Methodenartikel

Ultrasound Imaging-begeleide Intracardiale Injection een muismodel van borstkanker hersenmetastasen Gevolgd door Longitudinale MRI Ontwikkelen

18.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51146

⸱

6 maart 2014

 , 
1Radiology, University of Texas Southwestern Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Een borstkanker hersenmetastasen muismodel wordt vastgesteld met echografie-imaging geleide intracardiale injectie van MDA-MB231/Br-GFP cellen. Ontwikkeling van multifocale intracraniële metastasen is longitudinaal gevolgd met behulp van hoge-resolutie 9.4 T MRI.

Samenvatting

Borstkanker hersenmetastasen, die zich in 30% van de patiënten met borstkanker in stadium IV, is geassocieerd met een hoge mortaliteit. De mediane overleving is slechts 6 maanden. Het is cruciaal om geschikte diermodellen moet de hemodynamische verspreiding van de metastatische cellen in het klinische scenario nabootsen. Hier introduceren we het gebruik van kleine dieren echografie om een ​​nauwkeurige injectie van hersenen tropische borstkankercellen te begeleiden in de linker ventrikel van athymische naakt muizen. Longitudinale MRI wordt gebruikt voor het beoordelen intracraniële initiatie en groei van hersenmetastasen. Ultrageluid geleide intracardiale injectie zorgt niet alleen een accurate injectie en wordt een hoger percentage succesvolle maar ook aanzienlijk verminderde sterfte in vergelijking met onze vorige handmatige procedure. In vivo hoge resolutie MRI maakt de visualisatie van hyperintense multifocale laesies, zo klein als 310 urn in diameter op T 2-gewogen beelden na 3 weken na de injectie. Follow-up MRI openbaart intracraniële tumorgroei en toegenomen aantal metastasen die de gehele hersenen verdelen.

Inleiding

Hersenmetastasen is de meest voorkomende maligniteit bij volwassenen intracraniale. De prognose is zeer slecht, met een mediane overleving van 4-6 maanden zelfs met agressieve behandeling. Borstkanker is een van de drie belangrijkste primaire kanker met een hoge morbiditeit van hersenmetastasen 1-3. Verschillende hersenen-trope borstkanker lijnen zijn in staat om de ontwikkeling van de hersenen uitzaaiingen na intracardiale of intracarotide injectie 4. Directe injectie van tumorcellen in het linker ventrikel kan de long capillaire bed omzeilen en daarmee de frequentie van het vormen hersenmetastasen met minimale viscerale metastasen. De MDA-MB231Br lijn is een van de meest gebruikte menselijke borstkanker lijnen hersenenmetastase ontwikkelen in diermodellen 5,6.

Net als veel andere studies 4,7, hebben we handmatige procedure van intracardiale injectie uitgevoerd in onze eerdere studies. Echter, slechts 50% succes rate werd verkregen met de handmatigeinjectie en een fractie van muizen overleden aan de herhaalde invasieve procedures als voorafgaande proeven mislukt. Hier introduceren we het gebruik van een beeldvormende geleide procedure om de injectie van hersenen die borstkankercellen veilig in de linker ventrikel van athymische muizen. Longitudinale hoge resolutie MRI wordt toegepast op intracraniële ontwikkeling van hersenmetastasen volgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas Southwestern Medical Center.

1. Voorbereiding van de MDA-MB231/Br-GFP Cellen

  1. Ophalen en cultuur de MDA-MB231/Br-GFP cellen (vriendelijk verschaft door Drs. Palmieri en Steeg, NCI) in DMEM medium met 10% FBS, 1% glutamine en 1% penicilline / streptomycine.
  2. Let op de toestand van de cellen en kleur drager en vervang medium elke 2-3 dagen.
  3. Trypsinize en het verzamelen van de cellen bij 80% confluentie bereikt zoals beschreven in stappen 1.3.1-1.3.5:
    1. Verwijder het oude medium volledig en voeg 5 ml PBS (1x) om de cellen voorzichtig te wassen. Verwijder de PBS uit de schotel.
    2. Voeg 1,5 ml trypsine in de schaal; kantelt de schotel voorzichtig aan tot alle cellen worden gedekt door trypsine. Zet de schaal terug naar de cel incubator en houdt deze 37 ° C gedurende 1 min.
    3. Neem de schotel uit incubator en observerende cellen onder optische microscoop om de cellen los te waarborgen van de schotel.
    4. Voeg 3 ml medium om de werking van trypsine te stoppen. Verzamel de cel mengsel in een centrifugebuis. Centrifugeer het mengsel bij 2000 rpm gedurende 5 minuten.
    5. Verwijder het medium voorzichtig en resuspendeer de cellen in 5 ml serumvrij medium tot homogeen.
  4. Telling geschikte aantal cellen en resuspendeer ze in serumvrij DMEM medium met een uiteindelijke concentratie van 1,75 x 10 5 cellen in 100 pl volume.
    1. Neem 50 pi cel mengsel en voeg 50 ul trypaanblauwoplossing. Na mengen 10 ui mengsel en zorgvuldig toe te voegen aan de cel tellen glijbaan. Gebruik meerdere monsters om nauwkeurige schatting van het aantal cellen te waarborgen.
    2. Plak in de cel tellen glijbaan, een uiteinde in een tijd en de cel teller begint automatisch te tellen. Neem gemiddelde van alle telresultaten en bereken het totale aantal cellen.
    3. Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer henhet juiste volume van serumvrij medium te resulteren in de uiteindelijke concentratie van 1,75 x 10 5 cellen/100 pl volume.
  5. Plaats cellen op ijs voorafgaand aan intracardiale injectie.

2. Ultrasound Imaging-begeleide Intracardiale Injectie

  1. Gebruik vrouwelijk naakt muizen (BALB / c nu / nu) tussen 6-8 weken oud.
  2. Log in het imaging systeem. Initialiseer de transducer 704 (40 MHz).
  3. Start een nieuwe studie en vul de gegevens in.
  4. Verdoven (3% isoflurane/100% O2 per inductie kamer) en de dieren met isofluraan (2%) 100% O 2 (1 dm3 / min) te handhaven gedurende de gehele procedure via een neuskegel. Anesthesie wordt bevestigd wanneer er geen terugtrekking reflex is waargenomen met teen knijpen.
  5. Stel de temperatuur van de afbeeldingtafel tot 37 ° C. Tape de verdoofde muis om de verwarmde beeldvorming tafel in rugligging.
  6. Houd de ultrasone gel bij 37 ° C voorafgaand aan imaging. Breng de gel aan de borst van de muis.
  7. Monteer de transducer in de houder. Laat de transducer tot de gewenste beeldvorming diepte is bereikt. Beweeg de fase tot de linker ventrikel wordt geïdentificeerd met de aorta ascendens als oriëntatiepunt (figuur 1A). Vergrendelen de fase waarin een duidelijk beeld van de linker hartkamer wordt gevisualiseerd.
  8. Teken 100 ul van cel mengsel in een 1 ml spuit met een 22 G naald. Plaats en bevestig de spuit op de spuit monteren.
  9. Beweeg de spuit in de richting van de muis borst en beweeg het voorzichtig van links naar rechts totdat de naald zich in de beeldvorming gezichtsveld (alvorens de muis).
  10. Stel de naald hoogte en de hoek te streven langs de linker hartkamer.
  11. Doordringen in de naald in intercoastal ruimte onmiddellijk door de huid en spieren lagen in de linker ventrikel onder begeleiding van echografie.
    Een indicatie van succesvolle insertie van de naald in de linker ventrikel is het terugvloeien van verse arterieel bloed (roze kleur in tegenstelling tot donkerrood veneuze bloed) in de spuit
  12. Injecteer de cel mengsel langzaam (Figuur 1B).
  13. Na voltooiing, trekken de naald, til de transducer, het reinigen van de ultrasound gel met vochtig gaas en verwijderen tape.
  14. Bereid een schone kooi met een voorverwarmde pad.
  15. Leg het dier op het pad en observeer de dieren tot volledig herstel.
  16. Controleer het gedrag van het dier iedere 24 uur gedurende twee dagen.
  17. Algemene voorwaarden en neurologische tekenen van complicaties in de experimentele muizen worden routinematig gecontroleerd.

3. MRI Monitoring van intracraniële tumorontwikkeling

  1. Gebruik een 9,4 Tesla magneet om intracraniële ontwikkeling van de hersenen uitzaaiingen controleren.
  2. Initieer MRI twee weken na tumor implantatie en herhaal eenmaal per week gedurende drie weken.
  3. Verdoven de dieren met 3% isofluraan en te onderhouden onder genral anesthesie (1,5% isofluraan).
  4. Monitor en het dier lichaamstemperatuur en ademhaling constant gedurende het experiment te handhaven.
  5. Hoge resolutie multislice (14 segmenten met 1 mm dik, geen opening) T 1 - en T 2-gewogen coronale beelden, die het gebied van de frontale kwab van de fossa posterior, worden verkregen met de volgende parameters: T 1-gewogen beelden: spinecho meerdere slice (SEMS), TR / TE = 400 msec/20 msec, matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in het vlak resolutie: 78 x 78 micrometer 2. T 2-gewogen beelden: snelzwierend echo meerdere slice (FSEMS) sequenties, TR / TE = 2500 msec/48 msec, 8 echo treinen, matrix: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, in het vlak resolutie: 78 x 78 micrometer 28,9.
    Tumorlaesies lijken helderder dan normaal hersenweefsel op T 2-gewogen beelden.
  6. Tumor grootte wordt bepaald op T 2-gewogen beelden door handmatig een overzicht van de verhogendecing deel van de massa van elk beeld met behulp van MATLAB programma geschreven door ons 8.
    Aangezien de meeste van de tumor diameters kleiner dan de snijdikte (1 mm), wordt de tumorgrootte gepresenteerd in vlak terrein eerder dan het volume.

4. H & E kleuring Bevestiging van de Metastasen

  1. Offer de muizen direct na de laatste MR scant, ontleedt de tumor-dragende hersenen en insluiten in oktober medium en -80 ° C bevroren
  2. Gedeelte van een reeks van 10 urn dikke coronale hersenen exemplaren met cryostaat.
  3. Voer H & E kleuring van de hersenen secties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met de hoge ruimtelijke resolutie van MRI (78 urn CCD-resolutie) kan hyperintenseletsels geïdentificeerd zo klein als 310 urn diameter (figuur 2). Aangezien de metastasen in deze studie zijn zeer klein en ontwikkeling van necrose en oedeem is minimaal, de hyperintense laesie op T 2-gewogen beelden echt vertegenwoordigde de tumormassa.

Longitudinale studies MRI mogelijk in vivo niet-invasieve evaluatie van tumorgroei. Zoals getoond in figuur 3,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie hebben we aangetoond dat ultrageluid-beeldvorming geleide linker ventrikel injectie zorgt voor nauwkeurige zodat elk dier in deze studie ontwikkeld hersenmetastasen en geen dier dood waargenomen. De schoonheid van beeld-geleide injectie is dat het pad van de naald penetratie van de huid en tot slot in de linker ventrikel kan worden gecontroleerd en aangepast onder de afbeelding, die zich onderscheidt van de handmatige procedure vereist strikte anatomische oriëntatiepunten te volgen is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor Drs. Diane Palmieri en Patricia Steeg van NCI voor het verstrekken van ons MDA-MB231Br cellen. Wij danken dr. Ralph Mason, heer Jason Reneau en mevrouw Ramona Lopes voor technische en collegiale ondersteuning. Dit werk werd mede ondersteund door de DOD IDEA Awards W81XWH-08-1-0583 en W81XWH-12-1-0317. MRI-experimenten werden uitgevoerd in de Advanced Imaging Research Center, een NIH BTRP # P41-RR02584 faciliteit, en echogeleide intracardiale injectie werd uitgevoerd met VisualSonics Vevo 770 onder 1S10RR02564801.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMHyCloneSH30022.01 
TrypsinMediatech25-051-C1 
Automatische celtellerBioRadTC10 
IsofluraanBaxter International Inc.1001936060 
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System Visual Sonics Inc. 
9.4 T horizontale boring magneet met een Varian INOVA Unity-systeem Agilent 
O.C.T CompoundSakura Finetek USA4583 

Referenties

  1. Schouten, L. J., et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94, 2698-2705 (2002).
  2. Lin, N. U., et al. CNS metastases in breast cancer. J. Clin. Oncol. 22, 3608-3617 (2004).
  3. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nat. Rev. Clin. Oncol. , (2011).
  4. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 5664-5678 (2010).
  5. Yoneda, T., et al. A bone-seeking clone exhibits different biological properties from the MDA-MB-231 parental human breast cancer cells and a brain-seeking clone in vivo and in. 16, 1486-1495 (2001).
  6. Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Res. 67, 4190-4198 (2007).
  7. Percy, D. B., et al. In vivo characterization of changing blood-tumor barrier permeability in a mouse model of breast cancer metastasis: a complementary magnetic resonance imaging approach. Invest. Radiol. 46, 718-725 (2011).
  8. Zhou, H., et al. Longitudinal MRI evaluation of intracranial development and vascular characteristics of breast cancer brain metastases in a mouse model. PLoS One. 8, (2013).
  9. Zhou, H., et al. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, (2009).
  10. Zhang, R. D., et al. Differential permeability of the blood-brain barrier in experimental brain metastases produced by human neoplasms implanted into nude mice. Am. J. Pathol. 141, 1115-1124 (1992).
  11. Mason, R. P., et al. Tumor oximetry: comparison of 19F MR EPI and electrodes. Adv. Exp. Med. Biol. 530, 19-27 (2003).
  12. Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clin. Cancer Res. 17, 142-153 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celkweektrypsinisatieceltellinganesthesietumorbewaking

Gerelateerde artikelen