Stress korrels (SG) zijn cytoplasmatische RNA korrels die geïnstalleerd ribonucleoproteïnepartikels (RNP), en belangrijk in cellulaire reactie op diverse spanningen. Dynamiek van SG's kunnen in levende cellen worden gevolgd door het visualiseren van de lokalisatie van een gelabeld onderdeel van SG in getransfecteerde primaire cellen na stress.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
SG kan in cellen worden gevisualiseerd door immunokleuring specifieke eiwitcomponenten of polyA + mRNA. SG zeer dynamisch en de studie van hun assemblage en lot is belangrijk om de cellulaire respons op stress te begrijpen. Het tekort in de belangrijkste factoren van de SG's zoals G3BP (RasGAP SH3 domein bindend eiwit) leidt tot defecten in de ontwikkeling bij muizen en veranderingen van het centrale zenuwstelsel. Om de dynamiek van de SG's bestuderen in cellen van een organisme, kan men cultuur primaire cellen en volg de lokalisatie van een getransfecteerde gelabeld onderdeel van SGS. We beschrijven time-lapse experiment om-G3BP1 bevattende SGs in muis embryonale fibroblasten (MEF) observeren. Deze techniek kan ook worden gebruikt om G3BP bevattende SG bestuderen levende neuronen, wat cruciaal zoals onlangs aangetoond dat deze SG gevormd bij het begin van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer. Deze benadering kan worden aangepast aan andere cellulaire lichaam en granule eiwitcomponent en uitgevoerdtransgene dieren, waarbij de levende studie korrels dynamiek bijvoorbeeld bij gebrek aan een specifieke factor van deze korrels.
Inleiding
Stress korrels (SG) niet-membraneuze cytoplasmatische foci gevormd als een beschermende cellulaire reactie op omgevingsstress, zoals verhoogde temperatuur, oxidatieve stress, hypoxie, osmotische schok, UV-bestraling, glucose deprivatie of virale infectie 1. Ze kunnen chemisch worden geïnduceerd door behandeling met verbindingen zoals natriumarseniet, die oxidatieve stress veroorzaakt. SG's accumuleren vastgelopen vertaling gearresteerd boodschapper ribonucleoproteïne (mRNPs) complexen 2, sequestering mRNA's van de translationele machines, en de montage kan worden geactiveerd door de fosforylering van eIF2α (eukaryote initiatie factor 2 α....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures in dit protocol de in strikte naleving van de richtlijnen van de richtlijn Europese Gemeenschap van de Raad van 24 november 1986 (86-609/EEC). Het huis van de muizen in de groep, waardoor voedsel en water ad libitum. Behouden ze in een gecontroleerde omgeving (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% vocht) met een 12 uur: 12 uur licht: donker cyclus (licht aan om 7.00 uur).
1 Cultuur van Muriene primaire cellen:. Muis embryonale fibroblasten (MEF)
- Autoclaaf dunne tang, evenals gebogen tang en dissectieschaar. Bewaren in een steriele container. Gebruik steriele D-PBS (Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Stress granulevorming is belangrijk in de respons van cellen op stress, waardoor een cellulaire adaptatie bij geblokkeerde vertaling, totdat de spanning is verdwenen, geassocieerd met het voorkomen van apoptose. Deze test maakt het mogelijk de SG primaire cellen te bestuderen, door de lokalisatie van SG belangrijkste eiwitbestanddelen (figuur 1). G3BP, een belangrijke factor SG samenstel, aanwezig tamelijk diffuus in het cytoplasma van MEF gekweekte neuronen (Figuur 2A a en c)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische stappen in het protocol betreffen de transfectie en meer in het bijzonder de time lapse overnames, die moeten zorgvuldig worden gevolgd om lager op de cytotoxiciteit.
Kweek van primaire cellen is niet een moeilijke deel, mits steriele omstandigheden worden gehandhaafd en voorzichtigheid is genomen om schade tijdens de dissectie en celdissociatie stappen voorkomen. MEF kan op vroege passages bevroren bewaard. Neuron transfectie met calciumfosfaat is aangetoond goed te werke.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de Montpellier Rio Imaging (MRI)-platform waar de overnames werden uitgevoerd erkennen. Ze bedanken Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot en Virginie Georget voor hun hulp in verschillende delen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door de Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Voorverwarmen op 37 °C |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Nonessential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsine | Gibco | 15096 | |
| Glasbodem B-35 | Greiner | 627860/627861 | Behandeld of niet (behandeld: verhoogt de hechting van adherente cellen) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Voorverwarmen op 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Voorverwarmen op 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Pincet | Biotek | DU-110-A | Zeer dun, uiteinden 0,1 mm (handig om hersenvliezen te verwijderen) |
| Gebogen pincet | Biotek | P-110-BUF | Zeer dun, uiteinden 0,1 mm |
| Kleine schaar | Biotek | CM-85-BS | Kan handig zijn om hippocampus te verwijderen |
| Polyplus transfectie JetPEI reagens | Ozyme | 101-10 | MEFs transfectie, volg het voorwaartse protocol |
| Inverteerbare laserscanning confocale microscoop | Leica | SP5 |
Referenties
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and trans....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
