Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen

Samenvatting

Stress korrels (SG) zijn cytoplasmatische RNA korrels die geïnstalleerd ribonucleoproteïnepartikels (RNP), en belangrijk in cellulaire reactie op diverse spanningen. Dynamiek van SG's kunnen in levende cellen worden gevolgd door het visualiseren van de lokalisatie van een gelabeld onderdeel van SG in getransfecteerde primaire cellen na stress.

Samenvatting

SG kan in cellen worden gevisualiseerd door immunokleuring specifieke eiwitcomponenten of polyA + mRNA. SG zeer dynamisch en de studie van hun assemblage en lot is belangrijk om de cellulaire respons op stress te begrijpen. Het tekort in de belangrijkste factoren van de SG's zoals G3BP (RasGAP SH3 domein bindend eiwit) leidt tot defecten in de ontwikkeling bij muizen en veranderingen van het centrale zenuwstelsel. Om de dynamiek van de SG's bestuderen in cellen van een organisme, kan men cultuur primaire cellen en volg de lokalisatie van een getransfecteerde gelabeld onderdeel van SGS. We beschrijven time-lapse experiment om-G3BP1 bevattende SGs in muis embryonale fibroblasten (MEF) observeren. Deze techniek kan ook worden gebruikt om G3BP bevattende SG bestuderen levende neuronen, wat cruciaal zoals onlangs aangetoond dat deze SG gevormd bij het begin van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer. Deze benadering kan worden aangepast aan andere cellulaire lichaam en granule eiwitcomponent en uitgevoerdtransgene dieren, waarbij de levende studie korrels dynamiek bijvoorbeeld bij gebrek aan een specifieke factor van deze korrels.

Inleiding

Stress korrels (SG) niet-membraneuze cytoplasmatische foci gevormd als een beschermende cellulaire reactie op omgevingsstress, zoals verhoogde temperatuur, oxidatieve stress, hypoxie, osmotische schok, UV-bestraling, glucose deprivatie of virale infectie ^1. Ze kunnen chemisch worden geïnduceerd door behandeling met verbindingen zoals natriumarseniet, die oxidatieve stress veroorzaakt. SG's accumuleren vastgelopen vertaling gearresteerd boodschapper ribonucleoproteïne (mRNPs) complexen ^2, sequestering mRNA's van de translationele machines, en de montage kan worden geactiveerd door de fosforylering van eIF2α (eukaryote initiatie factor 2 α). SG zijn dynamische structuren die componenten wisselen met polysomen en andere granulaten zoals de P-organen. Zij vormen een "triage center" waar mRNA's worden gesorteerd en verwerkt voor een van beide vertalingen, een herstart, degradatie of verpakking in stabiele niet-polysomal mRNPs ^3. De assemblage van de SG's is snel but het is een geleidelijk proces met initiële talrijke kleine aggregaten die samenvloeien tot grotere korrels. Het gebruik van chemische inhibitoren die verstoren of microtubuli stabiliseren blijkt dat het microtubule netwerk vereist SG dynamiek inbegrip van assemblage, coalescentie en demontage processen.

De dynamische samenstel van SG wordt ook bevorderd door aggregatie van specifieke RNA-bindende eiwitten (RNA-BP) zoals TIA-1 (T-cel intern antigeen-1) en TIAR (TIA-1 verwant eiwit), die kunnen dimeriseren zijn en het bevorderen van polysome demontage en de routering van mRNA's in SG ^4. G3BP (RasGAP SH3 domein bindend eiwit) is zo'n RNA-BP dat lokaliseert SGS wanneer cellen worden benadrukt met arseniet en hoge temperatuur, en overexpressie van gedefosforyleerd G3BP kan SGs assemblage ⁵ induceren.

G3BP is een evolutionair geconserveerd RNA-BP dat in eerste instantie werd gekenmerkt door de interactie met een Ras-GTPase activerend eiwit (RasGAP p120 ^6); maar deze interactie is onlangs revisited ^7. De familie G3BP omvat twee leden bij zoogdieren, G3BP1 (hierna G3BP) en G3BP2 ^8. Beide eiwitten colocalize in SG, wanneer cellen worden blootgesteld aan spanning ^9. G3BPs omvatten een N-eindstandig domein NTf2 voorgesteld hun lokalisatie en oligomerisatie, gevolgd door proline rijke (PxxP) motieven beïnvloeden, dan C-eindstandige motieven geassocieerd met RNA binding: de canonieke RNA-herkenningsmotief (RRM) met behouden RNP1 en RNP2 motieven , gevolgd door een rijke box arginine-glycine (RGG). Interessant is dat de analyse van verschillende delen van het eiwit door het construeren verschillende domeinen gefuseerd met EGFP bleek dat de NTf2-achtige domein en de RNA-bindende domein zijn de meest efficiënte gerekruteerd SG, Dit suggereert dat de eigenschappen van dimerisatie en RNA binding in de assemblage van SGS. Diverse modellen hebben verschillende functies van G3BP eiwitten bleek in vitro ^10-13.Verstoring van G3BP in muizen hebben het belang van dit eiwit in de ontwikkeling groei en overleving ^14, evenals een belangrijke rol G3BP in het centrale zenuwstelsel (CZS), gekenmerkt door ataxie en gebreken in ruimtelijk werkgeheugen ^15. G3BP deficiëntie leidt tot een gewijzigde neuronale plasticiteit en calcium homeostase, tot oprichting van een rechtstreeks verband tussen SG vorming en neurodegeneratieve ziekten ^15. Het is dus belangrijk om de dynamiek van SG in primaire cellen zoals neuronen te bestuderen.

Dit protocol biedt een eenvoudige manier om de assemblage van-G3BP1 bevattende SGs observeren in primaire cellen onder arseniet behandeling. Het kan worden gebruikt om SG montage bestuderen onder verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld verschillende spanningen. Het kan ook worden aangepast aan andere korrels of andere bestanddelen van SG. Inderdaad, dit protocol gericht op G3BP1, maar er zijn andere stress granulaat merker TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (Fragiele X mentale retardatie syndroom eiwit) ^16, TDP-43 (transactieve reactie DNA-bindend eiwit 43) ¹⁷ of Staufen ^18. In het bijzonder eiwitten zoals TIA-1 / R zijn zoals G3BP, kiemvormende RNA-bindende eiwitten die SG samenstel kan induceren wanneer tot overexpressie gebracht, hebben de diverse gevormde SG kunnen verschillen in functie, regulering en geassocieerde transcripten. Transfectie van fluorofoor gelabeld versie van een van deze belangrijke componenten of kiemvormers van SG's kunnen worden uitgevoerd om bepaalde beeld SGs assemblage en dynamiek.

Protocol

Alle dierlijke procedures in dit protocol de in strikte naleving van de richtlijnen van de richtlijn Europese Gemeenschap van de Raad van 24 november 1986 (86-609/EEC). Het huis van de muizen in de groep, waardoor voedsel en water ad libitum. Behouden ze in een gecontroleerde omgeving (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% vocht) met een 12 uur: 12 uur licht: donker cyclus (licht aan om 7.00 uur).

1 Cultuur van Muriene primaire cellen:. Muis embryonale fibroblasten (MEF)

1. Autoclaaf dunne tang, evenals gebogen tang en dissectieschaar. Bewaren in een steriele container. Gebruik steriele D-PBS (Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing). Bereid volledige MEF medium: Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) / F12 gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FBS), 1 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, en 0,5 mM 2-mercaptoethanol en warm bij 37 ° C.
2. Euthanaseren een zwangere muis (13,5 dagen na de coïtus (dpc)) Door cervicale dislocatie. Verwijder de baarmoederhoorns van de muis ontsmet met 90% EtOH. Onder een steriele en schone kap, plaats de hoorns met de embryo's in 37 ° C voorverwarmde D-PBS. Open de horens, plaats de embryo's in een 100 mm steriele plastic petrischaal, schoon ze uit de navelstreng materiaal en was ze in warm D-PBS om bloed overtollige te verwijderen. Onder een verrekijker, verwijder de embryo's ledematen, de inwendige organen en het bovenste deel van het hoofd met de hersenen.
3. In een nieuwe petrischaal, gehakt de embryo's in kleine stukjes met een steriele chirurgische mes of schaar (tenminste gedurende 1 min). In het geval van embryo's van verschillende genotypen, wees voorzichtig om elk embryo in individuele petrischaaltjes zetten en houden de staart of de bovenste kop voor genotypering.
4. Bedek het embryo met 1 x trypsine-EDTA (0,25% trypsine, 1 mM EDTA). Incubeer gedurende 30 min tot 1 uur in een 37 ° C incubator. Voeg 10 ml compleetMEF medium tot trypsine reactie te stoppen. Pipet op en neer om alle aggregaten te verwijderen. Laat zitten de celsuspensie in een 50 ml buisje (gevuld met compleet medium) gedurende 10 min, en het supernatant gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in compleet medium (6 ml voor 1 embryo). Levensvatbare cellen met kernen te tellen met behulp van trypan blauw (Ongeveer 5 x 10 ⁶ cellen kunnen worden verwacht van een embryo). Plaat 3 ml per 60 mm petrischaal.
5. Verander het medium de volgende dag en laat de cellen groeien totdat de gerechten worden confluent. Veel celtypen te zien, maar alleen fibroblasten zal subcultuur overleven.
6. Splits de cellen en hen in staat stellen om te groeien in 35 mm schalen met glazen bodem (belangrijk voor time-lapse experiment), tot 50-70% confluentie voor de transfectie. Test voor Mycoplasma en muis ziekteverwekkers.

2. Cultuurdaptations in de zaak van Neuronen

1. De dag voor de cultuur, vacht 35 mm glazen bodem petrischaaltjes met poly-L-lysine (200 pl van 0,1 mg / ml) onder een steriele en schone kap, en laat het een nacht.
2. De volgende morgen, spoelen met steriel zuiver water, tweemaal gedurende 5 min en eenmaal gedurende 45 minuten tot 1 uur. Vervang 2 ml DMEM plus 10% FBS medium en in een 37 ° C incubator houden.
3. Ontleden embryo's in 18.5 dpc. Onder een steriele en schone kap, plaats de hoorns met de embryo's in koude steriele HBSS (Hank's gebalanceerde zoutoplossing) in 100 mm petrischaal. Neonatale pups kan ook in plaats van embryo's worden gebruikt om de levensduur van de dam behouden en in staat om meer nageslacht, vooral in het geval van transgene dieren die moeilijk te verkrijgen zijn. In individuele petrischaaltjes, nemen elk embryo of pasgeboren en snijd het hoofd met een schaar. Houd het hoofd door het invoegen van gebogen pincet in de ogen, snijd de huid en open voorzichtig de zachte schedel van de achterkantvan de kop tot de ogen, aan elke kant van de weg. Snijd de oogzenuwen en de hersenstam, verwijder de hersenen, en zet het in een nieuwe petrischaal met HBSS. Onder een stereoscoop, verwijder alle hersenvliezen met twee dunne tang. Scheid de hippocampus, de cortex of een ander deel van de hersenen afhankelijk van de structuur te bestuderen.
4. Dompel de ontleed hersenstructuur in 4,5 ml koud HBSS eerder bereid in 15 ml buizen en blijf op ijs tot digestie met trypsine. Voeg 0,5 ml 2,5% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min tot 20 min. Spoel de trypsine 3x met HBSS, uiterst voorzichtig om de verteerde hersendelen niet weg.
5. Resuspendeer in 500 pl (hippocampus) 1 ml (cortex) DMEM met 10% FBS en pipet op en neer meerdere malen met een 1 ml micropipet met een 1 ml tip, vervolgens met 1 ml plus 200 ul tips, totdat er geen zichtbare aggregaat.
6. Verdeel 100-200 ul van celsuspensie aan elk 35 mm glas bottom schaaltje met DMEM met 10% FBS en laat de neuronen hechten bij 37 ° C gedurende ten minste 3 uur. Vervangen door voorverwarmd neuron compleet medium (Neurobasal medium aangevuld met 250 uM L-glutamine en NS21, bereid zoals beschreven in Chen et al.. ¹⁹⁾ en verlaat deze bij 37 ° C neuronale groei mogelijk. Transfecteren de neuronen bij 5 tot 14 dagen in vitro (div) (de efficiëntie van transfectie hoger na een paar div maar synaptische verbindingen beter vastgesteld van 7-10 div).

3. Transfectie van EGFP-G3BP1 Construct

Transfecteren van de cellen met een vector die het cDNA van het eiwit van interesse (een onderdeel van SG) gefuseerd aan een fluorescente merker (GFP, YFP, enz.), met 3 ug van gezuiverd plasmide per 35 mm schaal.

1. Transfecteren de MEF met een commerciële methode, volgens het protocol van de fabrikant (zie tabel van materialen / Reagentia).
2. Transfecteren de neuronen met calciumfosfaat methode aangepast van Xia et al. ²⁰ kort.:
   1. Bereid de oplossingen: DMEM-wash: DMEM met 25 mM KCl; transfectieoplossing: DMEM-wash bestaande uit 1x DMKY (HEPES 5 mM, _MgCl2 10 mM, fenol rood); en shock oplossing: HeBS 1x, DMKY 1x, en DMSO 2% (v / v); en houd ze bij 37 ° C.
   2. Verwijder het papier uit de neuronen, filtraat, en houd het bij 37 ° C. Wassen met DMEM-wash vervolgens te vervangen door transfectiemedium en houden bij 37 ° C tijdens de voorbereiding van de calciumfosfaat-plasmide-DNA neerslagen.
   3. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, voegen (in deze volgorde) Braun water (eindvolume 50 pl), 5 ul 2,5 M _CaCl2, en 3 ug plasmide DNA. Laat dit mengsel op 50 pi 2x HeBS reeds een ronde bodem polypropyleen buis geïntroduceerd. Meng de buis door de rotatie samen met de dropping. Laat het neerslag vorm bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   4. Voeg de precipitate druppelsgewijs op de neuronen en verlaat deze bij 37 ° C gedurende 30 tot 50 minuten.
   5. Vervang shock oplossing gedurende 1 minuut en spoel na met DMEM-wash en tenslotte opnieuw het geconditioneerd medium. Laat de cellen bij 37 ° C.

4. Visualisatie van G3BP bevattende SG's Vergadering en Dynamics

1. Vervang het medium van de cellen die fenolrood bevat met fenolrood-vrij medium.
2. Gebruik een confocale microscoop uitgerust met fluorescentie voor de acquisities. Zet de microscoop systemen: kwiklamp, computer, en lasers. Warmen de kamer tot 37 ° C ten minste 20 minuten vóór het begin van de acquisities.
3. De overexpressie van G3BP induceert de spontane vorming van een type SGS. De cellen kunnen dus worden waargenomen voor de montage van SG 24 uur direct na de transfectie zonder stressinductie. Als alternatief, kan stress worden veroorzaakt aan de montage van SG's verder te induceren. Voeg 0,5 mM natriumarseniet en stert de acquisitie direct na de toevoeging van de verbinding (granules goed gevormd binnen 1 uur).
4. Olie toe te voegen aan de immersie-objectief (gebruik 40X of 63X doelstellingen) en installeer de petrischaal op het streven in de aangepaste 35 mm microscoop houder, gestabiliseerd op het podium houder. Controleer of het gerecht is plat anders de acquisities zal worden gewijzigd. Zet de fluorescentie licht overeenkomstig de desbetreffende fluorophore en visualiseren getransfecteerde cellen. Schakel fluorescentie eens een cel van belang is in het veld in om te bleken en cytotoxiciteit te minimaliseren.
5. In het "verwerven tabblad", selecteer de lasers, afhankelijk van de golflengte van de tag fluorofoor (488 nm in ons protocol waarin EGFP-tagged G3BP gebruikt) en selecteer de aangepaste emissie lengte voor de PMT (fotomultiplicatorbuis). Stel het laservermogen (gewoonlijk niet meer dan 10%) om ruis en oververzadiging en toxiciteit te minimaliseren en stel de versterking en offset signaal wijzigen ruisverhouding.Scan snel (1000 Hz) om de duur van de laser expositie (lijn gemiddeld 2, kader gemiddeld 1) te minimaliseren. Indien gewenst, de parameters voor de Z-stack kunnen de afbeelding in 3D (een Z stap 1 urn is gewoonlijk goed met cellen) te reconstrueren. Bepaal het interval tussen elke verwerving: kleiner tussenpozen, tot een coherente film te vinden, maar kan fotobleken en toxiciteit (een interval van 20 seconden werd gebruikt in de experimenten beschreven) induceren. Duur van de totale aankoopprijs kan variëren afhankelijk van het type stress. Veel-G3BP bevattende SGs zeer snel gevormd onder arseniet behandeling en goed zichtbaar zijn na 1 uur van de behandeling: in dat geval kiest u snel de cellen om te filmen en start de acquisities direct na de stress, met een totale duur van acquisities van 15 - 20 min ruim voldoende om de assemblage van verschillende SG's te observeren.
6. Sla de foto's en reconstrueren de stacks en film met ImageJ software.

Resultaten

Stress granulevorming is belangrijk in de respons van cellen op stress, waardoor een cellulaire adaptatie bij geblokkeerde vertaling, totdat de spanning is verdwenen, geassocieerd met het voorkomen van apoptose. Deze test maakt het mogelijk de SG primaire cellen te bestuderen, door de lokalisatie van SG belangrijkste eiwitbestanddelen (figuur 1). G3BP, een belangrijke factor SG samenstel, aanwezig tamelijk diffuus in het cytoplasma van MEF gekweekte neuronen (Figuur 2A a en c)

Discussie

De meest kritische stappen in het protocol betreffen de transfectie en meer in het bijzonder de time lapse overnames, die moeten zorgvuldig worden gevolgd om lager op de cytotoxiciteit.

Kweek van primaire cellen is niet een moeilijke deel, mits steriele omstandigheden worden gehandhaafd en voorzichtigheid is genomen om schade tijdens de dissectie en celdissociatie stappen voorkomen. MEF kan op vroege passages bevroren bewaard. Neuron transfectie met calciumfosfaat is aangetoond goed te werke...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM/F12	Gibco	21331	Voorverwarmen op 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsine	Gibco	15096
Glasbodem B-35	Greiner	627860/627861	Behandeld of niet (behandeld: verhoogt de hechting van adherente cellen)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Voorverwarmen op 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Voorverwarmen op 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Pincet	Biotek	DU-110-A	Zeer dun, uiteinden 0,1 mm (handig om hersenvliezen te verwijderen)
Gebogen pincet	Biotek	P-110-BUF	Zeer dun, uiteinden 0,1 mm
Kleine schaar	Biotek	CM-85-BS	Kan handig zijn om hippocampus te verwijderen
Polyplus transfectie JetPEI reagens	Ozyme	101-10	MEFs transfectie, volg het voorwaartse protocol
Inverteerbare laserscanning confocale microscoop	Leica	SP5