Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Samenvatting

Nauwkeurige controle van mRNA translatie is fundamenteel voor eukaryote cel homeostase, met name in reactie op fysiologische en pathologische stress. Veranderingen van dit programma leiden tot de groei van beschadigde cellen, een kenmerk van kankerontwikkeling of voortijdige celdood zoals gezien in neurodegeneratieve aandoeningen. Veel van wat bekend is over de moleculaire basis voor translationele controlesignalen afkomstig is van polysome analyse met behulp van een dichtheidsgradiënt fractionering systeem. Deze techniek berust op ultracentrifugatie van cytoplasmatische extracten op een lineaire sucrose gradiënt. Wanneer de rotatie is voltooid, maakt het systeem fractionering en kwantificeren gecentrifugeerd zones die overeenkomen met verschillende vertalen ribosomen populaties, hetgeen resulteert in een polysome profiel. Veranderingen in de polysome profiel duiden op wijzigingen of defecten in translatie initiatie die optreden als gevolg van verschillende soorten stress. Deze techniek maakt het ook mogelijk om e te beoordelene rol van specifieke eiwitten op translatie-initiatie, en translationele activiteit van specifieke mRNA's te meten. Hier beschrijven we protocol polysome profielen voeren om translatie-initiatie van eukaryote cellen en weefsels te analyseren onder normale of spanning groeiomstandigheden.

Inleiding

Eukaryote cellen voortdurend geconfronteerd met een aantal schadelijke fysiologische en ecologische stress omstandigheden die een snelle adaptieve cel respons vereisen. Cell spanningsreactie impliceert een nauwkeurige balans tussen anti-overleving en pro-survival werkende factoren. Het verstoren van dit evenwicht kan onomkeerbare gevolgen leiden van de ontwikkeling van de menselijke ziekten zoals kanker en neurodegeneratieve ziekten. Tijdens de eerste stap van de reactie op stress, cellen activeert pro-overleving routes die de gecoördineerde beheersing van veranderingen in genexpressie op het niveau van mRNA translatie omvatten.

mRNA translatie bij eukaryoten is een complexe cellulaire proces dat gecoördineerde interactie tussen translatie initiatie factoren (EIFS), specifieke RNA-bindende eiwitten (SGD's), en RNA-moleculen ¹ gaat. mRNA translatie is verdeeld in drie afzonderlijke fasen: initiatie, elongatie, en beëindiging. Hoewel alle drie de fasen zijn onderworpen aan Verordeninggevende mechanismen, translationeel controlemechanismen richten meestal de initiatieffase van de vertaling, die dus vormt de snelheidsbeperkende stap van eiwitsynthese ^2.

Translatie initiatie is een sterk geordende proces dat begint met de vorming van de eIF2a.GTP.Met-tRNA _i ^Met ternaire complex en de daaropvolgende binding aan de 40S ribosoom subeenheid, leidt tot de vorming van het pre-initiatie complex. De volgende stap is de rekrutering van de preinitiation complex mRNA, die de activiteit van translatie initiatie factoren zoals eIF4F en eIF3 omvat. De aldus gevormde 48S preinitiation complex ondergaat specifieke conformationele verandering die dit mechanisme mogelijk te beginnen met het scannen van de 5'-niet getranslateerde gebied van het mRNA totdat het startcodon AUG herkent. Het merendeel van de translatie initiatie factoren worden losgelaten en 60S subeenheden worden gerekruteerd voor een 80S vormen ribosoom complex bevoegd voor vertaling, eent welk punt eiwitsynthese gestart (figuur 1). Meer dan een 80S monosome kan vertalen hetzelfde mRNA tegelijk produceren van zogenaamde polysomen (of polyribosomen). De dichtheid van polysomen op mRNA weerspiegelt de initiatie, verlenging en beëindiging prijzen en is dus een maat voor de vertaalbaarheid van een bepaald transcript. Echter, polysoom profiel hoofdzakelijk gebruikt om veranderingen in mRNA translatie beoordeeld op de initiatie stap. Hier hebben wij een proteasoom inhibitor translatie initiatie remmer gebruikt. De behandeling van kankercellen met het medicijn veroorzaakt een stressreactie gekenmerkt door activering van de stress kinase genaamd HRI die de translatie initiatie factor eIF2a ³ fosforyleert. Fosforylering van eIF2a is een van de belangrijke gebeurtenissen die leiden tot de remming van translatie initiatie in zoogdiercellen ^4.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen goedgekeurd door Laval Ethical Review Board.

1. Voorbereiding van de celculturen en Brain Manipulatie

1. Zoogdier-en Drosophila Cellen
   1. Grow HeLa cervicale kankercellen en Schneider Drosophila embryonale cellen, zoals aanbevolen door de American Type Culture Collection. Werken met cellen bij een lage doorgang.
   2. Cellaag om 80% confluentie op de dag van het experiment bereiken. Voor het beste resultaat, gebruik ~ 12 x 10 ⁶ cellen voor elke experimentele conditie. Alvorens extracten polysome analyse stimuleren vertaling door toevoegen van verse compleet medium gedurende ten minste 90 minuten.
2. Isolatie Brain: Isoleer hersenen van muizen tussen 9 en 16 dagen na de geboorte jaar. Euthanasie gaat CO ₂ inhalatie na de anesthesie en cervicale dislocatie. Na opoffering, isoleren van de hele hersenen en beide plaatsen it bij -80 ° C of direct overdragen in koud PBS 1X voor onmiddellijk gebruik.

2. Voorbereiding van de Density Gradient Fractionation System

1. Was het buissysteem met 0,1% SDS gedurende 5 minuten.
2. Was het buissysteem met 70% ethanol gedurende 5 minuten, daarna met RNaseZAP oplossing gedurende 5 minuten voor wassen met DEPC water.
3. Pomp lucht om het buissysteem van de inrichting te drogen.

3. Voorbereiding van de sucrosegradiënten

1. Voeg 15% en 55% sucrose oplossing in 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM _MgCl2, 150 mM NaCl en 1 mM DTT.
2. Genereer de lineaire 15-55% sucrose gradiënt met een Isco Model 160 gradiënt eerstgenoemde, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Het is echter belangrijk om goed beheersen de TRIS peristaltische pompsnelheid om vorming van luchtbellen of turbulenties in de gradiënten voorkomen. Houd de gradiënten bij 4 ° C tot gebruik.
3. Gedurende de tijd dat het verloop maker programma draait Koel de ultracentrifuge bij 4 ° C.

4. Voorbereiding van de Cel en Mouse Brain Extracten

1. Bereiding van celextracten
   1. Plaats plaat (s) op ijs en wassen cellen 3x met koude PBS 1X.
   2. Oogst cellen (~ 12 x 10 ⁶⁾ in 1 ml lysisbuffer (20 mM Tris-HCl bij pH 7,4, 1,25 mM _MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U / ml RNase inhibitor, aangevuld met een complete mini-EDTA-vrije proteaseremmer cocktail tabletten), overzetten naar een Eppendorf buis, en meng goed door ze 15x via een 1cc U100 insulinespuit 28 G 1/2. Laat het cellysaat rusten op ijs gedurende 15 minuten.
   3. Doe enkele druppels cellysaat op een dia te celafbraak beoordelen door het observeren bij een fase-contrast microscoop met een 10x doelstelling. Alleen kernen moet zichtbaar zijn en geen celmembranen moet zichtbaar officieel te bevestigen voor cellysis zijn. Als een controle, observerengelyseerde cellen.
   4. Verduidelijken cellysaat door centrifugatie bij 11.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en houd de oplosbare lysaat bevattende het polyribosomen.
2. Voorbereiding van de hersenen van muizen Extracten
   1. Homogeniseer de gehele hersenen geïsoleerd (-500 mg) met 10 slagen in een ijskoud Dounce homogenisator met 2 ml lysis buffer en het homogenaat verduidelijkt door centrifugatie bij 11.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
   2. Laad het resulterende supernatant op een kussen van 50% sucrose en vul sedimentatie gedurende 2 uur bij 200.000 xg met een ultracentrifuge rotor TH-641 bij 4 ° C.
   3. Resuspendeer de pellet met de doorschijnende polyribosomen in 1 ml lysis buffer en meng goed door en neer te pipetteren. Laat de schorsing rust op het ijs gedurende 30 minuten vóór het laden op hellingen.

5. Het laden van de Extracten op sucrosegradiënten en Ultracentrifugatie

1. Meet de concentratieRNA aanwezig in de cytoplasmatische extract met een spectrofotometer. Voorzichtig en langzaam laden ~ 20 OD ₂₆₀ eenheden van het extract op de 15% tot 55% sucrose gradiënt. Zorg ervoor dat er 2-3 mm van de beschikbare ruimte op het oppervlak van de buis te voorkomen overlopen de buizen tijdens het centrifugeren.
2. Centrifugeer de hellingen met een ultra-centrifuge gedurende 2 uur 30 min bij 230.000 xg met een ultracentrifuge rotor TH-641 bij 4 ° C. Bij centrifugeren eindigt, verwijder de buizen en leg ze op ijs voorzichtig de hellingen niet te verstoren.

6. Fractionering van Cytoplasmatische Extracten voor polysomen Profiling

1. Plaats sucrose gradiënten van dichtheid fractionering Automated System en de procedure geautomatiseerde fractionering en verzameling van fracties (elk 0,5 ml), zoals beschreven door de fabrikant.
2. Verzamel elke fractie (~ 500 ul) in afzonderlijke Eppendorf buizen met continue monitoring van de absorptie bij 254 nm. In parallel van de gradiënt fractionering operatie, zal de polyribosomal profiel worden bewerkt op de grafiek papier. U kunt ook een data-acquisitie-unit aangesloten op de chart recorder om een ​​elektronische overname van de polysome profiel hebben.
3. Aan het einde van elke run, overdragen verzameld eppendorfs op droog ijs. Op dit moment, hetzij opslag verzamelde fracties bij -80 ° C of direct neerslaan eiwit-RNA-complexen als volgt.

7. Proteïne extractie en analyse

1. Aan elke verzamelde fractie sucrose gradiënt, voeg 2 volumes 100% koude ethanol en laat RNA-eiwitcomplexen precipiteren bij -20 ° C overnacht.
2. Centrifuge elk RNA-eiwit neerslag bij 11.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C daarna wassen met 70% ethanol. Droog en resuspendeer de neerslag in SDS-PAGE monsterbuffer alvorens Western blot met specifieke antilichamen (zie figuur 2).

8. RNA-extractie en Analyse

1. Neerslaan RNA-eiwit complexen als in hoofdstuk 7.1. Resuspendeer elk RNA-eiwit neerslag in de lysis buffer die 0,1% SDS. Digest de eiwitcomponent van het neerslag met 2 mg / ml proteïnase K gedurende 30 min in een 55 ° C waterbad.
2. Extract RNA onderdelen van het neerslag door toevoeging van 1 volume "fenol: chloroform", 2 volumina chloroform en 0,1 volume 2 M NaOAc pH 4 en centrifugeren bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten. Precipitaat RNA uit de resulterende waterige fase van elk monster gedurende de nacht bij -20 ° C door toevoeging van 1 volume isopropanol en 0,2 ug / ul glycogeen. Draai de neerslag gedurende 1 uur bij 10.000 xg bij 4 ° C. Was de RNA pellet met 70% koude ethanol.
3. Resuspendeer de RNA pellet in een klein volume van RNAse vrij water. Beoordeel de hoeveelheid en kwaliteit RNA met de spectrofotometer.

Resultaten

Zoals vermeld polysoom profiel maakt de analyse van veranderingen van translatie initiatie onder stressomstandigheden. Figuur 1 is een vereenvoudigd aanzicht van translatie initiatie die als eerder een meerstaps proces waarbij een geordend samenstel van translatie initiatie complexen beschreven. Onder normale groeiomstandigheden, zijn translatie initiatie complexen omgezet in polyribosomen wiens opsporing door polysome profiel getuigen voor een actieve translatie initiatie (figuur 2; On...

Discussie

De polysome profielanalyse op sucrosegradiënten maakt meting van translatie-initiatie door het analyseren van de dichtheid van polysomen geïsoleerd uit cellen of weefsels ^9,11-14. Deze techniek is de beste (zo niet de unieke) benadering van de translatie-initiatie in vivo te meten. Het wordt gebruikt om de translationele positie van groeiende cellen tijdens de celcyclus ¹⁵ volgen en de effecten van verschillende soorten stress zoals virale infecties, hypoxie ^{13,16, 17} straling e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cellen
HeLa-cellen van baarmoederhalskanker	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila embryonale cellen	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
Kweekmedium en supplementen
Schneider’s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Life technologies	11995-073
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03
Penicilline/streptomycine	Life technologies	15140122
Sucrose-oplossingen
D-sucrose	Fisher Scientist	BP220-212
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Broomfenolblauw	Fisher Scientist	B3925
Lysebuffer
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
RNase-remmer (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)	Life technologies	10777-019
Antiproteasen (compleet, mini, EDTA-vrij)	Roche	11,836,170,001
RNA-extractie
Proteinase K	Life technologies	AM2542
Fenoel:chloroform	Fisher Scientist	BP1754I-400
Chloroform	Fisher Scientist	C298-500
Glycogen	Life technologies	10814-010
Isopropanol	Acros organics	327270010
Antilichamen
anti-FMRP-antilichaam	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010