Het meten van de effecten van bacteriën op C. Elegans Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Summary

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme zijn Caenorhabditis elegans Aan potentieel schadelijke stoffen uit het milieu, zoals die geproduceerd door pathogene bacteriën.

Abstract

C. elegans eileg gedrag wordt beïnvloed door omgevingsfactoren zoals osmolariteit ¹ en trillingen ^2. Bij totale afwezigheid van voedsel C. elegans ook ophouden eileg en behouden van bevruchte eieren in hun baarmoeder ^3. Echter, het effect van verschillende voedingsbronnen name pathogene bacteriën en bijzonder Enterococcus faecalis, on leg gedrag niet goed gekarakteriseerd. De ei-in-worm (EIW) test is een nuttig hulpmiddel om de effecten van verschillende soorten bacteriën kwantificeren, in casu E. faecalis, on leg gedrag.

EIW assays omvatten het tellen van het aantal eieren in de baarmoeder van C. behouden elegans ^4. De EIW bepaling omvat bleken opgevoerd, zwangere volwassen C. elegans om de cuticula te verwijderen en scheiden de ingehouden eieren van het dier. Voorafgaand aan bleken, zijn wormen worden blootgesteld aan bacteriën (of een soort van milieu-cue) Voor een vaste periode van tijd. Na bleken, is erg gemakkelijk in staat om het aantal in de baarmoeder van de wormen behouden tellen van eieren. In deze assay, een kwantificeerbare toename ei retentie na E. faecalis belichting kan gemakkelijk worden gemeten. De EIW assay is een gedrags-test die kan worden gebruikt om te screenen op potentieel pathogene bacteriën en de aanwezigheid van giftige stoffen. Daarnaast kan de EIW assay een middel voor het screenen op geneesmiddelen die neurotransmitter beïnvloeden signalering sinds leg gedrag wordt gemoduleerd door neurotransmitters als serotonine en acetylcholine ^5-9 zijn.

Introduction

Caenorhabditis elegans, een microscopische, vrij levende rondworm, een modelorganisme traditioneel gebruikt ontwikkelings-en cel signalerende processen, omdat de transparante anatomie, goed gekarakteriseerde ontwikkeling volledig gesequenced genoom korte generatietijd-tijd en genetische homologie onderzoek bij de mens . Recenter C. elegans is een modelorganisme op het gebied van milieu-toxicologie en aangeboren immuniteit ^{10, 11.}

Deze zelfbemestende hermafrodiete wormen worden geslachtsrijp binnen twee tot drie dagen van het uitbroeden van het ei. Tijdens zijn levenscyclus, C. elegans doorloopt vier larvale stadia (L1-L4), vóór het bereiken van de volwassenheid. Een geïsoleerde hermafrodiet kan produceren, gemiddeld, 300 nakomelingen binnen drie dagen van de piek vruchtbaarheid. In reproductively mature C. elegans hermafrodieten, worden bevruchte eitjes in de baarmoeder behouden voor enkele uren voordat ze gelegd. Denormale aantal eieren opgeslagen in de baarmoeder op een bepaald moment (tijdens de piek vruchtbaarheid) is tussen de tien en vijftien ^12. Het aantal eieren in de baarmoeder is een functie van zowel de snelheid van de eierproductie en de snelheid van de eileg. Bevruchte eitjes worden uitgestoten uit de baarmoeder van de samentrekking van zestien vulval spieren rond de opening van de vulva ^13. Hermafrodiet-specifieke motorneurons (HSN) en VC motorneurons synaps op vulval spieren die samentrekken van de spieren en dus eierleggende gedrag ^5,7,13,14. Uitwijzing van eieren in de baarmoeder optreedt als gevolg van gecoördineerde aktiviteit van neuronen en spieren.

Lab culturen van C. elegans zijn meestal opgegroeid op een dieet van pathogene Escherichia coli OP50. In de natuurlijke omgeving, C. elegans in contact komen met een verscheidenheid van voedselbronnen, zoals pathogene bacteriën, die potentieel schadelijke. Bij blootstelling aan schadelijke stoffen inmilieu, C. elegans behouden eieren totdat het klimaat gunstiger wordt. Vermoedelijk dit ei retentie is een poging om hun nageslacht te beschermen.

In dit ei in worm (EIW) assay, C. elegans worden blootgesteld aan de potentieel pathogene bacteriën, Enterococcus faecalis, die in het milieu. Blootstelling aan pathogene vormen van E. faecalis kan blijvende darminfectie en zelfs de dood veroorzaken in C. elegans ^15. Blootstelling aan andere vormen van pathogene bacteriën is aangetoond ei retentie ^16,17 beïnvloeden, maar het effect is niet gekwantificeerd. Bovendien, het effect van licht pathogene stammen van E. faecalis, heeft stammen die niet direct dodelijk, op eileg gedrag niet onderzocht.

EIW assays omvatten het tellen van het aantal eieren in de baarmoeder van C. behouden elegans ^4. Hoewel C. eleganstransparant zijn, kunnen eieren ophopen in de baarmoeder moeilijk te kwantificeren in een intact dier. De EIW bepaling omvat bleken zwangere volwassen C. elegans die werden blootgesteld aan bacteriën voor een vaste periode van tijd. De bleekoplossing lost de buitenste cuticula verlaten de eieren achteren. De eieren zijn refractieve om de effecten van bleekmiddel door de aanwezigheid van een beschermende eierschaal. Na bleken, is erg gemakkelijk in staat om het aantal eieren vrijgemaakt uit de baarmoeder van de wormen na bleken tellen.

De beschreven test is een eenvoudige, goedkope en snelle methode om het aantal eieren in de baarmoeder te kwantificeren in een keer, en daarmee de effecten van E. kwantificeren faecalis op ei-retentie. Deze test kan worden gebruikt om het effect van andere soorten bacteriën, giftige stoffen of geneesmiddelen op ei retentie kwantificeren. Deze test heeft ook het potentieel om te worden gebruikt als scherm voor bacteriële pathogeniciteit.

Protocol

1) Voorbereiding van Nematoden Groei Media (NGM)

1. Tot 50 platen te maken, voeg 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, en 1,25 g pepton een 1 Lflask.
2. Voeg 487,5 ml dH ₂ O aan kolf. Roer voorzichtig te mengen en te dekken opening van kolf met een stuk aluminiumfolie.
3. Steriliseren van de oplossing in de autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 min).
4. Laat de oplossing in een waterbad te koelen tot 45 ° C.
5. Aan de oplossing, voeg de volgende in volgorde: 500 ul cholesterol van een 5 mg / ml stockoplossing (opgelost in ethanol), 500 pi 1 M _CaCl2, 500 pi 1 M _MgSO4, en 12,5 ml KPO ₄ buffer (54.15 g KH _{2PO 4} en 17,8 g K ₂ HPO ₄ in 500 ml dH ₂ O) zoals beschreven in ^18.
6. Met steriele pipetten, voeg 10 ml agar oplossing voor elke 60 mm polystyreen petrischaal. Laat het materiaal stollen bij kamertemperatuur overnechts.

2) Bereiding van B Broth E. coli Media

1. Om vijf 100 ml culturen te maken, voeg 5,0 g Bacto Trypton, 2,5 g gistextract, 5,0 g NaCl in een bekerglas.
2. Voeg steriel gedestilleerd water tot een eindvolume van 500 ml. Verwarm de oplossing op een hete plaat, al roerend, totdat de opgeloste stoffen zijn opgelost.
3. Giet 100 ml B bouillon in vijf glazen flessen (minimaal volume 200 ml).
4. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
5. Laat B bouillon afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik.

3) Zaaien C. elegans Onderhoud Plates

1. Nadat men NGM platen drogen bij kamertemperatuur gedurende ten minste een week Inoculeer een 100 ml B bouillonkweek met enkele kolonies van E. coli (OP50).
2. Groeien E. coli cultuur bij 37 ° C gedurende de nacht.
3. Pipet een-twee druppels (ongeveer 10081; l) van OP50 cultuur op het midden van elk NGM plaat. Platen zijn meestal gestapeld deksel naar boven. Bij het pipetteren (zaaien), eerst pipetteren de cultuur op de plaat aan de onderzijde van de stapel. Werk je weg omhoog elke stapel. Probeer de platen bewegen na het uitzaaien, omdat het belangrijk is dat de cultuur niet te dicht bij de randen van de plaat te krijgen.
4. Laat de gezaaide platen gedroogd bij kamertemperatuur gedurende ten minste een week voor gebruik.
5. Gezaaide platen worden opgeslagen (omgekeerde) in verzegelde plastic containers op kamertemperatuur.

4) Behoud C. elegans Stammen

1. Te onderhouden weldoorvoede C. elegans voorraden, gebruik dan een worm kiezen om drie L4S of zwangere volwassenen om de 3-4 dagen verhuizen naar een nieuwe, zonder zaadjes NGM plaat.
2. Store platen (omgekeerde) bij voorkeur in een incubator bij 15 - 22 ° C Culturen in de beschreven testen werden bij 20 ° C. C. opgeslagen elegans ontwikkeling temperatuurafhankelijk is. Zoals maintenance temperatuur stijgt, de tijd tussen de ontwikkelingsstadia afneemt.

5) Bereiding van Tryptic Soy Agar (TSA) E. faecalis Cultuur Media

1. Tot 50 platen te maken, meet 500 ml steriel, gedestilleerd water in een kolf en breng aan de kook, al roerend, op een kookplaat.
2. Voeg 20 g poedervormig TSA agar aan kolf en laat oplossing te ontbinden.
3. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
4. Laat de oplossing in een waterbad te koelen tot 45 ° C.
5. Met steriele pipetten, voeg 10 ml agar oplossing voor elke 60 mm polystyreen petrischaal. Laat het materiaal stollen bij kamertemperatuur gedurende een nacht.

6) Bereiding van Tryptic Soy Broth (TSB) E. faecalis Cultuur Media

1. Tot 250 cultuurbuizen maken, meet 500 ml steriel, gedestilleerd water in een kolf en warm op een kookplaat onder roeren.
2. Voeg 15 g TSB agar poeder aan de kolf en laat het poeder op te lossen.
3. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
4. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens pipet 2 ml in steriele 5 ml reageerbuizen.

7) Voorbereiding van Brain Heart Infusion (BHI) Media, met streptomycine, voor E. faecalis Cultuur

1. Meet 500 ml steriel, gedestilleerd water in een kolf en breng aan de kook, al roerend, op een kookplaat.
2. Voeg 26 g BHI medium aan de kolf en laat de oplossing op te lossen.
3. Steriliseren van de oplossingen in autoclaaf bij standaard condities (121 psi, 120 ° C, 20 minuten).
4. Laat de oplossing afkoelen tot 45 C in een waterbad.
5. Met behulp van steriele techniek wordt 0,5 ml van een 10 mg / ml streptomycine stockoplossing en swirl te mengen.
6. Voeg 10 ml van de oplossing in elk 60 mm polystyreen Petri dish.
7. toestaan ​​media stollen bij kamertemperatuur gedurende een nacht. Store platen (omgekeerde) bij 4 ° C tot een paar uur voor het gebruik.

8) Handhaving E. faecalis stammen

1. Naar E. behouden faecalis voorraden, gebruik dan een steriele lus om streak individuele kolonies op afzonderlijke tryptische soja-agar (TSA) platen.
2. Groeien kweken bij 37 ° C geïncubeerd. WINKEL platen (geïnverteerd) in een gesloten zak of doos bij kamertemperatuur gedurende enkele weken.

9) Het voorbereiden E. faecalis Platen voor EIW Assay

1. Inoculeren een 2 ml TSB cultuur met een kolonie van E. faecalis en incubeer overnacht bij 37 ° C.
2. Pipetteer 20 ul E. faecalis cultuur op het midden van een voorbereide BHI-streptomycine plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C.

10) Het voorbereiden E. coli Platen voor EIW Assay (Controle Plates)

1. Inoculeren een 100 ml B-broth cultuur met een kolonie van E. coli OP50 en incubeer overnacht bij 37 ° C
2. Pipetteer 20 ul van de OP50 cultuur op het midden van een ongeplaatste NGM plaat en laat de geplaatste borden te drogen bij kamertemperatuur gedurende de nacht.

11) Ei in Worm Assay

1. Pick 15 - 20 geënsceneerde-L4 C. elegans (Figuur 1) op het midden van een grasveld van bacteriën op een voorbereide BHI-Strep-E. faecalis plaat. Wees voorzichtig niet te veel OP50 over te dragen aan de BHI plaat. Kies hetzelfde aantal L4S een controle NGM-OP50 plaat.
2. Incubeer de platen gedurende 40 uur bij 20 ° C.
3. Bereid 20% bleekwater oplossing. Meng een commercieel bleekmiddel (6,0% natriumhypochloriet) met het juiste volume gedestilleerd water.
4. Voeg 10 ul druppels bleekwater oplossing voor tien verschillende locaties op een plastic deksel (van een worm of bacteriële plaat).
5. Met behulp van een worm pick, overdracht een worm in elk bleekmiddel druppel. Zwenk de punt van dekies in het bleekmiddel druppel te zorgen dat de worm heeft het einde van de oogst (te bevestigen door het bekijken van de druppel onder een dissectie microscoop) afgewassen.
6. Laat de cuticula te ontbinden gedurende ongeveer 10 minuten of totdat de wormen openbarsten, het verdrijven van de eieren (figuur 2). Wees voorzichtig niet om eieren te brengen van de plaat.
7. Met behulp van een microscoop ontleden, tel de eieren in elke druppel van bleekwater.

Results

Deze test maakt het mogelijk om het aantal behouden eieren kwantificeren binnen C. elegans na blootstelling aan E. faecalis. L4 opgevoerd wormen (gekenmerkt door transparante open ruimte boven de vulva, figuur 1) werden blootgesteld aan E. faecalis door volwassenheid. Na veertig uur van blootstelling aan E. faecalis, bleken uitgevoerd. Aangezien de cuticula gedesintegreerd in het bleekmiddel druppeltje, de eieren duidelijker werd (Figuur 2). Het aanta...

Discussion

De meest kritische stappen in het succesvol uitvoeren van deze test zijn: 1) met goed gevoede voorraden C. elegans, 2) het kweken van enkele soorten bacteriën op de testplaat, 3) de nauwkeurige identificatie van geënsceneerde L4 wormen voor blootstelling aan E. faecalis, 4) het houden van de blootstelling tijd om E. faecalis consistent in alle proeven en 5) bleken de tijd mag niet meer dan tien minuten voor ei desintegratie te voorkomen.

Voor deze test is het belan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion gedehydrateerd medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2-stam	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Kweekplaten voor C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Kweekplaten voor E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis stammen			verstrekt door J. Middleton. Alle isolaten werden bevestigd als enterokokken
door observatie van groei op enterococcosel agar (BBL) en in 6% NaCl-bouillon;
alle stammen groeiden bij 44,5 ºC en waren katalase-negatief en hydrolyseerden esculin. Een vereenvoudigde dichotome sleutel op basis van pigmentatie en fermentatiereacties voor zes suikers (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose en sorbitol) maakte vermoedelijke identificatie van alle E. faecalis stammen mogelijk (Efs mist pigmentatie en is arabinose, MGP en sorbose-negatief en sorbitol, mannitol en ribose-positief). Alle vermoedelijke Efs-stammen werden bevestigd met behulp van het API 20 STREP-systeem (Biomerieux).
Microscoop	Motic	SMZ 168B	elke microscoop met doorgelaten verlichting en 50X vergroting zou voldoende moeten zijn
Streptomycinesulfaat	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Gistextract	Acros	61180-1000