bv., 200 ug / ml neomycine).
    Opmerking: Cellen kunnen ook klonaal worden gekozen voor een optimale helderheid op dit moment, indien nodig.

2. Genereren van GFP tot expressie Chlamydia trachomatis

1. Bereid 2x _CaCl2 buffer (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl ₂₎ en 4SP buffer (0,4 M sucrose, 16 mM Na ₂ HPO _4).
2. Dag 1. Ontdooi bevroren C. trachomatis voorraad op ijs en onmiddellijk verdunnen 10 pi bacteriën in 50 ul 2x _CaCl2 buffer. Voeg 3 ug plasmide DNA (bv., PASK-GFP-mKate2-L2), mengen en incuberen gedurende 30 min bij 25 ° C.
3. Tijdens deze stap te bereiden gastheercellen door trypsinizing een T-75 kolf van McCoy-cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Resuspend celpellet in zodanige hoeveelheid van 1 x _CaCl2 buffer tot een eindconcentratie van 4 x 10 ⁷ cellen / ml.
4. Na 30 min incubatie (uit stap 2.2), voeg 100 ul bereid McCoy cellen transformatiemengsel buis (totaal volume 200 ui) en incubeer nog eens 20 min bij 25 ° C. Voeg 100 ul van deze getransformeerde cel mengsel tot een enkel putje van een 6-wells plaat en overlay met 2 ml groeimedium. Incubeer bij 37 ° C in een _CO2 incubator gedurende 2 dagen.
5. Dag 3. Lyse McCoy cellen geïnfecteerd met C. trachomatis door medium vervangen door 1 ml dH _{2 O} en schrapen cellen met een gebogen 1000 ui pipet tip. Voeg 1 ml 4SP buffer en passeren suspensie door een 27,5 G naald ~ 5 keer voor een efficiënte cellysis en afgifte van C. trachomatis.
6. Overdracht 2 ml van het cellysaat bevattende C. trachomatis een T-75 kolf die een confluente monolaag van vers uitgeplaat McCoy cellen; voeg 8 ml DMEM (zonder FBS) en incubeer gedurende 2 uur bij 25 ° C C. toestaan trachomatis te houden aan cellen.
7. Aspireren cellen en voeg vers medium growth gesupplementeerd met 10 U / ml penicilline G en 1 ug / ml cycloheximide. Incubeer kolf gedurende 48 uur in een 37 ° C CO ₂ incubator.
8. Dag 4. Controleer met lichtmicroscopie dat cellen worden besmet en insluitsels bevatten afwijkende Chlamydia. Identificeren insluitsels zo helder vacuoles op een standaard lichtmicroscoop, en afwijkende Chlamydia organen ring-achtige objecten binnen insluitsels die groter zijn dan 2 micrometer doorsnede.
9. Dag 5. Lyse cultuur door het medium vervangen met 2 ml dH _{2 O} en schraap cellen in een suspensie. Voeg 2 ml 4SP buffer en passeren suspensie door een 27,5 G naald ~ 5 keer.
10. Gebruik 2 ml cellysaat een nieuwe monolaag van McCoy-cellen te infecteren in een enkel putje in een 6-wells plaat. Incubeer cellen met lysaat gedurende 2 uur bij 25 ° C, aspireren en voeg verse groeimedium met penicilline G en cycloheximide.
11. Incubeer cellen in een 37 ° C _CO2 incubator gedurende 3-5 dagen, afhankelijk van de algemene gezondheid van de cellen.
12. Herhaal stap 2,9-2,10 één of meer keren, indien nodig, passage culturen in verse putjes in een 6-wells plaat tot normaal uitziende insluitsels (zonder afwijkende instellingen) ontstaan. Op dit moment gebruik maken van een omgekeerde fluorescentie microscoop om te controleren of C. trachomatis uiten mKate2 (rood).
13. Opschalen geïnfecteerde kweken voor het genereren van hoge titer Chlamydia voorraden, bijvoorbeeld door het oogsten Chlamydia transformanten van geïnfecteerde McCoy of HeLa-cellen gekweekt in T-150 kolven.

3. Infecteren Cellen met Chlamydia

1. Plate GFP-HeLa cellen op gewenste kweekvat, bijvoorbeeld glazen bodem gerechten of kamer objectglaasjes voor hoge resolutie beeldvorming of 24-well platen voor IFU bepalen en multiwell screening.
2. Dooi weerzen buis met C. trachomatis, C. muridarum of C. pneumoniae op ijs en verdund in HBSS gewenste multipliciteit van infectie (MOI), bijvoorbeeld MOI = 1.
3. Voer statisch of centrifugeren aided infecties op basis van de specifieke Chlamydia stam die wordt gebruikt.
   1. Voor infecties met C. trachomatis LGV serovar L2 of C. muridarum, was GFP-HeLa-cellen met HBSS en geïncubeerd met verdunde bacteriën gedurende 2 uur bij 25 ° C. Aspireren en wassen cellen met HBSS, en incubeer cellen in groeimedium bij 37 ° C CO ₂ incubator.
   2. Voor infecties met C. trachomatis serovar D of C. pneumoniae, was GFP-HeLa-cellen met HBSS en voeg verdunde bacteriën aan cellen. Plaats multiwell plaat of een glazen bodem schaal (vastgezet met tape in een multiwell plaat deksel) in een multiwell plaat houder van een swingende emmer rotor bijlage in een benchtop centrifuge.
   3. Centrifugeer cellen bij 900 xg bij 25 ° C gedurende 1 uur.
   4. Kweekvaten verwijderen uit centrifuge en plaats in een 37 ° C CO ₂ incubator gedurende 1 uur.
   5. Aspiraat cellen in een bioveiligheid kast, wassen cellen tweemaal met HBSS en voeg vers groeimedium. Plaats cellen in een 37 ° C CO ₂ incubator.

4. Levende Cell Visualisatie van Chlamydia Inbegrepen

1. Verwijder Chlamydia besmet GFP-HeLa-cellen van _CO 2 incubator en vervangen door medium met RPMI zonder fenolrood + 5% FBS.
2. Mount cellen op een omgekeerde fluorescentie microscoop (Nikon Eclipse Ti-E of vergelijkbaar) met behulp van een 20X of hoger olie doelstelling.
3. Met behulp van imaging software (Volocity 6 of iets dergelijks), gericht op het identificeren en Chlamydia besmet GFP-HeLa-cellen: groene cellen met grote zwarte gaten (Chlamydia inclusies).
4. Markeer de xyz locaties van gebieden met Chlamydia geïnfecteerde cellen van belang het gebruik van imaging software (Volocity 6 of iets dergelijks). Uitvoeren van deze door het handmatig 'toevoegen Points', terwijl in de XY Stage weergavemodus. Op deze wijze worden XYZ coördinaten opgeslagen voor elke gemarkeerde positie.
5. In het dialoogvenster Overname doos, software configureren naar groen (GFP, HeLa cytosol) en rode (mKate2, C. trachomatis) kanalen, en met een snelheid van nieuwe frames per kanaal om de 5 min te verwerven.
6. Verwerven van de beeldsequentie met de overname protocol hierboven opgegeven door te klikken op de "Capture Record /" knop.

5. kwantificering van Inclusie Groei Parameters in levende cellen

1. Op gewenste tijden na de infectie (bv., 24, 48 HPI) verwijder Chlamydia GFP geïnfecteerde HeLa-cellen uit incubator en monteren op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Opmerking: een objectief met een hoge NA 20x of 40x air is het best geschikt voor 24-wells platen en een 40x olie doelstelling wordt aanbevolen voor Kamer slides. Kweek cellen aan beide substraat voor deze ezelay.
2. Focus op midplanes van de cellen, waar de insluitsels zijn op hun maximale diameter en op scherpe randen.
3. Acquire afbeeldingen voor vele gebieden in elk putje (minimaal 10 per well); putten vertegenwoordigen doorgaans herhalingen of experimentele variabelen.
4. Inventariseer het aantal insluitingen handmatig, door het oog (insluitsels zijn zwart compartimenten in GFP-HeLa-cellen) of gebruik maken van imaging software algoritmen om insluitsels automatisch te identificeren en te tellen.
   1. Vind GFP-HeLa-cellen door fluorescentie-intensiteit ('vind Objects' commando) en stel fluorescentie drempel intensiteit op basis van relatieve intensiteiten van de cellen.
   2. Filter geselecteerde objecten met behulp van grootte richtlijnen van het houden van die slechts groter is dan 5 micrometer ^2. Dit is 'populatie 1'.
   3. Solliciteer 'Vul Gaten in Objects' opdracht met 'bevolking 1' als de input. Deze stap genereert 'populatie 2'.
   4. Aftrekken 'bevolking 1' van 'population 2 'om de opbrengst positief gemarkeerd Chlamydia inclusies, aangeduid als' de bevolking 3 '.
   5. Toepassen size filter van "populatie 3" ("Filter Population" command) bijvoorbeeld houden voorwerpen groter dan 25 urn ² van insluitingen in geïnfecteerde cellen gedurende 24 uur of langer. Voor de vroege infectie maal, bijvoorbeeld vóór 18 uur, stellen grootte filter om objecten groter dan 4 urn ² te houden, omdat deze inclusies veel kleiner. Grootte filtering resulteert in een populatie van objecten als 'inclusies'.
   6. Bereken kwantitatieve gegevens uit afbeeldingen, bijvoorbeeld nummer opnemen, grootte integratie en inclusie omtrek, met behulp van beeldbewerkingssoftware.

Resultaten

Zoogdiercellen tot expressie cytosolische fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP) kan worden gemanipuleerd om verlichting van Chlamydia inclusies mogelijk in levende, geïnfecteerde celkweken. Na infectie met Chlamydia, insluitsels gemakkelijk zichtbaar als zwarte vlekken in de gastheercellen (figuur 1). De helderheid van fluorescentie ontbrekende insluitsels kan worden benut voor het automatisch identificeren van insluitsels op talloze gezichtsvelden en / of behandelingen <...

Discussie

Hier beschrijven we de experimentele strategie voor het genereren van fluorescente gastheercellen voor real time visualisatie en analyse van Chlamydia inclusies. Deze vacuole visualisatie benadering verleent het krachtige vermogen te verlichten, volgen en kwantitatief meten van de dynamische eigenschappen van Chlamydia inclusies tussen populaties van cellen of enkele cellen in de tijd. Chlamydia inclusies in fluorescent eiwit gelabelde cellen opvallend goed gedefinieerd, zodat ze gemakkelijk geïdentifi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534