Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography

Summary

De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.

Abstract

De bacteriële celwand is van cruciaal belang voor de bepaling van de celvorm tijdens groei en deling en behoudt de mechanische integriteit van cellen in het gezicht van turgordrukken verschillende atmosferen in omvang. In de verschillende vormen en maten van het bacterierijk bestaat de celwand uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door korte peptiden. Peptidoglycan's centrale belang voor bacteriële fysiologie ligt ten grondslag aan het gebruik ervan als een antibioticumdoel en heeft genetische, structurele en celbiologische studies gemotiveerd over hoe het robuust wordt geassembleerd tijdens groei en deling. Niettemin zijn er nog steeds uitgebreide onderzoeken nodig om de belangrijkste enzymatische activiteiten in peptidoglycansynthese en de chemische samenstelling van bacteriële celwanden volledig te karakteriseren. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is een krachtige analytische methode voor het kwantificeren van verschillen in de chemische samenstelling van de wanden van bacteriën die onder verschillende omgevings- en genetische omstandigheden worden gekweekt, maar de doorvoer ervan is vaak beperkt. Hier presenteren we een eenvoudige procedure voor de isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor biologische analyses van peptidoglycan via HPLC en Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), een uitbreiding van HPLC die pompen gebruikt om ultrahoge drukken tot 15.000 psi te leveren, vergeleken met 6.000 psi voor HPLC. In combinatie met de voorbereiding van hier gepresenteerde bacteriële celwanden, zullen de low-volume monsterinjectoren, detectoren met hoge bemonsteringssnelheden, kleinere monstervolumes en kortere looptijden van UPLC een hoge resolutie en doorvoer mogelijk maken voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycansamenstelling en fundamentele bacteriële celbiologie in de meeste biologische laboratoria met toegang tot een ultracentrifuge en UPLC.

Introduction

Het doel van de hierin beschreven methode is om intacte bacteriële celwanden (sacculi) te isoleren en de peptidoglycan (PG) zodanig te verteren dat Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) kan worden gebruikt om informatie te verstrekken zoals de identiteit van de muropeptidecomponenten en hun concentraties, de gemiddelde lengte van glycanstrengen en de fractie materiaal die betrokken is bij crosslinks tussen strengen. Voor een gedetailleerde bespreking van PG biochemie en muropeptide soorten, zijn er verschillende uitstekende beoordelingen die PG structuur en zijn rol in infectie, resistentie, morfogenese, en groei^1-6beschrijven . High Performance Liquid Chromatography (HPLC) voor PG-analyse werd aanvankelijk ontwikkeld door Glauner en Schwarz in de jaren 1980, en meer recentelijk is uitgebreid verbeterd en toegepast in de laboratoria van Miguel de Pedro en Waldemar Vollmer. Eerdere methoden maakten gebruik van aminozuuranalyse of papierchromatografie, tijdrovende en vervelende technieken die geen nauwkeurige of volledige beoordelingen van celwandcomponenten opleveren.

UPLC-analyse kan eenvoudig worden geïmplementeerd in elk fundamenteel onderzoekslaboratorium dat toegang heeft tot een ultracentrifuge en UPLC. De UPLC-methode die we hieronder presenteren, isoleert volledige sacculi en biedt daarmee uitgebreide, kwantitatieve informatie over alle chemische soorten daarin. Deze methode levert nauwkeurige kwantificering van alle muropeptiden over een populatie van bacteriën, allemaal binnen een 20 minuten UPLC run. De toepassing van deze methode omvat alleen basislaboratoriumvaardigheden, zonder aanzienlijke financiële investeringen in materialen. Om de stappen in deze methode uit te voeren, hoeven onderzoekers alleen bekwaam te zijn in pipetten, het voorbereiden van buffers en enzymen en het aanpassen van de pH, waardoor het toegankelijk is voor een breed scala aan wetenschappelijke disciplines. De keuze van enzymen die in dit protocol worden gebruikt, hangt af van de soort bacterie die wordt geanalyseerd; het hier beschreven protocol is nuttig voor Escherichia coli, en is over het algemeen voldoende gebleken voor het isoleren van sacculi van andere Gram-negatieve organismen. Overleg met de literatuur wordt aanbevolen bij het toepassen van deze methode op grampositieve bacteriën; bij deze soorten is sacculuszuivering van oudsher moeilijker. In het bijzonder kan deze methode worden gewijzigd in termen van enzymkeuze en lengte van de spijsverteringstijden om de dikkere wanden en accessoirepolymeren zoals teichoïnezuren van grampositieve bacteriën te huisvesten. Het eerste enzym in dit protocol splijt buitenste membraan lipoproteïne (zoals Braun's lipoproteïne, of Lpp) gehechtheid aan de peptidoglycan, waardoor alles behalve de C-terminale di- (of tri-) peptide van de Lpp uit de celwand. Deze stap is nodig bij het onderzoeken van Enterobacteriën, maar veel andere Gram-negatieve bacteriën hebben geen Lpp-equivalenten, en daarom kan deze stap worden overgeslagen. Een tweede enzym splijt specifiek na de muramische zuurcomponent van de peptidoglycan, waardoor de disaccharidesubeenheid die de muropeptidesoort vormt, wordt opgelost. Om een nauwkeurige beoordeling van de architectuur van de PG te bieden, moet voorzichtig worden omgegaan met het verteren van de sacculi om decolleté van de dwarsbruggen of een ander deel van de peptidestam te voorkomen.

Hoewel de chemische samenstellingen van peptidoglycan uit meer dan 100 stammen van ~40 bacteriesoorten zijn geanalyseerd door HPLC, zijn er geen analyses uitgevoerd met UPLC-technologie. Bovendien heeft eerder werk peptidoglycan gekenmerkt uit slechts een klein deel van het bacteriële domein, deels beperkt door de doorvoer van HPLC. Daarom zal de verspreiding van deze methode onder zoveel mogelijk onderzoekers en de implementatie op UPLC-platforms van cruciaal belang zijn voor het stimuleren van fysiologische studies van de grote fractie van bacteriële soorten waarvan peptidoglycan nog moet worden gecategoriseerd.

Protocol

1. Kweek bacteriële culturen in 2,5 ml media 's nachts

Verdun culturen 1:100 in 250 ml verse media en groei tot OD₆₀₀ van 0,7-0,8. Bereid een oplossing van 6% natriumdodecylsulfaat (SDS) in water.

LET OP: SDS-poeder is gevaarlijk - vermijd het inademen van SDS-poeder; draag een masker over neus en mond.

2. Dag 1 - Lysing bacteriële culturen wordt uitgevoerd in de loop van een dag en 's nachts

1. Terwijl verdunde culturen groeien, zet je een kokend waterbad op een hete plaat in een bekerglas van 1 L. Zodra het water kookt, aliquot 6 ml van 6% SDS in 50 ml polypropyleen buizen, voeg een kleine roerstaaf toe aan elke buis, bevestig buisdeksels aan vingerdicht, plaats buizen in waterbad en zet roeren aan tot 500 tpm op de kookplaat.
2. Oogst de culturen van 250 ml op 5.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en resuspend pellets in 3 ml media of 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing. Pipetteer celsuspensusingen langzaam in buizen van 50 ml met 6% kokende SDS om de cellen te lyseren (eindconcentratie 4% SDS) terwijl de buizen in het kokende waterbad worden ondergedompeld en sluit de deksels opnieuw tot vingerdicht. Celsuspensingen moeten snel worden overgebracht in kokende SDS zodra ze opnieuw zijn begeven. Abrupte veranderingen in het milieu moeten worden vermeden, omdat dit een onjuiste wijziging van de celwandstructuur kan veroorzaken.
3. Bedek het kokendwaterbad en laat de cellen 3 uur koken, controleer het waterniveau regelmatig en vul het waterbad indien nodig bij. Schakel na 3 uur het verwarmingselement van de kookplaat uit en blijf 's nachts roeren bij 500 tpm.

3. Dag 2 - Enzymatische spijsverteringen worden uitgevoerd in de loop van één dag

1. Als SDS 's nachts in de 50 ml-buisjes is neergeslagen, zet het waterbad dan nog eens 1-2 uur aan de kook. Zet een warmteblok aan tot 60 °C. Bereid een voorraad van 1 mg/ml Pronase E in 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl en activeer Pronase E bij 60 °C gedurende ten minste 30 minuten.
2. Gebruik een ultracentrifugeset van 400.000 × g om monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te laten draaien om de grote PG-polymeren te pelleteren en daardoor te zuiveren van andere cellulaire componenten. Verwijder supernatant voorzichtig en resuspend elke pellet in ultrapure water op kamertemperatuur. OPMERKING: Het resuspensievolume is afhankelijk van het volume van de gebruikte ultracentrifugebuizen; gebruik een volume dat de buizen ten minste halverwege vult, maar het maximale volume van de buizen niet overschrijdt. Herhaal centrifugeren/wassen totdat het water geen bellen vormt tijdens resuspensie, wat aangeeft dat de SDS volledig is verwijderd (meestal drie wasbeurten). Stop met het wassen van de pellet als er een wit neerslag ontstaat, omdat dit aangeeft dat de sacculi samenklonteren. Klonteren is niet catastrofaal, maar klonten binden zeer sterk aan plastic en glaswerk waardoor grote monsterverlies ontstaat. Ga in dit geval verder met het protocol met behulp van het samengeklonterde sacculi-monster.
3. Bij de laatste centrifugeer-/wasstap de monsters opnieuw in 900 μl van 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06% w/v NaCl en overbrengen naar 2 ml buizen die eerder met een kleine naald met gaten in de bovenkanten waren gestoken. Voeg 100 μl geactiveerde Pronase E (100 μg/ml eindconcentratie) van 100 μl toe aan elk monster en incubeer gedurende 2 uur bij 60 °C. Stel een ander warmteblok in op 100 °C.
4. Stop de Pronase E-vergisting door 200 μl 6% SDS aan elk monster toe te voegen en kook de monsters gedurende 30 minuten in het warmteblok van 100 °C. Zet een ander warmteblok op 37 °C en maak een voorraad van 1 mg/ml muramidase (mutanolysine) in 50 mM fosfaatbuffer (pH 4,9).
5. Gebruik net als in stap 3.2 een ultracentrifugeset van 400.000 × g om monsters gedurende 20 minuten op kamertemperatuur te draaien en te wassen met ultrapure water op kamertemperatuur totdat SDS volledig is verwijderd (meestal drie wasbeurten). Het resuspensievolume is afhankelijk van het volume van de gebruikte ultracentrifugebuizen; gebruik een volume dat de buizen ten minste halverwege vult, maar het maximale volume van de buizen niet overschrijdt.
6. Bij de laatste centrifugeer-/wasstap worden de monsters geresuspendeerd in 200 μl natriumfosfaatbuffer van 50 mM (pH 4,9). Dit volume kan worden aangepast aan de hoeveelheid peptidoglycan in het monster en kan afhankelijk zijn van soorten. Als er eerder gepubliceerde rapporten van HPLC-analyse voor de soort van belang zijn, kan dit volume worden geschat op basis van deze kwantificaties (een compilatie van HPLC PG-studies is te vinden in de aanvullende informatie van referentie⁷). Voor andere soorten kan de sacculus prep tot deze stap worden uitgevoerd en vervolgens kunnen verschillende hoeveelheden resuspensievolumes worden toegevoegd om monsters te repliceren om het minimale volume te bepalen waarmee de PG in oplossing kan blijven (zie Discussie voor verdere schattingen). Als het monster meer peptidoglycan bevat, verhoog dan het resuspensievolume; als het monster weinig peptidoglycan heeft, vermindert u het resuspensievolume tot minimaal 50 μl.
7. Breng de monsters over in tubes van 1,5 ml en voeg 1 mg/ml muramidase toe om een eindconcentratie van 40 μg/ml te geven. Incubeer 6-8 uur of 's nachts bij 37 °C.

4. Dag 3 - Voorbereiding van monsters voor UPLC wordt uitgevoerd op de laatste dag

1. Zet een warmteblok aan tot 100 °C. Kook de monsters 5 minuten zonder SDS om de muramidasevertering te stoppen. Centrifugeer monsters gedurende 10 minuten bij 16.000 × g bij kamertemperatuur en breng het supernatant (muropeptiden zijn nu oplosbaar) over naar glazen buizen van 13 mm x 100 mm. Probeer zoveel mogelijk supernatant te herstellen en kom heel dicht bij de pellet zonder deze te verstoren.
2. Stel de pH in door 500 mM boraatbuffer (pH 9) aan het monster toe te voegen voor een eindconcentratie van 100 mM boraatbuffer. Boraatbuffer is compatibel met het reductiemiddel natrium borohydride. Voeg 1-2 korrels natrium borohydride toe om elk monster te verminderen en laat de reactie minstens 30 minuten bij kamertemperatuur doorgaan. LET OP: Natrium borohydride is zeer reactief en gevaarlijk om te hanteren - vermijd contact met de huid (draag handschoenen) en vermijd contact met de ogen (draag een veiligheidsbril).
3. Pas de monsters aan op pH 3-4 (het muropeptide iso-elektrisch punt is ~3,5) met 50% v/v orthofosforzuur met stappen van 20 μl tot pH 6, gemeten met pH-indicatorpapier, en vervolgens met stappen van 2 μl. LET OP: Orthofosforzuur is corrosief en gevaarlijk om mee om te gaan - vermijd contact met de huid (draag handschoenen) en vermijd contact met de ogen (draag een veiligheidsbril). Het monster moet borrelen als reactie op toevoeging van orthofosforzuur; wanneer het monster stopt met borrelen, geeft dit meestal aan dat een pH van 6 is bereikt. Als er geen borreling in het monster optreedt, kan dit erop wijzen dat de toegevoegde hoeveelheid natrium borohydride te klein was. Stop in dit geval met het verlagen van de pH, voeg voorzichtig een of twee korrels natrium borohydride toe, laat 5-10 minuten reageren en hervat vervolgens de pH-aanpassing.
4. Filtermonster door een spuitfilter van 0,22 μm rechtstreeks in een UPLC-injectieflacon. Als er een neerslag is gevormd, verwarmt u de buis met meerdere gangen door een vlam voordat u filtert. Als het monster niet binnen de dag in het UPLC-instrument wordt geïnjecteerd, vriest u 's nachts bij -20 °C in. Monsters kunnen tot een jaar worden bewaard bij -80 °C. Het monster kan worden ontdooid door meerdere keren door een vlam te gaan.
5. Injecteer 10 μl van elk monster op een UPLC-instrument dat is uitgerust met een omgekeerde fasekolom van C18 1,7 μm en een absorptiedetector die is ingesteld om 202-208 nm te bewaken. Monsters worden opeenvolgend geïnjecteerd, maar met automatische bemonsteringsmogelijkheden kunnen maximaal 96 monsters in batch worden verwerkt. Gebruik 50 mM natriumfosfaat (pH 4,35) + 0,4% v/v natrium azide voor oplosmiddel A en 75 mM natriumfosfaat (pH 4,95) + 15% v/v methanol voor oplosmiddel B. OPMERKING: Natrium azide wordt toegevoegd om de absorptie van methanol van 205 nm te compenseren om baseline drift te voorkomen. Stel de stroom in op 0,25 ml/min en gebruik een lineaire gradiënt van meer dan 25 min om binnen 30 minuten 100% oplosmiddel B en sequentiële elutie van muropeptiden te bereiken. Als massaspectrometrie zal worden gebruikt om muropeptiden na UPLC te karakteriseren, verzamel dan fracties van de piek van belang in een fractiecollector en droog de fracties met behulp van een centrifugaalverdamper.

Results

Volgens de procedure in figuur 1moet het uiteindelijke monster bestaan uit ten minste 200 μl heldere oplossing die rechtstreeks in een UPLC-flacon is gefilterd (stap 4.4). UPLC-scheiding van de verschillende muropeptiden in een bacterieel monster is afhankelijk van hun relatieve oplosbaarheid tussen de vloeibare mobiele fase en de stationaire fase van de kolom. Omgekeerde fase C18-kolommen bieden een sterk hydrofobe matrix om de muropeptidesoorten te scheiden op basis van hydrofobiciteit en grootte^8...

Discussion

Een cruciale stap in deze procedure is stap 3.1 van de tweede dag van de monstervoorbereiding. Als het SDS 's nachts is neergeslagen of als de monsters gedurende enkele weken bij kamertemperatuur in 4% SDS zijn bewaard, moeten de monsters ten minste 1 uur opnieuw worden gekookt om de SDS opnieuw te laten koken. Een veel voorkomende oorzaak voor SDS-neerslag is het gebruik van media met kaliumzouten, dus kalium moet indien mogelijk in media worden vermeden. Zoals vermeld in de sectie Representatieve resultaten, is het ook...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Natriumborohydrid is zeer reactief en gevaarlijk om te hanteren
Orthofosforzuur	Sigma-Aldrich	79607	Orthofosforzuur is corrosief en gevaarlijk om te hanteren
Boorzuur	Sigma-Aldrich	31146
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002	Natriumazid is een gif
Natriumtetraboraat	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0,22 μm spuitfilters	Fisher	SLGVR04NL
pH-strips (pH-bereik 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropyleen Falcon-buizen	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glazen buizen	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm glazen herstelvial met schroefhals	Waters	186000327C
Natriumdodecylsulfaat	Ambion	AM9820	SDS-poeder is gevaarlijk
Instrumentatie
Waters Acquity UPLC H-Class systeem, inclusief:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm kolom
Acquity UPLC PDA-detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm kolomverwarmer/koeler