Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Samenvatting

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Samenvatting

MicroRNAs (miRNAs) vormen een krachtige laag van genregulatie door het begeleiden van RISC naar sites op mRNA's richten en bijgevolg door het moduleren van hun translationeel repressie. Veranderingen in miRNA expressie bleken te worden betrokken bij de ontwikkeling van belangrijke complexe ziekten. Voorts recente bevindingen toonden aan dat miRNAs kan worden afgescheiden aan het extracellulaire milieu en in de bloedbaan en andere lichaamsvloeistoffen waar ze kunnen circuleren met een uitstekende stabiliteit. De functie van dergelijke circulerende miRNAs grotendeels ongrijpbaar, maar systematische hoge doorvoer benaderingen zoals miRNA profilering arrays, hebben geleid tot de identificatie van miRNA handtekeningen in verschillende pathologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve stoornissen en verscheidene soorten kanker. In dit verband, de identificatie van miRNA expressie profiel in de cerebrospinale vloeistof, zoals gerapporteerd in onze recente studie maakt miRNAs aantrekkelijke kandidaten voor biomerkeranalyse. _content "> Er zijn verschillende tools beschikbaar voor het profileren van microRNA's, zoals microarrays, kwantitatieve real-time PCR (qPCR), en diepe sequencing. We beschrijven hier een gevoelige methode om microRNA's in de cerebrospinale vloeistof profileren door kwantitatieve real-time PCR. We gebruikte Exiqon microRNA kant-en-klare PCR menselijke panels I en II V2.R, waardoor detectie van 742 unieke menselijke microRNA. We voerden de arrays in drievoud uitgevoerd en we verwerkt en geanalyseerd gegevens met de GenEx Professional 5 software.

Met dit protocol, hebben we met succes geprofileerd miRNA bij diverse cellijnen en primaire cellen, CSF, plasma, en met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels.

Inleiding

MicroRNAs behoren tot de familie van de kleine (21-23 nt in de lengte) niet-coderende RNA's die genexpressie post-transcriptie regelen. microRNA kunnen worden uitgescheiden in de extracellulaire ruimte waar ze lijken relatief stabiel. Bij het bepalen van veranderingen in miRNA expressie kan een belangrijke stap in de richting van de identificatie van biomarkers zijn, het uitvoeren van miRNA profielen en het hanteren van een grote hoeveelheid gegevens kan intimiderend zijn.

Hier beschrijven we een protocol om veranderingen in miRNA expressie in de cerebrospinale vloeistof (voor andere lichaamsvloeistoffen) een gevoelige real time PCR te bepalen. We hebben het gebruik van software beschrijven ook voor gegevensanalyse, zoals statistische analyse en grafische weergave van de resultaten. De gehele procedure is relatief eenvoudig en ongecompliceerd en, afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geprofileerd en het aantal real time PCR machines beschikbaar, ook relatief snel. Het experimentele gedeelte vereist nauwkeurigheid bij het verwerkenRNA en pipetteren in 384-wells platen, terwijl de sectie analyse met behulp GenEx vereist enige basiskennis informatica en statistiek.

Protocol

Het volgende protocol beschrijft de standaard procedure voor het isoleren van RNA uit CSF en het profiel van microRNA's met behulp klaar PCR-platen. Merk op dat de organische fase extractie is optioneel, en dat een drager RNA wordt aan het monster toegevoegd tijdens de extractie om een ​​maximale terugwinning van RNA. Bijgevolg hoeft het RNA te kwantificeren.

Kortom, kan een gemiddelde van 6-8 platen worden uitgevoerd in een dag of de dag cDNA gesynthetiseerd voor (ongeveer 2 uur). Analyse van de gegevens wordt uitgevoerd wanneer alle monsters zijn geprofileerd en in de software geladen. Afhankelijk van het aantal samples / groepen of hun combinatie voor vergelijking kan gegevensanalyse verlangen van een tot enkele uren.

1. RNA-extractie

De RNA-extractie werd uitgevoerd vanaf CSF monsters bevroren opgeslagen bij -80 ° C in porties tot analyse. Voor deze procedure werd de Mirvana Parijs isolatie kit gebruikt, volgende instrumenten van de fabrikantegen voor de totale RNA isolatie. Houdt u er rekening mee dat, hoewel verrijking voor kleine RNA-soorten is mogelijk met deze kit, is deze stap niet gedaan en de RNA-extractie procedure wordt beëindigd nadat de totale RNA isolatie stap. Bovendien, hoewel de Mirvana Paris isolatiekit (zoals andere commercieel verkrijgbare RNA isolatie kits) ofwel geen organische extractie vereisen, een protocol voor deze procedure zijn hieronder.
Het protocol voor RNA extractie bestaat uit twee stappen:
1.1. Organische Extraction (niet nodig als gebruik Mirvana Parijs RNA-extractie kit)
1.2.2. Totaal RNA isolatie

1.1. Organische extractie

1.1.1. Bereid reagentia

1. Voeg 375 ul van 2-mercapto-ethanol naar 2x Denaturing oplossing, en het op 4 ° C.

1.1.2. Bereid de CSF

1. Dooi elke portie van CSF op het ijs voor de RNA-extractie. Voeg 1 ug van MS2 RNA drager tot 0,5 ml ontdooid CSF en voorzichtigmengen. Merk op dat als de organische extractie wordt weggelaten, wordt de MS2 drager worden toegevoegd aan het monster voor RNA isolatie 1.2.2.1 hieronder beschreven.
2. Meng 0,5 ml 2x Denaturing oplossing bij kamertemperatuur om het CB.
3. Voeg 1 ml zuur fenol: chloroform om de CSF plus de 2x Denaturing Oplossing: zorg ervoor dat de bodem onttrokken fase die zuur-fenol: chloroform, niet de waterige buffer die ligt op de top van het mengsel. Bovendien, er rekening mee dat zuur fenol: chloroform bevat fenol, dat is een gif en een irriterend, handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met dit reagens.
4. Vortex gedurende 30-60 sec te mengen. Gemakshalve de 2 ml monster / denaturering oplossing / zuur fenol: chloroform mengsel zijn verdeeld in twee 1,5 ml Eppendorf buisjes.
5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij maximale snelheid (10000 xg) bij kamertemperatuur.
6. Verwijder voorzichtig de waterige (bovenste) fase zonder de onderste fase of de interfase te verstoren en overbrengen naar eennieuwe buis. Noteer het volume hersteld.

1.2. RNA isolatie

Het wordt aanbevolen om een ​​speciale bank, set van pipetten en rekken voor de behandeling van RNA-monsters. De werkruimte en tools worden ontsmet met behulp van RNase Zap spray en doekjes voorafgaand elk experiment.

1.2.1. Bereid reagentia:

1. Voeg 21 ml 100% ethanol miRNA Wash Solution 1 en 40 ml 100% ethanol Wash Solution 2/3. Houdt u er rekening mee dat miRNA Wash Solution 1 bevat guanidiumthiocyanaat dat is een potentieel gevaarlijke stof.

1.2.2. Totaal RNA isolatie

1. Voeg 1.25 volumes kamertemperatuur 100% ethanol aan de waterige fase van de organische extractie en meng.
2. Plaats een filterelement in een van de Collection Tubes.
3. Pipetteer niet meer dan 700 pl van het lysaat / ethanol mengsel op het filterelement.
4. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij maximalesnelheid. Breng het mengsel van meer dan 700 ul in opeenvolgende toepassingen hetzelfde filter. Gooi de doorstroom na elke centrifugering en sla de verzameling buis voor de wasstappen.
5. Solliciteer 700 ul miRNA Wash Solution 1 om het filterelement en centrifugeer gedurende 15 sec bij maximale snelheid. Gooi de stroom door van de Buis van de Inzameling en vervang het filterpatroon in dezelfde Collection Tube.
6. Breng 500 pi wasoplossing 2/3 en centrifugeer gedurende 15 seconden bij maximale snelheid. Gooi de stroom door van de Buis van de Inzameling en vervang het filterpatroon in dezelfde Collection Tube. Breng een tweede 500 ul Wash Solution 2/3 en centrifugeer gedurende 15 sec bij maximale snelheid. Gooi de stroom door van de Buis van de Inzameling en vervang het filterpatroon in dezelfde Collection Tube. Draai de assemblage gedurende 1 minuut bij maximale snelheid om de resterende vloeistof uit het filter te verwijderen.
7. Breng het filterelement in een frisse Collection Tube. Breng 100 & mu, L voorverwarmde (95 ° C) nuclease-vrij water tot het midden van de filter en sluit het deksel. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij maximale snelheid om het RNA te herstellen.
8. Vang het eluaat met RNA en op te slaan bij -80 ° C voor latere aanvragen.
9. Kwantificeren 1 ul van RNA met behulp van de NanoDrop 2000c spectrofotometer. Merk op dat RNA kwantificering kan worden overgeslagen als een RNA drager het monster wordt toegevoegd tijdens RNA-extractie. Dan 8 pl RNA onderworpen aan cDNA-synthese zoals hieronder beschreven.

2. miRNA Profiel: qRT-PCR protocol

Het protocol voor miRNA profilering bestaat uit twee stappen:

1. Eerste streng cDNA synthese
2. Real-time PCR-amplificatie

2.1. Eerste streng cDNA synthese

2.1.1. Verdunnen template RNA

1. Stel de template RNA-monsters tot een concentratie van 5 ng / ul met nuclease vrij water. Indien deRNA is niet gekwantificeerd (zie stap 1.2.2.9), vervolgens 8 pl RNA worden gebruikt voor cDNA-synthese

2.1.2. Bereid reagentia

1. Zachtjes ontdooien de 5x Reaction buffer en nuclease gratis water, en meteen plaats op ijs.
2. Meng door vortexen. Resuspendeer de RNA spike-in door het toevoegen van 40 pi nuclease gratis water aan de buis en meng door vortexen, laat het op ijs gedurende 15-20 minuten. Vlak voor het gebruik, verwijder het enzym mix uit de diepvries, meng door de knop van de buizen en plaats op ijs. Spin down alle reagentia.

2.1.3. Reverse transcriptie reactie opstart

1. Bereid de benodigde hoeveelheid RT werkoplossing in een 1,5 ml Eppendorf buisje of equivalent (in de hoeveelheden aangegeven in Tabel 1, met uitzondering van de RNA-matrijs), meng door vortexen (1-2 sec bij max. snelheid) kort spin down ( we gebruik maken van een mini-Eppendorf centrifuge met vaste snelheid, 10 sec) en plaats het op het ijs. Merk op dat de UniSp6 RNA spike-In het monster toegevoegd voordat de RT-reactie (zie tabel 1).
2. Doseer RT werkende oplossing in nuclease gratis PCR-buisjes.
3. Verdeel template RNA in elke buis.
   Let op: vergeet niet om 10% overmaat volume / elk reagens voor pipetteren en / of robot dood volume te berekenen.

   Reagens	Panel I Volume (pl)	Panel I + II Volume (pi)
   5x reactie buffer	4.4	8.8
   Nuclease gratis water	9.9	19.8
   Enzymmengsel	2.2	4.4
   UniSp6 RNA Spike-in template	1.1	2.2
   Sjabloon totaal RNA (5 ng / ul)	4.4	8.8
   Totaal Volume	22	44

   
   Tabel 1. Reverse transcriptie reactie setup.

2.1.4. Meng en spin reagentia

1. Meng de reactie van zachte (1-2 sec) vortexen dat alle reagentia goed gemengd. Na het mengen, spin down (mini Eppendorf centrifuge met vaste snelheid, 10 sec).

2.1.5. Incubate en warmte inactiveren

1. Programmeer een PCR-machine als volgt:
2. Incubeer gedurende 60 minuten bij 42 ° C
3. Warmte-inactivatie van het reverse transcriptase gedurende 5 min bij 95 ° C
4. Onmiddellijk afkoelen tot 4 ° C
5. Bewaren bij 4 ° C of bevriezen
   Let op: het protocol kan worden onderbroken in dit stadium. De onverdunde cDNA kan bij -20 ° C worden bewaard tot 5 weken (optioneel bewaren bij 4 ° C tot 4 dagen).

2.2. Real-time PCR-amplificatie

2.2.1. Bereid reagentia voor real-time PCR

1. Plaats cDNA (uit stap 2.1.5) op ijs.
2. Dooi nuclease gratis water en PCR Master mix op ijs. Bescherm de PCR Master mix flacons uit licht door ze te bedekken met aluminiumfolie. Vlak voor het gebruik, meng de PCR Master mix door vortexen 1-2 sec in een mini-centrifuge en spin down bij 1.500 xg gedurende 1 minuut.

2.2.2. Combineer SYBR Green meester mix, water, en cDNA en toe te voegen aan PCR-platen

De volgende procedure wordt aanbevolen om lage concentraties van cDNA van het naleven van buis oppervlak te voorkomen:

1. Voor het verwijderen van de plaat afdichting, kort spin down de plaat (s) in een gekoelde centrifuge bij 1500 xg gedurende 1 minuut.
2. In een 15 ml conische buis, combineren 2x PCR Master mix en water. Panel I: 2000 pi 2x master mix en 1980 pi water; Panel I + II: 4000 pi 2x master mix en 3960 μ; L water.
3. Voeg 20 ul cDNA (paneel I) of 40 ul cDNA (paneel I + II) en meng.
4. Meng voorzichtig door vortexen 1-2 sec en spin down in een gekoelde centrifuge bij 1500 xg gedurende 1 minuut.
5. Plaats de PCR Master mix / cDNA mix in een multichannel pipet reservoir. Het kan zijn dat een reservoir dat de lengte van de meerkanaalspipet heeft identificeren. Dit houdt het niveau van het volume hoog genoeg waardoor gelijke volume hoeveelheden gedurende de multichannel. Dit is kritisch ten opzichte van de laatste paar porties.
6. Pipetteer 10 ul PCR Master Mix / cDNA mix aan elk putje van de 384-wells plaat met een 16-kanaals pipet.
7. Dicht de plaat met optische afdichting.
8. Spin plaat even in een gekoelde centrifuge (1500 xg gedurende 1 min), om de oplossingen te mengen en te verwijderen luchtbellen.
   
   Let op: het experiment kan worden gepauzeerd op dit punt. Bewaar de reacties beschermd tegen licht bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur.

2.2.3. Real-Time PCR

Voer real-time PCR-amplificatie en de smeltcurve analyse na de parameters in tabel 2.

Proces Stap	Instellingen, Roche LC480
Polymerase Activering / Denaturatie	95 ° C, 10 min
Amplification	45 Versterking cycli bij 95 ° C, 10 sec 60 ° C, 1 min Ramp-tarief 1.6 ° C / sec Optische lees
Smeltcurveanalyse	Ja

Tabel 2. Real-time PCR-cyclus omstandigheden met behulp van de Roche LightCycler 480.

2.3. Real-time PCR data-analyse

Real-time PCR data-analyse wordt gedaan met de Exiqon GenEx Professional 5.0, volgende thij aanbevolen instructies. De GenEx stap-voor-stap handleiding kan worden gedownload op http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
Data-analyse bestaat uit drie stappen:

1. Invoer van gegevens
2. Preprocessing van gegevens
3. Statistische analyse

2.3.1. Invoer van gegevens

1. In de Roche LightCycler 480 selecteer de ^2e afgeleide analysemethode en bereken de Cq waarden. De gegevens worden geëxporteerd als een tafel en opgeslagen als tekstbestanden.
2. Om de gegevens, geopend GenEx importeren en klik op de Exiqon importwizard knop en klik op "Start". Volg de instructies om formaat, instrument en plaatindeling file (s) te selecteren. Merk op dat plaatindeling bestanden (Excel-bestanden) worden gedownload van de Exiqon website ( http://www.exiqon.com/plate-layout-files ).
3. Import Panels I en II en klik op "Next".
4. De gegenereerde na importbestand tabel bevat voorgedefinieerde kolommen. Monsters namen kunnen worden bewerkt en classificatie kolommen kunnen worden toegevoegd of verwijderd bij deze stap. Klik op "Next" als u klaar bent.
5. Gegevens opslaan en laden om Data Editor.

2.3.2. Preprocessing van gegevens

1. Zoals aanbevolen door Exiqon en GenEx, bij het vergelijken van meerdere platen de eerste ding om te doen is om de gegevens tussen de platen te kalibreren door te kiezen voor inter-plaat kalibratie van het voorbewerken menu.
2. Het wordt aanbevolen om miRNA arrays draaien in drievoud runs. Als een miRNA niet aanwezig is in ten minste twee van de drie replica zal worden ingesteld als nonexpressed.
3. In de volgende stap in de voorbewerking, stel een afgesneden. Definiëren een afgesneden waarde geeft aan dat gegevens van een drempelcyclus _(Ct) deze waarde genegeerd. In de huidige experimenten met hersenvocht specimen, werd het afgesneden vastgesteld op 39. Therefore alle monsters met een C _t hoger dan 39 in de drie replica's worden genegeerd. Als een miRNA een C _t> 39 voor een probe (een replica van de drie), zal deze lezing wordt vervangen door het gemiddelde van de _Ct voor de andere twee sondes, mits ze beide onder 39.
4. Definieer referentie genen. GenEx Professional heeft de optie om gebruik te maken geNorm en / of NormFinder te verwijzen genen te identificeren. Selecteer een lijst van miRNAs die soortgelijke Cq waarden in alle monster en voer geNorm en / of NormFinder. Volgens deze analyse, in het voorbeeld hier gegeven, miR-622 en miR-1266 had de uniforme waarden over de monsters en werden gekozen als referentie genen (Figuur 1).
5. Vervolgens worden de gegevens genormaliseerd met de referentie-genen en de verkregen waarden komen overeen met de ΔC _t
6. Als cDNA-synthese werden uitgevoerd in drievoud, op dit moment de waarden worden gemiddeld.
7. Valideren sheet opnieuwbewegen lege en bijna lege kolommen. In de voorbewerking venster selecteer "Bevestig sheet" en dan toe te passen op de Remove lege kolommen lijn. In de onderstaande lijn, koos het gewenste percentage geldige gegevens en klik op Toepassen. Selecteer bijvoorbeeld 100% als u alleen miRNAs voor alle monsters te vergelijken.
8. Handvat ontbrekende gegevens.
   Selecteer "Ontbrekende gegevens" van het Preprocessing menu en koos voor een van de opties om ontbrekende gegevens te verwerken. Deze stap is vereist. Merk op dat GenEx je fout zal geven als je probeert om bestanden die onverwerkte ontbrekende gegevens bevat, te laden.
9. Bepaal relatieve kwantificatie tussen groepen monsters (dwz. Experiment versus controle). Relatieve kwantificering tussen groepen wordt berekend met behulp van de ΔΔ C _t methode. In GenEx, klikt u op het tabblad voorbewerking en selecteer relatieve kwantificatie. In het venster selecteert u de referentiegroep en druk toe te passen. Merk op dat voor grafische voorstellingen en / of voor verdere statistische analyses exprsessieschijven gegevens moeten worden omgezet in een logaritmische schaal. In het voorbewerken menu, selecteer Log2.

2.3.3. Statistische analyse

GenEx software maakt het mogelijk een breed scala van statistische analyses, waaronder T-toets en ANOVA.

1. Laad de finale mdf bestand in GenEx en open data manager. Het is cruciaal om de juiste monsters of groepen van monsters waarvoor statistische analyse wordt uitgevoerd kiezen.
2. Selecteer "Statistieken" en koos op het icoon voor de gewenste test.
3. Klik op "Openen" in het Configuratiescherm. Resultaten als Excel of mdf bestanden op te slaan.

2.3.4. Expressie profilering

MicroRNA's en monsters kunnen worden ingedeeld, geclusterd, en gevisualiseerd op warmte-kaarten en dendrograms, als volgt

1. Laad de finale mdf bestand in GenEx en open data manager. Gebruik dit venster om groepen van monsters of miRNAs te selecteren en te creëren. Klik op "Apply" als u klaar bent.
2. In de linkerbovenhoek select cluster en klik op het pictogram heatmap
3. In het configuratiescherm venster klikt u op "Run". De heatmap kunnen worden opgeslagen in verschillende formaten zoals tiff of bmp, het kan ook worden gekopieerd en aangepast indien nodig.

Resultaten

De resultaten van deze studie zijn eerder gepubliceerd ^1. Figuur 1 toont resultaten uit de analyse van kandidaatreferentiemateriaal microRNA middels geNorm toepassing. Dienovereenkomstig twee microRNA, miR-622 en miR-1266, werden als referentie genen en werden gebruikt miRNA waarden normaliseren.

Voor de GSK-studie hadden we drie groepen van monsters: HIV-(n = 10), bijenkorf (n = 4), en HIV + zonder Encefalitis (HIV +, n = 5). De twee gr...

Discussie

MicroRNA zijn kleine niet-coderende RNA's die genexpressie reguleren door het remmen van vertaling en / of het bevorderen van mRNA degradatie ^2. Door hun grote stabiliteit in celvrije voorwaarden zijn microRNA ontdekt in veel lichaamsvloeistoffen. Bovendien is duidelijk expressieprofiel van microRNA gecorreleerd met fase en / of progressie van een verscheidenheid van menselijke kankers ^3-9.

Er zijn verschillende tools beschikbaar om microRNA profiel, met inbegrip va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tabel 3. Lijst van apparatuur.
Finnpipette Novus Multichannel Pipetten	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipettips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler 480 Real-Time PCR Systeem	Roche
LightCycler 480 Afdichtfolie	Roche	04 729 757 001
Gekoelde Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-plaats	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifugebuizen, gesteriliseerd	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173
Tabel 4. Lijst van reagentia.
Universele c-DNA-synthesekit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green mastermix, Universeel RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapuur Gedestilleerde Water Dnase, Rnase vrij	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana miRNA isolatiekit, 40 isolaties	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2-mercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease vrij water	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	AM9780