DNabT cellen zijn zeldzaam onder perifere T-cellen; maar ze zijn er in overvloed in bepaalde niet-lymfoïde weefsels. Moeilijkheid van het isoleren van DN T-cellen van niet-lymfeweefsel belemmert hun functionele analyse Ondanks toenemende erkend pathofysiologische betekenis. We beschrijven een nieuw protocol voor isolatie van hooggezuiverde DN T-cellen van muizen nier.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Er is geen standaard protocol voor de isolatie van DN T-cellen van de niet-lymfoïde weefsels ondanks hun betrokkenheid vaker gerapporteerd in verschillende immuunresponsen. DN T-cellen een uniek immuun celtype dat is betrokken bij regulering van immuun-en auto-immuunreacties en tolerantie voor allotransplants 1-6. DN T-cellen zijn echter zeldzaam in perifeer bloed en secundaire lymfoïde organen (milt en lymfeknopen), maar zijn belangrijke inwoners van de normale nier. Er is zeer weinig bekend over hun pathofysiologische functies 7 vanwege hun gebrek in de periferie. We hebben recent beschreven een uitgebreide fenotypische en functionele analyse van deze populatie in de nieren 8 in stationaire toestand als tijdens ischemie reperfusie schade. Analyse van DN T-cel functie zal aanzienlijk worden uitgebreid door het ontwikkelen van een protocol voor de isolatie van de nier.
Hier beschrijven we een nieuw protocol dat toelaat Isolation van zeer zuivere ab CD4 + CD8 + T-cellen en DN T-cellen van de muis nieren. Kortom, wij verteren nierweefsel met collagenase en isoleren nier cellen (KMNC) door dichtheidsgradiënt. Dit wordt gevolgd door twee stappen hematopoietische T-cellen verrijken van 3% tot 70% van KMNC. De eerste stap bestaat uit een positieve selectie van hematopoïetische cellen met behulp van een CD45 + isolatie kit. In de tweede stap worden DN T-cellen negatief geïsoleerd door verwijdering van niet-gewenste cellen met CD4, CD8 en MHC klasse II monoklonale antilichamen en CD1d α-GalCer tetrameer. Deze strategie leidt tot een populatie van meer dan 90% zuiver DN T-cellen. Oppervlak kleuring met bovengenoemde antilichamen gevolgd door FACS-analyse wordt gebruikt om de zuiverheid te bevestigen.
Inleiding
Perifere αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - dubbel-negatieve (DN) T-cellen zijn onderverdeeld in verschillende subgroepen die verschillende fenotypes en functies 1-4 bezitten. DN T-cellen worden slecht begrepen, maar in toenemende mate betrokken bij pathofysiologische immuunreacties in verschillende ziektemodellen 4-6.
DN T-cellen een uniek immuun celtype die steeds betrokken bij de regulatie van verschillende immuun-en auto-immune reacties en de modulatie van allotransplant tolerantie. 4-6, 9 zijn zeldzaam in het perifere bloed en secundaire lymfoïde organen (milt en lymfeklieren ). Ze zijn echter belangrijke inwoners van de normale nier en darmepitheel 10-12. Er is zeer weinig bekend over de functie 7 van de nier bij de statische en onder pathologische omstandigheden zoals acute nierschade (AKI) geassocieerd met nier Transplmier.
Vanwege de ingewikkelde rol van de verschillende immuuncellen in het reguleren van immuunreacties waaronder alloresponses, het definiëren van de rol van elke speler is van cruciaal belang in het begrijpen alloresponses en het ontwerpen van nieuwe therapieën. Gezien de grote aantallen DN T-cellen in de nieren onder fysiologische en andere ziektetoestanden, DN T-cellen waarschijnlijk een kritieke rol in het reguleren immuun-en auto-immuunreacties in muizen en mensen, en alloresponses spelen bij transplantatiepatiënten. Accumuleren hoewel nog steeds verspreid bewijs impliceert DN T-cellen in zowel pathogene en immunosuppressieve functies, maar het is slecht begrepen waarom en hoe ze vertonen een specifiek schadelijk of onderdrukkende functie en hoe de omgeving beïnvloedt hen.
Door hun geringe hoeveelheden in de nier, verbeterde methoden van isolatie noodzakelijk.
Er is geen standaard protocol voor isolatie van DN T-cellen van thij niet-lymfoïde weefsels. Het protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het isoleren van DN T-cellen van de nier; Echter kan de werkwijze ook worden gebruikt voor verschillende niet-lymfoïde weefsel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Media en reagentia
- Instrumenten: Bereid de reagentia onder steriele omstandigheden en te gebruiken onder een laminaire stroming kap.
- Bereid 1 liter RPMI weefselkweekmedium, voeg 5% foetaal runderserum, 2,1 g natriumbicarbonaat, 10 ml glutamaat 100x, 10 mg HEPES, 1 mg natriumpyruvaat en 10 ml 100x penicilline / streptomycine.
Let op: de aanbevolen weefselcultuurmedium, RPMI, is uitwisselbaar met DMEM. - Bereid 5% collagenase "D"-oplossing (5 ml collagenase "D" naar 9 ml weefselkweekmedium).
- Voeg Percoll oplossing bij drie verschillende concentraties: 100%, 80% en 40%. De volgende concentraties worden berekend voor 1 monster. Houd oplossingen bij kamertemperatuur.
- Percoll oplossing: voeg 9 ml onverdunde Percoll (uit voorraad-oplossing); voeg 1 ml PBS 10x.
- Percoll oplossing: voeg 8 ml Percoll 100%; voeg 2 ml PBS 1x.
- Percoll oplossing:voeg 4 ml Percoll 80%; voeg 4 ml PBS 1x.
- Voeg 1 L van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer; voeg 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% natriumazide (0,1%), 2 ml EDTA-agent, vul aan tot 1000 ml met 1x PBS.
2. Voorbereiding van de Nier Spijsvertering
- Na de nodige institutionele goedkeuring verworven, offeren en exsanguinate de muizen met standaard methoden en volgens de geldende voorschriften en verzorging van dieren richtlijnen.
- Verdoven de muis met pentobarbital (0.07 mg / kg).
- Overgaan tot verbloeding.
- Plaats de muis in liggende positie op een operatietafel.
- Spuit de buikstreek met 70% ethanol.
- Voeg 10 ml collagenase D oplossing van de petrischaal.
- Verwijder decapsulate beide nieren van elke muis.
- Open de abdomimal holte door een middellijn incisie door de buikhuid en het buikvlies van het borstbeen tothet schaambeen.
- Expose de linker nier in door de darm zijdelings opzij.
- Scheiden de linker capsule voorzichtig met de tang.
Opmerking: De capsule wordt als transparante laag rond de nieren en gedeeltelijk onder perinephric vetweefsel. - Verwijder de linker nier door het snijden van de pedicle schepen met behulp van een chirurgische schaar.
- Herhaal dezelfde procedure voor de rechter nier.
Opmerking: De rechter nier is craniaal en dichter bij de middellijn (steeltjes korter).
- Plaats de nier in de petrischaal.
- Snijd het nierweefsel in kleine stukjes (1-2 mm in afmeting) met bijvoorbeeld een metalen blad en plaats de stukken in de collagenase-oplossing gedurende 30-45 minuten in de incubator bij 37 ° C (figuur 1).
3. Voorbereiding van Kidney cellen (KMNC) van de Kidney Spijsvertering
- Verkrijgen van een celsuspensie van de nierdigestie door het mechanisch verstoren van het weefsel met een filter (70 pm) en resuspendeer in 25 ml weefselkweekmedium en meng.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C aan de celsuspensie pellet.
- Resuspendeer de pellet in 4 ml 40% Percoll oplossing en voorzichtig overlay op 4 ml 80% Percoll oplossing met een transfer plastic pipet, heel langzaam en voorzichtig. Dit zal resulteren in twee fasen duidelijk gescheiden door een doorzichtige laag. Bovenop een gele laag overeenkomt met de lipiden.
- Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met de centrifuge rem van stand.
- Verwijderen door aspiratie de gele en dikke toplaag (ongeveer 1-2 ml).
- Verzamel alleen de lichte witachtige doorzichtige laag van het grensvlak van de twee fasen met een transferpipet. Deze suspensie Heel voorzichtig over in een 15 ml conische buis met 2 ml weefselkweekmedium en voeg 13 ml medium tot een totaal volume maken15 ml.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de monsters in 1 ml medium.
- Tel het aantal KMNC gebruik trypanblauwexclusie op een hemocytometer en het resultaat wordt uitgedrukt als aantallen KMNC per ml per nier.
- Was eenmaal als hierboven.
4. Isolatie van hematopoietische (CD45 +) Cellen van KMNC (stap I)
- Resuspendeer de cellen tot 10 7 tot 90 gl loopbuffer.
- Voeg 10 ul van CD45 microkorrels en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 1 ml van de buffer om de reactie te stoppen. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 500 gl loopbuffer.
- Bereid de magnetische kolom nadeel bij de magneet en spoel met 3 ml loopbuffer.
- Leid de celsuspensie door de magnetische kolom en verzamel de ongelabelde cellen passeren de kolom.
- Was de cellen drie keer met 3 ml running buffer. Verzamelen dan de uitstroom.
- Verwijder de kolom uit de afscheider en pipet 5 ml van het runnen van buffer op de zuilen en het spoelen van de gelabelde fractie onmiddellijk. Deze fractie bevat de CD45 + cellen. Tel de cellen.
- Om het absolute aantal verschillende T cel populaties te berekenen in nieren vermenigvuldig het totale aantal KMNC door het percentage positieve cellen bepaald door flowcytometrie (figuur 2).
5. Isolatie van DN T-cellen uit CD45 + Voorbereiding door negatieve selectie (stap II)
- Voeg 2,5 pl (0,5 mg / ml, 1,25 ug) van elk van de volgende gebiotinyleerde antilichamen: anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc receptor (CD16/32), anti-MHC klasse II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrameer voor elke 10 7 hematopoietische cellen.
- Incubeer cellen gedurende 30 min in koude kamer.
- Voeg 1 ml anti-biotine microbolletjes.
- Incubeer gedurende 30 minuten in een koude kamer.
- Plaats de buis in thij magneet en overgaan tot uitputting.
- Tel de levensvatbare cellen aan het totale aantal DN T-cellen ontkennend wordt bepaald, met behulp van een hemocytometer.
- Controleer zuiverheid van DN T-cellen met flowcytometrie door het volgen van deze gating strategie: eerste poort CD45 +, tweede poort TCRαβ +. Uitsluiten CD1d + cellen. Plot CD4 + CD8 + vs DN T-cellen (Figuur 3) te identificeren.
- Vermenigvuldig het totale aantal door het percentage bepaald in reinheid.
Opmerking: Het gebruik van dit protocol resulteert in een bevolking van meer dan 90% zuiver DN T-cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wild-type C57BL / 6 (B6) nier bevat ongeveer 1,5-2,1 x 10 6 mononucleaire cellen per nier. Ongeveer minder dan 10% zijn hematopoïetische CD45 + cellen. Voor de bereiding van nier cellen (KMNC), worden de nieren in kleine stukjes zoals getoond in figuur 1, gevolgd door digestie met 5% collagenase.
Dit wordt gevolgd door het uitvoeren van een dichtheidsgradiënt centrifugatie KMNC laag (Figuur 2, linkerpaneel) verzamelen. KMNC werden vervo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er is steeds meer belangstelling DN T-cellen omdat ze worden betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen zoals auto-immuunziekten, kanker, ent tolerantie en primaire ziekten van de nier, waaronder acute nierschade (AKI), glomerulonefritis 8, 13. Daarom is er behoefte aan een beter inzicht karakteriseren pathofysiologische functies van DN T-cellen. Echter, momenteel is er een gebrek aan inzicht in functie van deze cellen ten opzichte van CD4 en CD8 T-cellen. Een belangrijke reden is gebrek van DN T-...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door NIH PBS (R21 AI095484). Wij danken NHI tetramer kern faciliteit voor CD1d tetrameer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Of gelijkwaardige apparatuur | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Of gelijkwaardige apparatuur | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosfeer gecontroleerde incubator | Fisher Scientific | (37 °C met 5% CO2) | |
| Analytische flow cytometer | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Foetaal bovien serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0,1% natriumazid (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer fosfaat gebufferde saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS kolommen | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotine microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-keten, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 gebiotinyleerd (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 gebiotinyleerd (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC klasse II (I-A b) gebiotinyleerd | BD | 553609 | |
| AutoMACS Loopbuffer - MACS Separatie Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J muizen | Jackson Labs | 000664 | Nieren - Lymfeklieren |
| Petrischaal | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Zuiger | Of gelijkwaardige apparatuur | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Of gelijkwaardige apparatuur |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Of gelijkwaardige apparatuur |
| CD1d α-galcer tetrameer | NHI |
Referenties
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
