Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie

Samenvatting

Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.

Samenvatting

Depolymerisatie van microtubuli kan werking bieden aan verschillende eiwitcomplexen en met eiwit beklede korrels transporteren in vitro. De onderliggende mechanismen worden verondersteld om een ​​belangrijke rol spelen in het microtubuli-afhankelijke chromosoom bewegingen tijdens de celdeling, maar de betrokken eiwitten en hun exacte rollen zijn slecht gedefinieerd. Er is dus een groeiende behoefte aan assays waarmee dergelijke motiliteit in vitro bestuderen met gezuiverde componenten en gedefinieerde biochemische milieu te ontwikkelen. Microtubules zijn echter inherent instabiel polymeren, alsmede schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. De protocollen beschrijven we hier gebruik maken van de gesegmenteerde microtubuli die zijn gemaakt met de photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van dergelijke gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van studies van de beweeglijkheid bij de demontage uiteinden van microtubuli. Deze techniek kan worden gebruikt om caRRY een kwantitatieve analyse van het aantal moleculen in het fluorescentie-gemerkte eiwitcomplexen die processively met microtubulus uiteinden bewegen. Een signaal-ruisverhouding in deze en andere kwantitatieve fluorescentie assays optimaliseren, moet dekglaasjes worden behandeld om niet-specifieke absorptie van oplosbare fluorescent gelabelde eiwitten te verminderen. Gedetailleerde protocollen worden voorzien om rekening te houden met de ongelijkheid van fluorescentieverlichting, en bepalen de intensiteit van een enkele fluorofoor met equidistante Gaussische fit. Tenslotte beschrijven we het gebruik van gesegmenteerde microtubuli microtubuli-afhankelijke bewegingen van de met eiwit beklede microkorrels bestuderen, die inzicht in het vermogen van verschillende motorische en niet-motorische eiwitten te koppelen microtubule depolymerisatie te processive lading beweging.

Inleiding

Microtubuli sterk geconserveerd cytoskelet structuren die belangrijk zijn voor de cellulaire architectuur, celbeweeglijkheid, celdeling, en intracellulair transport ¹ zijn. Deze dynamische polymeren samenstellen uit tubuline in de aanwezigheid van GTP en schakelen ze spontaan tussen groei en verkorting ^2. Microtubules zijn zeer dun (slechts 25 nm in diameter) derhalve speciale optische technieken om het contrast moet worden gebruikt om microtubuli waarnemen met een lichtmicroscoop. Eerdere werk met deze polymeren onderzocht hun dynamisch gedrag met behulp van differentieel interferentie contrast (DIC) ^3. Deze en soortgelijke studies in vitro aangetoond dat onder normale experimentele omstandigheden, de microtubuli catastrofe en schakelaar om de depolymerisatie ondergaan slechts zelden, eens in de 5-15 min (deze frequentie is voor 7-15 mM oplosbaar tubuline concentratie bij 28-32 ° C onderzocht ) ^4. Verschillende technieken zijn dus voorgesteld induce microtubule depolymerisatie op een gecontroleerde manier. Microtubuli verkorting kan worden geactiveerd door wegwassen oplosbare tubuline ^5,6, snijden microtubuli met een laserbundel ^7, of met gesegmenteerde microtubules ^8, zoals hier beschreven. Contract met gesegmenteerde microtubules, evenals stochastisch schakelen polymeren, heeft gevonden dat kleine intracellulaire ladingen, zoals chromosomen, blaasjes en met eiwit beklede korrels, aan de uiteinden van de verkorting microtubuli ^9-13 bewegen. Dit fenomeen wordt gedacht aan een rechtstreekse gevolgen voor chromosoom bewegingen in mitotische cellen hebben, en de onderliggende mechanismen worden momenteel actief onderzoek ^14-16.

Onlangs hebben-tl-gebaseerde technieken, met inbegrip van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie, zijn gebruikt om de beweeglijkheid te studeren met dynamische microtubuli eindigt ^17-24. Het voordeel van deze benadering is dat het onderzoek van interacties tussen microtubuli en microtubuli bindende eiwitten in real time via eiwitten gelabeld met verschillende fluoroforen. Verschillende eiwitcomplexen bleken processively bewegen verlengen en / of verkorten uiteinden van microtubuli. Zij omvatten het met microtubuli geassocieerde eiwitten Dam1 ^10,12,18, Ska1 ¹⁹ en XMAP215 ^20, alsmede kinesine motor Kif18A ^21,22, MCAK ²³ en CENP-E ^24. Deze eiwitten vertonen processive tip-tracking, die fundamenteel verschilt van die van de klassieke-tip bijhouden eiwitten zoals EB1 ^25. Hoewel EB1 moleculen en de geassocieerde partners lijken te blijven stabiel geassocieerd met dynamische uiteinden van microtubuli, de individuele moleculen blijven gebonden aan de microtubuli tip voor slechts ~ 0,8 sec, snel uit te wisselen met de oplosbare zwembad ^26. In tegenstelling processieve tip-trackers, zoals Dam1, reizen met microtubuli eindigt voor veel micron, en hun associatie met microtubuli tips kan duren voor menige seconden. De tip vereniging tijd, en de resulterende snelheid tracking, hangt sterk af van het aantal moleculen die de tip bijhouden complex ²⁷ gevormd. Groter eiwit ensembles zijn meestal veel betere tip-trackers. Zo kunnen dergelijke complexe samenstellingen de geïsoleerde gist kinetochores gekoppeld blijven microtubuli uiteinden voor ²⁸ uur. Sommige microtubule-bindende eiwitten, bijv. Ndc80 kinetochore eiwitcomplex, bleken niet te volgen met microtubuli te eindigt bij een enkel molecuul, maar Ndc80 zeer efficiënt koppelen van de beweging van de kraal lading ^19,29-31. Dus, om het mechanisme van tip-volgen door verschillende eiwitcomplexen, evenals hun biologische rollen begrijpen, is het belangrijk tip tracking onderzocht als functie van het aantal moleculen in de tip bijhouden complex, en bepalen het vermogen van deze complexen collectieve motiliteit vertonen op het oppervlak van de kraal lading.

Hieronder vindt u gedetailleerde protocollen om experimenten voor te bereiden en uit te voeren met gesegmenteerde microtubuli (Figuur 1A). Eerst worden de handel verkrijgbare objectglaasjes gemodificeerd korte polyethyleen buis (Protocol 1) bevestigen. De herbruikbare microscopie stroom kamer wordt vervolgens geassembleerd uit zo'n glijbaan en het chemisch of plasma gereinigd en gesilaniseerd dekglaasje (protocol 2) ^32-34. Het resulterende volume kamer is slechts 20-25 pi (of zo klein als 15 pl, zie opmerking 3 in Protocol nr. 1), met inbegrip van het volume van de inlaat slang. Commercieel verkrijgbare stroomkamers kan worden gebruikt, maar hun omvang gewoonlijk groter, waardoor onnodige verspilling van eiwitten. Indien een grotere kamer wordt toegepast, moet het volume van alle oplossingen in onderstaande protocollen evenredig geschaald. Microtubuli zaden worden vervolgens bereid, bijvoorbeeld met langzaam hydrolyseerbare GTP analoog, GMPCPP (guanosine-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfaat) (protocol 3, zie ook Hyman e.a.. ^35). De zaden worden geïmmobiliseerd op een schoon dekglaasje en het oppervlak wordt vervolgens geblokkeerd om niet-specifieke absorptie van andere eiwitten voorkomen ³² (protocol 4 beschrijft zaden immobilisatie met behulp van digoxigenine). De gesegmenteerde microtubuli kan dan worden voorbereid met behulp van Protocol 5. De belangrijkste reden voor deze benadering is dat de microtubulus polymeren, die in aanwezigheid van GTP vormen, tijdelijk worden door toevoeging van de korte "caps" stabiele tubuline segmenten die GMPCPP bevatten gestabiliseerd. Deze kappen bevatten ook Rhodamine-gelabeld tubuline, zodat ze kunnen eenvoudig worden verwijderd door het verlichten van het gezichtsveld met een 530-550 nm laser of kwik booglamp (Protocol 6) ^36. Fluorescentie-intensiteit van de punt-spoorvolgsignaal kan dan worden gebruikt voor het schatten van het aantal moleculen die reizen met de demontage microtubuli uiteinden, gezien de ongelijkheid van de microscoop field verlichting (Protocol 7). Een soortgelijke aanpak kan worden gebruiktinteracties tussen microtubuli depolymeriseren en eiwit beklede parels, bereid zoals beschreven in ²⁷ (protocol 8) te bestuderen. Sommige eiwitten zullen binden gemakkelijk aan de wanden van gesegmenteerde microtubuli, maar laserpincet kan ook worden gebruikt om de hiel bij de microtubule muur houden, waardoor de binding bevorderen.

Protocol

Benodigde apparatuur: De hieronder beschreven experimenten vereisen een lichtmicroscoop uitgerust voor DIC en fluorescentie beeldvorming (tabel 1). Helderveld LED verlichting kan worden gebruikt om aanzienlijke verbetering van de detectie van het dekglaasje bijgevoegde microtubuli zaden ^37, die moeilijk waar te nemen met een gewone halogeenlamp zijn. Om vloeistofstroom in de microscopie kamers regelen, moet de oplossing worden uitgewisseld met een peristaltische pomp kan stroomsnelheden 10-100 ul / min. Een spuit pomp kan ook worden gebruikt, maar zorg moet worden genomen om luchtbellen die kunnen ontstaan ​​wanneer de stroomsnelheid plotseling verandert voorkomen. Voor de behandeling met eiwit beklede korrels, bijvoorbeeld om ze dicht bij de gesegmenteerde microtubule muur brengen, kan een 1064 nm continue golf laserstraal worden geïntroduceerd in de microscoop optische as en zich met een hoge numerieke apertuur objectief (1.3 of hoger) te produceren val. Voor kwantitatieve analyse van de fluorescentieintensiteit van enkele moleculen het excitatielicht worden door een laser-basebron omdat de intensiteit van de lichtbron stabieler dan die opgewekt door een kwiklamp. Om de mechanische trillingen te minimaliseren, moet de microscoop op een optische tafel geplaatst. Meer geavanceerde apparatuur nodig om de beweging van de kralen met de microtubuli depolymeriseren eindigt onder een constante kracht bestuderen, en de enkelvoudige krachtsignalen ^11,38,39 meten, zullen deze werkwijzen elders beschreven.

1. Productie Herbruikbare Flow Chambers

Glasplaten voor herbruikbare stromingskamers kan van een lokale glas fabriek worden besteld met behulp van schema's in figuur 1B (zie tabel 2 voor meer informatie over onze leverancier). Met ultrasone frezen wijzigen gewone microscoop dia's (75 mm x 25 mm, 1,0 mm dik) twee groeven 15 ± 1 mm lang te maken, 1,0 ± 0,1 mm breed en 0,8 ± 0,05 mm diep.Afstand tussen de dichtst uiteinden moet 14 ± 1 mm, deze afstand is optimaal voor een kamer geassembleerd met 22 mm x 22 mm dekglaasje. Zie tabel 2 voor een lijst van andere materialen.

1. Plaats 100 mm polyethyleen buis (OD 0,61 mm, tabel 2) in elke groef in de schuif, waardoor ~ 5 mm overhang aan de binnenste uiteinden van de groeven. Bevestig de buizen in de groeven met cyaanacrylaatlijm, het inbedden van de buizen volledig in de groeven.
2. Vullen de groeven met epoxy lijm, terwijl het vermijden van morsen de lijm in de buizen. Laat de lijm drogen voor ~ 1 dag.
3. Met een scherp scheermes stuurde de gestolde lijmmassa 3-4 mm vanaf het distale einde van elke bevestigingsplaats, proximaal verwijderen van de onderdelen in het midden van de dia. De buizen moeten in hun groeven blijven. Het verwijderen van de proximale delen zal ook af en haal het binnenste overhangen, het creëren van een vlak oppervlak met twee buis openingen.
4. Vul een spuit met water en testenof de buizen goed werken. Als de vloeistof vrijelijk een druppel epoxy lijm (~ 5 mm diameter) aan de uiteinden van de bosjes, droge 1 dag (figuur 1D). Dit zal kamers duurzamer te maken, zodat ze kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor vele maanden.
   Opmerking 1: Aan een kamer voor een omgekeerde microscoop, dienen de objectglaasjes bovendien worden aangepast om twee kleine gaatjes aan de tegenoverliggende einden van de groeven (figuur 1C). Steek de buizen door de gaten in de schuif, buig de buizen en passen ze stevig in de groeven (figuur 1E). Volg stappen 1.2-1.4, maar verwijdert de epoxy van het gehele oppervlak, dat wordt gebruikt om een ​​stromingskamer maken.
   Opmerking 2: Om kamer volume te verminderen, gebruikt frezen twee inkepingen 0,050 ± 0,005 mm diep te maken, waardoor het centrale deel van de dia 5,0 ± 0,5 mm breed en licht verhoogd (zie "geëtste gebieden" op figuren 1B en 1C). Als thij stromingskamerinfusie wordt geassembleerd (zoals hieronder beschreven), plaatst u de dubbelzijdige tape binnen deze inkepingen.
   Noot 3: Om deze gewijzigde dia's opnieuw, na het beëindigen van de experimenten verwijder het dekglaasje en dubbelzijdige tape met behulp van een scheermesje. Verwijder de kit met het schillen van hem uit en door de dia met 70% ethanol te vegen. Plaats de dia in een container met 1-2% van een lab afwasmiddel, hechten slang aan een peristaltische pomp en perfuse 50-70 ml, volgen met gelijk volume van gedemineraliseerd water, droog en bewaar in een stofvrije ruimte.

2. Bereiding van Coverslips

Dit protocol duurt 6-8 uur en zal helpen om 12 dekglaasjes bereiden. U zult een keramische dekglaasje houder en 3 dekglaasje kleurbakjes nodig met deksel; pot volume moet 15 ml, dus elke houdt 4 dekglaasjes op elkaar gestapeld. Een glazen pot met een deksel (250 ml) moet worden gebruikt om dekglaasjes broeden met silaan. Gebruik gewone No.1 dekglaasjes (22 mm x 22 mm of 22 mm x 30 mm, zie de tabellen 2 en 3 voor een lijst van materialen). Alle stappen moeten in een zuurkast worden uitgevoerd, terwijl het dragen van handschoenen.

1. Zet de dekglaasjes in het glas dekglaasje kleurbakjes en vul de potten met aceton. Incubeer gedurende 1 uur, wassen 10x met gedemineraliseerd water.
2. Incubeer de dekglaasjes 10 min met ethanol en was weer 10x met gedemineraliseerd water.
3. Bereid "piranha" oplossing. Doe 60 ml waterstofperoxide-oplossing (30% in water) in een hittebestendige glazen vat en voeg langzaam 100 ml zwavelzuur (uiteindelijke verhouding tussen zuur en waterstofperoxide oplossing is 5:03). Oplossing zal opwarmen, dit is normaal, maar wees voorzichtig. Piranha-oplossing is zeer corrosief! Gebruik dikke laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril!
4. Vul het dekglaasje kleuring potten met "piranha" oplossing, sluit de deksels en zet de potten in een waterbad verwarmd tot 90 ° C gedurende 1 uur.
5. Giet het "piranha" solutiop en gooi ze weg volgens de instructies van de veiligheidsvoorschriften op uw werkplek. Wassen coverslips 10x met gedemineraliseerd water.
6. Vul het dekglaasje kleurbakjes met 0,1 M KOH, incubeer 10 min, en was 10x met gedemineraliseerd water. Dit zal alle zure resten op de dekglaasjes na "piranha" behandeling te neutraliseren.
7. Droge coverslips een voor een door te oordelen elke dekglaasje met teflon beklede platte randen pincet (om beschadiging van een glazen oppervlak te minimaliseren) en terwijl het blazen gecomprimeerd droge stikstof. Controleer of dekglaasjes volledig gedroogd, want silaan oplossing is zeer reactief met water.
8. Stapel de gedroogde dekglaasjes in keramische houders (12 dekglaasjes per houder), die grondig moeten worden voorgedroogd met stikstof. Houd de keramische houders afgedekt om stof van het vasthouden aan het dekglaasje oppervlak te voorkomen.
9. Bedek de bodem van 250 ml glazen pot (6 cm in diameter) met moleculaire zeven, Grade 564, voor wateropname.
10. Vul de pot met 200 mlPlusOne Repel silaanoplossing en langzaam dompelen een keramische houder met dekglaasjes in een pot, sluit het deksel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Dit hydrofobe coating ontstaat op het dekglaasje oppervlak.
11. Verwijder langzaam de houder met dekglaasjes van de pot en de overdracht coverslips een voor een in het dekglaasje kleurbakjes gevuld met methanol.
12. Plaats een metalen of glazen voetstuk in het waterreservoir van een sonisch bad, zodat het dekglaasje kleuring pot wordt ondergedompeld voor 2/3 van zijn hoogte. Ultrasone trillingen bij 70 W gedurende 20 min, het veranderen van methanol oplossing om de 5 minuten, spoel dan 10x met gedemineraliseerd water. Als de silanisatie werkte goed, zal de dekglaasjes droog lijken als ze uit het water.
13. Grondig ontdaan van water met behulp van stikstof, zoals hierboven.
14. Interlay de dekglaasjes met Kimwipes aan oppervlakte-oppervlaktecontact tussen de dekglaasjes voorkomen. Dekglaasjes kan in een afgesloten houder worden bewaard verscheidene weken bij kamertemperatuur.
    Noot 1: Stappen 2,1-2,6 kan worden vervangen door het schoonmaken van de dekglaasjes met Plasma Cleaner gedurende 15 min bij 30 W, de totale voorbereidingstijd sterk verminderen. Druk in de schoonmaak kamer wordt ingesteld op 100-200 mTorr. Zowel atmosferische en gecomprimeerde zuurstof kan worden gebruikt. Stapel de plasma gereinigd dekglaasjes in keramische houders en ga verder met stap 2.7.

3. Bereiding van GMPCPP-gestabiliseerde microtubuli Seeds

Deze procedure wordt ~ 1 uur duren en de resulterende microtubule zaden stabiel gedurende 1-2 dagen bij kamertemperatuur. Zie Tabel 4 voor een lijst van de reagentia.

1. Meng op ijs:
   • 10 pl unlabeled tubuline (100 uM, tabel 4) bij BRB-80 buffer (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM _MgCl2, pH 6,9 met KOH, supplement met 1-2 mM DTT met verse hoeveelheid voor elk experiment).
   • 2.6 ul-digoxigenine gelabeld tubuline (Tabel 4). Stel het volume afhankelijk van de voorbereiding,zodat de uiteindelijke verhouding van gemerkte ongelabelde tubuline is ~ 01:10. Meng goed door pipetteren.
   • 1.4 ul 10 mM GMPCPP (eindconcentratie 1 mM)
2. Incubeer 15 min bij 35 ° C, zal de zaden 2-3 urn lang worden. Stel tijd als verschillende microtubuli lengte gewenst is.
3. Voeg 35 ul BRB-80 (voorverwarmd tot 35 ° C), meng door pipetteren en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 25.000 xg om de zaden pellet bij kamertemperatuur.
4. Gooi supernatant, was de pellet door voorzichtig toevoegen en verwijderen van 50 pi warm BRB-80.
5. Resuspendeer pellet goed in 25 ul BRB-80.

4. Bevestiging van microtubuli Seeds aan de Coverslips

Protocollen 4 en 5 wordt 2-3 uur vereist, zodat beide stroomkamers gebruikt per dag.

1. Monteer stromingskamer volgens de instructies van de fabrikant met behulp van gesilaniseerd dekglaasjes en ga verder met stap 4.2. Bij gebruik van op maat gemaakte dekglaasjes (protocol nr. 1), volg de stappen below.
   1. Bevestig twee stukjes dubbelzijdige tape (5 mm x 30 mm) langs de centrale ~ 5 mm breed gebied, zet gesilaniseerd dekglaasje bovenop de band, stevig aandrukken.
   2. Vul de kamer met BRB-80 door een van de buizen en sluit beide buizen met ronde tandenstokers.
   3. Knijp een kleine daling van twee gekleurde Kwik Cast kit op de top van een klein plastic petrischaal, en meng snel maar grondig met een tandenstoker. De kit wordt groen onmiddellijk van toepassing, zorgvuldig afdichten van alle randen van het dekglaasje. Als de kit dringt ook diep onder het dekglaasje, opent u een van de buizen door het verwijderen van de tandenstoker plug en zachte druk om kit te voorkomen dat lekken in de buizen van toepassing.
   4. Laat de kamer droog gedurende 10 min en bevestigen dat de stroom niet alvorens verder te gaan is beperkt.
2. Plaats de kamer op een microscoop podium voorverwarmd tot 32 ° C en voeg een van de buizen een pomp, die de vloeistof pompen. De lengte van de inlaatbuisdient te worden geminimaliseerd om het onnodig reagentia vermijden: de aanbevolen lengte is 5-7 cm. Dompel daartoe in een 0,5 ml flacon met BRB-80 buffer. Dit en alle hieronder oplossingen moeten worden voorverwarmd tot 32-35 ° C.
3. Breng een lichte druk met een pomp of gewoon hef het uiteinde van de afvoerbuis te persen uit de luchtbellen, die af en toe kan vormen wanneer de inlaatbuis stekker is verwijderd.
4. Zet de pomp snelheid 100 pl / min. Wassen met 2 kamervolumes van anti-digoxigenine antilichamen verdund 1:30 in BRB-80, incubeer 15 min naar antilichamencoatings staan.
5. Wassen met 5-10 kamervolumes van warm BRB-80, incubeer 10 min met 1% Pluronic F-127 in BRB-80 aan het hydrofobe oppervlak van gesilaniseerd dekglaasje blokkeren.
6. Wassen met 5-10 kamervolumes van beweeglijkheid buffer (BRB-80 aangevuld met 0,4 mg / ml caseïne).
7. Verminder het toerental van de pomp tot 10 pl / min en perfuse microtubuli zaden verdund 1:200-1:600 ​​in 30-40 pi beweeglijkheid buffer. Incubeer 15 min bevorderen binding van de zaden het dekglaasje geadsorbeerde antilichamen.
8. Was de kamer bij 100 pl / min met 400 ul van beweeglijkheid buffer om eventuele ongebonden materiaal te verwijderen.
   Noot 1: De resulterende dichtheid van zaden moet 10-30 per microscoopveld (Figuur 2A) zijn. Problemen op te lossen, gebruik fluorescent gelabelde tubuline tijdens de polymerisatie (stap 3.1) voor eenvoudiger detectie van de dekglaasje bevestigd zaden.
   Noot 2: Axonemes bereid uit Chlamydomonas ⁴⁰ of andere biologische bronnen, alsmede de vliezen van gelyseerd en deciliated Tetrahymena cellen ⁴¹ kan ook worden gebruikt als microtubuli kiemvormende. Deze kiemvormers zijn handig voor het creëren van kleine microtubuli arrays, en hebben de voorkeur wanneer microtubuli met specifiek aantal protofilamenten gewenst (GMPCPP zaad nucleates een microtubuli die ≥ 14 protofilamenten ⁴² bevat). Deze structuren kunnen worden bevestigd aan de gereinigde dekglaasjes door niet-specifieke absorptie, maar de attachment is meestal minder stabiel in vergelijking met antilichamen gebaseerde gehechtheid, vooral bij gebruik van de gesilaniseerd dekglaasjes.

5. Voorbereiding van Segmented Microtubules

Alle oplossing volumes hieronder zijn voor Kamer volume 15-20 pl; evenredig stijgen als er grotere kamer wordt gebruikt.

1. Voorverwarmen ongelabelde tubuline mix (45 ul motiliteit buffer aangevuld met 1 mM Mg-GTP en 10-15 uM ongelabelde tubuline) gedurende 30 seconden bij 35 ° C. Perfuseren van 30 pl / min.
2. Monitor microtubuli groei met DIC optiek (Figuur 2B, Video 1). Gedurende 5-7 minuten incubatie de microtubuli groeien meestal ~ 10 micrometer lang.
3. Bereid Rhodamine-tubuline mix (65 pl motiliteit buffer aangevuld met 0,5 mM GMPCPP en 2-5 uM Rhodamine-gelabeld tubuline met 0,5-1 molverhouding Rhodamine aan tubuline) en verwarm de oplossing bij 35 ° C gedurende 30 sec.
4. Onmiddellijk Perfuseren bij 30 μl / min. Incubeer gedurende 8-10 min tot vorming van stabiele fluorescerende caps te bevorderen op de microtubuli tips. Stabiele microtubuli segmenten zullen ook spontaan nucleëren en zichtbaar met DIC optiek zal zijn.
5. Was de kamer en met 100 ul van motiliteit buffer bij 20 pl / min tot tubuline en nucleotiden, evenals oplosbare microtubuli fragmenten te verwijderen.
6. Met DIC, bevestigen dat de microtubuli zichtbaar zijn (figuur 2D), hun aantal echter moeten dalen omdat veel microtubuli uit elkaar te halen tijdens aftopping (Video 2 toont een typische veld met gesegmenteerde microtubuli).
   Noot 1: Gesegmenteerde microtubules zijn zeer stabiel en kunnen gedurende ten minste 2 uur. De levensduur van deze microtubuli vermindert overmatige oplossing uitwisseling, of 2-mercapto-ethanol wordt gebruikt in de beeldvormende buffer.

6. Experimentele waarneming van de Protein Tracking met depolymeriseren uiteinden van microtubuli

1. Introduce 30-50 ul van fluorescerend eiwit (0,1-20 nM) in de kamer op 10 pl / min. Als eiwit vasthouden aan het dekglaasje blijkt, vullen de motiliteit buffer met 4-8 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-bijhouden vereist bovendien 10 mM DTT of 0,5-1% pME ^10.
2. Beperk het veld verlichting met behulp van een microscoop velddiafragma om de onnodige bleken en demontage van de microtubuli te voorkomen.
3. Start video acquisitie met behulp van GFP filter kubus, schakel dan over naar Rhodamine filter kubus zonder onderbreking van de beeldopname. De rode segmenten aan de uiteinden van microtubuli moet duidelijk zichtbaar blijven, ze zullen beginnen te vervagen en snel te desintegreren (Video 3).
4. Blijven branden totdat de doppen bijna verdwijnen (meestal gedurende 10-20 sec, maar deze keer zal het langer voor de caps gegroeid met een lagere Rhodamine etikettering verhouding), en terug te schakelen naar het GFP-kanaal eiwit opnemen tracking met microtubuli demontage.
5. Analyseer deverkregen sequenties door het construeren kymographs, waarbij de twee-dimensionale beelden die fluorescentie-intensiteit langs microtubuli as tonen verschillende momenten tijdens observatie) met MetaMorph kenbare ImageJ of andere beeldverwerkingssoftware (figuur 2E).
   Opmerking 1: Acquisitie tarief moet worden aangepast afhankelijk van de timing van de waargenomen gebeurtenissen. De aanbevolen dosis 2-3 frames per seconde (fps) voor de trage, ring-en kleinbedrijf Dam1 complexen ²⁷ maar acquisitie tijd voor enkele moleculen moet> 20 fps ^19.
   Noot 2: Een zeer gevoelige EMCCD, bijvoorbeeld ANDOR iXon3, is nodig voor de snelle opname van-tip bijhouden evenementen met depolymeriseren microtubuli. De aanbevolen instellingen voor Andor iXon3 camera zijn: winst 5x, EM krijgen 200, 1 MHz uitlezing snelheid, 16-bits sensor-modus, 80 msec belichtingstijd.
   Noot 3: TIRF microscopie zal signaal-ruisverhouding te verbeteren, echter korter microtubuli worden gebruikt, zoals that de fluorescerende stabiliserende caps blijven binnen het bereik van verdwijnende veld.

7. Kwantitatieve analyse van de moleculaire grootte van microtubuli Tip-bijhouden Complexen

De reden voor deze benadering is het aantal moleculen bepalen een tip bijhouden complex door het vinden van de verhouding van de totale fluorescentie intensiteit van de tip volgen complex om de intensiteit van een fluorofoor. Deze benadering kan worden toegepast op GFP-eiwit fusies en eiwitten gelabeld met fluorescente kleurstoffen, maar het kan het aantal moleculen onderschatten de tip-tracking-complexen als sommige eiwitmoleculen in de preparaten niet fluorescerend.

1. Record fotobleken kinetiek voor de fluorescente eiwitmoleculen.
   1. Monteer regelmatige microscopie kamer met een nonmodified glasplaatje, twee stroken dubbelzijdig plakband, en een schoon dekglaasje, die kunnen worden bereid met de volledige protocol 2, of slechts stappen 2.1-2.6 dezeprotocol.
   2. Voeg ongeveer 50 nM eiwit in beweeglijkheid buffer, kort wassen met beweeglijkheid buffer en sluit de kamer met valap (tabel 4). Optimaliseer eiwitconcentratie van het veld te verkrijgen met gelijkmatig verspreide plekken (figuur 3A), wat neerkomt op enkele moleculen en hun kleine aggregaten (trimeren en trameren, die spontaan kunnen vormen in de oplossing of kan verschijnen wanneer meerdere afzonderlijke moleculen dicht bij elkaar en kunnen niet worden opgelost) . Deze stap is zeer belangrijk voor het verkrijgen van een multi-piek verdeling van fotobleken stappen en nauwkeurige bepaling van een stapgrootte (zie hieronder).
   3. Minimaliseer de verlichting laser intensiteit waarmee de individuele fluorescerende vlekken zijn nog steeds zichtbaar, met lagere verlichting de photobleaching tijd wordt verlengd, kan dus langer photobleaching sporen worden verkregen. Ook minimaliseren van de blootstellingstijd aan de waarschijnlijkheid van meer dan een fluorofoor bleken te verminderen tijdens een frame. De aanbevolen instellingvoor Andor iXon3 camera: winst 5.0x, EM krijgen 999, 10 MHz uitleessnelheid, 50-100 msec belichtingstijd.
   4. Focus op het oppervlak van het dekglaasje, sluit de verlichting sluiter, verhuizen naar een nieuw veld, open de verlichting sluiter en het verwerven van beelden totdat alle complexen zijn gebleekt (daarna genoemd img (x, y)).
2. Corrigeer de verkregen beelden oneffenheden van verlichting (Figuur 3B).
   1. Pesticide van een fluorofoor, bijv. 1 uM fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) in BRB-80. Deze oplossing kan worden voorbereid, in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
   2. Monteer een kamer als in paragraaf 7.1.1, maar met een gewone dekglaasje. Voeg fluorofoor oplossing en sluit de kamer met behulp van valap.
   3. Verzamel> 50 beelden van de gehele microscoop veld: verplaats het podium om een ​​nieuwe ongebleekt gebied, terwijl de verlichting klepje gesloten is, en de beelden te verwerven onmiddellijk na het openen van de sluiter.
   4. Maak gemiddelde projectie van deze stapel en filter met Gaussiaans vervagen met 5 pixel radius met behulp ImageJ of andere software (Figuur 3C). Het resulterende beeld vertegenwoordigt de verdeling van de verlichtingssterkte van de veld (Illum (x, y), waarbij x en y komen overeen met coördinaten pixel).
   5. Bepaal de maximale pixel helderheid van deze afbeelding (Max (Illum)).
   6. Met de gesloten sluiter verlichting en het gebruik van dezelfde camera-instellingen als in paragraaf 7.2.3 verwerven een afbeelding, bepaal de gemiddelde pixel intensiteit van deze afbeelding, dit komt overeen met GN, camera lawaai.
   7. Gebruik de bovenstaande waarden en beeld (Illum (x, y)) naar de experimentele afbeelding (img (x, y)) normaliseren met de volgende formule:
      
      Gebruik het resulterende beeld img ^norm (x, y) voor de kwantitatieve analyse van de brightness van de stationaire fluorescente complexen, alsmede de beelden met tip tacking complexen (figuur 3D) normaliseren.
3. Bepaal de intensiteit van een enkele fluorofoor.
   1. Met genormaliseerde afbeeldingen img ^norm (x, y) en alle beeldverwerkingssoftware selecteer een fluorescerende vlek met een cirkelvormig gebied (5-6 pixels in diameter) en bepaal de geïntegreerde intensiteit voor alle frames, genereert het fotobleken sporen. Vermijd zeer heldere puntjes (> 5 maal helderder dan de dimmer zijn).
   2. Met dezelfde cirkelvormig gebied gereedschap Selecteren tenminste 3-spot gebieden, het genereren van de bijbehorende photobleaching sporen, gemiddelde en fit met exponentiële verval functie.
   3. Tabulate deze achtergrond intensiteit curve aan de experimentele tijd punten match en trek het uit de photobleaching bochten.
   4. Strijk de photobleaching curves (gemiddeld met het schuifraam van 3-5 punten). Inspecteer de resulterende krommen enelke curve die een abrupte stijging in fluorescentie of gebrek aan duidelijke bleken (figuur 3E) toont weggooien.
   5. Voor elk van de overige bochten (gewoonlijk 50-70% van het totale aantal bochten), selecteert visueel de uiteindelijke plateau, wanneer de fluorescerende vlek gebleekt. Verkort dit segment slechts ~ 100 punten vertrekken en het gemiddelde van deze intensiteiten. Trek deze waarde van de verkorte fotobleken curve kleine variaties beperken de achtergrondniveaus en de grootte van de achtergrond piek (hieronder) verminderen.
   6. Maak een histogram van de intensiteiten voor alle tijdstippen van 20 of meer photobleaching curves (> 1000 tijdstippen). Het histogram moet tenminste 4 verschillende pieken (zie noot 2) vertonen.
   7. Breng het histogram met equidistante Gauss-verdeling ^10,43 behulp van MATLAB, Mathematica of soortgelijke software (Figuur 3F):
      
      whier een _i en σ _i, d en N zijn aanpasparameters. Parameters _Ai en σ _i overeen met amplitude en breedte van de i-de piek, d is de afstand tussen de pieken, N geheel getal, dat overeenkomt met het totale aantal pieken in de verdeling. Als centra van de eerste 3 of meer pieken vertonen een visueel goede match het gemonteerde lijn, de afstand tussen deze pieken (parameter d) overeenkomt met een fluorescentie-intensiteit van een fluorofoor.
      Opmerking 1: Aantal onderzochte punten (paragraaf 7.3.6) moet worden verhoogd als de microscopie systeem vertoont aanzienlijke trillingen of er is een andere bron van geluidsoverlast (met name instabiele laserstraal).
      Opmerking 2: Het is essentieel om te verkrijgen> 3 pieken voor nauwkeurige analyse met equidistante Gaussische fit. Als er minder pieken worden verkregen, kon de valse (bijv. dubbele) stapgrootte worden verkregenwanneer de verlichting niet optimaal zijn, zijn bijvoorbeeld wanneer de puntjes bleken te snel en enkele stappen niet goed opgelost.
4. Bepaal de moleculaire grootte van de tip volgen complex.
   1. Gebruik beelden verzameld met Protocol nr. 6 en selecteer de eerste 2-4 frames, die onmiddellijk na het openen van de sluiter werden verworven. Als het veld verlicht werd enige tijd voordat de tip tracking waargenomen schatten de oorspronkelijke intensiteit van de kinetiek van fotobleken onder dezelfde experimentele omstandigheden.
   2. Het gemiddelde van de geselecteerde frames en normaliseren het resulterende beeld als in de punten 7.2.5-7.2.7.
   3. Meet integraal intensiteit van het fluorescerende-tip volgen complex met dezelfde regio grootte als in paragraaf 7.3.1.
   4. Meet integraal intensiteit van 3 achtergrond gebieden gelegen nabij het-tip bijhouden complex en met dezelfde regio, gemiddeld deze waarden en aftrekken van de intensiteit van de-tip bijhouden complex uit paragraaf 7.4.3.
   5. Bereken het aantal fluorofoor moleculen in het complex door deling van het fluorescentie-intensiteit in punt 7.4.4 verkregen door de intensiteit van de enkele fluorofoor verkregen paragraaf 7.3.5.
      Opmerking 1: Het is wenselijk dat de verlichting en verkrijging instellingen protocol 7.4 zijn dezelfde als in protocol 7.1. Indien een van de belichtingstijd of laser intensiteit tijdens deze stappen werd aangepast, moet de resulterende fluorescerende waarden dienovereenkomstig worden aangepast. Echter, de nauwkeurigheid van deze schalen worden geverifieerd door beeldvorming hetzelfde monster (bijvoorbeeld fluorescerende tijd) onder deze verschillende omstandigheden en berekenen van de verhouding van de verkregen intensiteiten.

8. Microtubuli Tip-volgen door de Protein Coated Kralen

1. Uit te voeren experimenten met tip-volgen kralen door het triggeren van MT demontage als in protocol 6. Intensiteit van DIC lichtbron moet worden teruggebracht, zodat het bekijken van Rhodamine fluorescentie gelijktijdig metDIC imaging.
2. Bereid de kralen als in Grishchuk et al.. ¹⁰ en Asbury et al.. ¹¹ Introduceer 30-50 ul van kraal schorsing in de kamer op 10 pl / min. De voorgestelde kraal concentratie is 10 ^-16 -10 ^-17 M.
3. Bij gebruik rechtop microscoop, verwijder de kamer van de microscoop podium en keer gedurende 5-10 minuten om kralen naar sediment op het dekglaasje. Dit bevordert een betere binding van de hiel aan de microtubuli vastgebonden aan het dekglaasje, maar deze procedure niet succesvol met 0,5 urn polystyreen kralen, die weinig zwaartekracht gebaseerde sedimentatie vertonen tijdens zo'n korte tijd.
4. Selecteer een kraal die aan de dekglaasje aangebonden microtubuli is bevestigd, de kraal moet in een duidelijke boog ⁴⁴ (Figuur 4A) bewegen. De vastgemaakte kraal moet zich 1-3 urn van het dekglaasje oppervlak, dat duidelijk zichtbaar dankzij de toe-gevoegd dekglaasje kralen die m blijvenotionless.
5. Schakel over naar Rhodamine filter kubus en beginnen met het verzamelen beelden tijdens het gebruik van DIC verlichting.
6. Open blind naar het veld beeldvorming (beperkt met een velddiafragma) verlichten met een kwiklamp of 530-550 nm laser. Blijven opnemen totdat de hiel loskomt of beweegt met het demonteren microtubuli einde (figuren 4D, 4F en 4G).
   Noot 1: Optische trap kan worden gebruikt om de interactie tussen de muur en microtubule-eiwit beklede kraal bevorderen. Dit is vooral handig bij het ​​werken met kralen bekleed met kinesine motors (figuren 4E-G). Volg dezelfde protocollen als hierboven maar vullen motiliteit buffer met 2 mM Mg-ATP. In stap 8.3, het veroveren van een vrij zwevende kraal met de 1064 nm laserstraal, verplaatst het podium om de gevangen kraal dichter bij de gesegmenteerde microtubuli muur te brengen. Begin beeldvorming met weinig licht DIC en via de Rhodamine filter kubus en wacht op de kraal om te beginnen met lopen naar de bedekte microtubuli einde. Achteruiter de gerichte kraal beweging wordt waargenomen, sluit de sluiter voor het vangen balk en open het klepje voor TL verlichting. Blijven opnemen totdat de hiel loskomt of tracks met het demonteren van microtubuli einde.

Resultaten

Eiwit tracking met depolymeriseren microtubuli eindigt. Gist kinetochoor component Dam1 is veruit de beste tip-tracker van de depolymeriseren microtubuli eindigt ^14. Deze 10-subunit complex gelabeld met GFP kan gemakkelijk worden uitgedrukt en gezuiverd van bacteriële cellen ^18,38, dus we raden het gebruik ervan als een positieve controle voor de tip volgen assay. Een fluorescerend eiwit dat meeloopt met het depolymeriseren na een microtubule wordt gezien als een heldere fluorescer...

Discussie

Veel single molecule assays tegenwoordig routinematig gebruik speciaal behandeld dekglaasjes om aspecifieke eiwit plakken drastisch te verminderen. De procedure die we hier beschrijven is een wijziging van het oorspronkelijke protocol ontwikkeld in Howard lab ^32, en we vinden dat silaniseren de dekglaasjes is de moeite waard, zelfs met DIC-gebaseerde kraal assays, die geen gebruik maken van fluorescentie. Chambers geassembleerd dergelijke dekglaasjes tonen veel schoner oppervlak en de verkregen in de aanwezig...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tabel 1. Microscopie en andere apparatuur.
Microscoop	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	andere microscoopmodellen die geschikt zijn voor DIC- en epifluorescentiebeeldvorming kunnen worden gebruikt
Objectief	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49	100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objectiefverwarmer	Bioptechs	150803, 150819-19
Fluorescente filter kubus	Chroma	49004 of 49008 41017 of 49020	geoptimaliseerd voor Rhodamine-fluorescentie  geoptimaliseerd voor GFP-fluorescentie
Acquisitiesoftware	gratis MicroManager Molecular Devices	niet van toepassing MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ andere software kan worden gebruikt om afbeeldingen te verkrijgen en voor het volgen van deeltjes
EMCCD-camera	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Zeer gevoelige EMCCD-camera
Trappinglaser	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP	1.064 nm laser, 10 W
Fluorescentie-excitatielasers	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP	excitatie van groene fluoroforen excitatie van rode fluoroforen
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Commerciële flow-kamers	Warner Instruments	RC-20 of RC-30
Perfusiepomp	Cole Palmer Harvard Apparatus	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Beide pompen bieden de vereiste snelheid van vloeistofstroom, maar een peristaltiekpomp kan pulseren op zeer lage snelheid. De stroom met een spuitpomp is consistenter voor een breed bereik van snelheden, maar deze pomp heeft inertie.
Tabel 2. Voorbereiding van de microscoopkamer.
Gemodificeerde microscoopglazen voor herbruikbare kamers	Precision Glassblowing of Colorado	Aangepaste bestelling www.precisionglassblowing.com	Sonische gleuven in glazen met behulp van schema's in Figuur 1
Polyethyleen buis	Intramedic	427410	I.D. 0,58 mm, O.D. 0,965 mm; gebruik deze buizen om de geassembleerde kamer met de pomp en afvalcontainer te verbinden
Polyethyleen buis	Intramedic	427400	I.D. 0,28 mm, O.D. 0,61 mm; gebruik deze buizen om de herbruikbare kamer te maken
Reguliere microscoopglazen	VWR	48312-003	Andere vergelijkbare glazen kunnen worden gebruikt
Dekglasjes	VWR	48393-150, 48366-067	Andere vergelijkbare dekglasjes kunnen worden gebruikt
Siliconenkit	World Precision Instruments	KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxylijm	Loctite	83082
Cyanoacrylaatlijm	Scotch 3M	AD114	Of cyanoacrylaatlijm van andere fabrikanten
Tabel 3. Reiniging en coating van dekglasjes.
Moleculaire zeven, graad 564	Macron	4490-04
Dekglaskleuringsvat	Ted Pella, Inc.	21036
Dekglaskeramische houder	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silane	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-digoxigenine AB	Roche Applied Science	11093274910
Tabel 4. Voorbereiding van zaden en gesegmenteerde microtubuli.
Tubuline	gezuiverd uit koeienhersenen Cytoskeleton, Inc	T238P	Voor zuiveringsprotocollen zie 49–51 Ongelabeld porcien tubuline
Gelabeld tubuline	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenine)	Rhodamine-gelabeld porcien tubuline Tubuline kan worden gelabeld met elke amine-reactieve kleurstof zoals in de referentie52.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Op delen en bewaar op -70 °C
VALAP	Vaseline, lanoline en paraffine in een 1:1:2 massa		zie referentie9