Utero-eileiders Embryo Transfer en vasectomie in het muismodel

Samenvatting

Utero-eileiders embryo transfer maakt gebruik van de utero-eileiders splitsing als een belemmering voor het embryo uitstroom die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de baarmoeder overdracht te voorkomen. Vasectomized mannetjes zijn verplicht om pseudozwanger ontvangers krijgen voor embryotransplantatie. Beide technieken worden besproken.

Samenvatting

De overdracht van implantatie embryo's een vrouwelijke surrogaat is een verplichte stap voor de productie van genetisch gemodificeerde muizen of onderzoeken de effecten van epigenetische veranderingen ontstaan ​​tijdens de pre-implantatie ontwikkeling op latere foetale en volwassen gezondheid. Het gebruik van een effectieve en consistente embryo transfer techniek is cruciaal voor het genereren van genetisch gemodificeerde dieren verbeteren en het effect van verschillende behandelingen inplantingstarieven en overleving termijn bepalen. Embryo's in het blastocyst stadium worden meestal overgedragen door baarmoeder overdracht, het uitvoeren van een lek in de baarmoederwand aan de embryomanipulatie pipet introduceren. De opening uitgevoerd in de baarmoeder niet gesloten nadat de pipet is ingetrokken en de embryo kan uitstroom naar de buikholte door de positieve druk van de baarmoeder. De punctie kan produceren ook een bloeding die implantatie schaadt, blokkeert de overdracht pipet en van invloed kunnen embryo development, vooral wanneer embryo's zonder zona worden overgedragen. Bijgevolg, deze techniek resulteert vaak in zeer variabel en algehele lage embryo overleving. Het vermijden van deze negatieve effecten, baarmoeder-eileiders embryotransplantatie profiteren van de utero-eileiders splitsing als een natuurlijke barrière die embryo uitstroom belemmert en te voorkomen dat de punctie van de baarmoederwand. Vasectomized mannetjes zijn vereist voor het verkrijgen van pseudo-ontvangers. Een techniek om vasectomie uitvoeren wordt beschreven als een aanvulling op de utero-eileiders embryo transfer.

Inleiding

Embryo overdracht is waarschijnlijk de meest voorkomende chirurgische ingreep in het muismodel. Deze techniek is essentieel om nakomelingen te verkrijgen van embryo's die in vitro manipulatie technieken en derhalve een noodzakelijke stap voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde modellen van pronucleaire injectie, lentivirale transductie of chimeer vorming. Bovendien, de techniek kan de studie van de ontwikkeling van diverse effecten beledigingen die tijdens pre-implantatie ontwikkeling. Het gebruik van kunstmatige voortplantingstechnieken ¹ of blootstelling aan abnormale concentraties van verschillende stoffen of metabolieten ^mei....

Protocol

Alle dierproeven werden door de Beltsville Area Animal Care en gebruik Comites (BAACUC 11-015) goedgekeurd volgens USDA Animal Care en gebruik Guidelines.

1. Anesthesie en analgesie (Gemeenschappelijk voor beide Chirurgische ingrepen)

1. Weeg de muis en plaats de volgende anesthetica en analgetica in twee 1 ml spuiten met 27 G naalden:
   1. Ketamine (0,1 mg / g: 0,01 ml / g van een 10 mg / ml oplossing) en xylazine (0,01 mg / g: 0,005 ml / g van een 2 mg / ml oplossing).
   2. Buprenorfine (0,1 ug / g: 0,01 ml van een 0,01 mg / ml oplossing).
2. Immobiliseren de muis door ....

Resultaten

Utero-eileiders embryo transfer biedt een middel om embryo's over te dragen aan de baarmoeder vermijden van een aantal van de complicaties verbonden aan de baarmoeder embryo transfer ^2,9,10. In tabel 1 tonen we enkele representatieve resultaten ons verkregen overbrengen CD1 blastocysten blootgesteld aan verschillende manipulaties CD1 ontvangers volgens de beschreven protocol. De term overleving (% van embryo resulteert in een pup) of overleving E15 (bij lentivirus blootgesteld) is gelijk .......

Discussie

Vasectomie is een relatief ongecompliceerd chirurgische techniek die grote moeilijkheden geen sprake. Bij het opschonen met povidonjood en ethanol ervoor te zorgen dat de laatste wasbeurt (met ethanol) verwijdert povidonjood, omdat het het buikvlies kan irriteren. De toegang tot zaadleider kan ook worden bereikt door het scrotum of het uitvoeren van een transversale incisie in de buik ^8. Scrotum incisie is aanbevolen om buikinsnijding transversale te wijten aan de relatief kleinere incisie nodig is e.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	Te bestellen door een erkende dierenarts.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	Te bestellen door een erkende dierenarts.
Buprenorfine	Generic	NDC 400-42-010-01	Te bestellen door een erkende dierenarts.
Oogzalf	Novartis	Genteal
Antibioticum	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Toegevoegd aan drinkwater (0,3 mg/ml amoxicillinetrihydraat en 0,075 mg/ml kaliumclavulanaat). Voeg 1,5 ml van de gereconstitueerde 15 ml fles toe aan 250 ml water.
Versnipperde tang voor dressing	ROBOZ	RS-8120	Elke middelgrote chirurgische rechte tang van staal zal werken.
Microdissectietang met gekartelde tangen	ROBOZ	RS-5137	Deze zijn gebogen in een hoek van 90º. Rechte tangen kunnen worden gebruikt indien gewenst.
Licht gebogen microdissectietang	ROBOZ	RS-5136	Dit model is bijzonder nuttig om de eileider vast te houden.
Schaar	ROBOZ	RS-5880	Elke reguliere chirurgische rechte schaar van staal is geschikt.
27 G naalden	Beckton-Dickinson	305136	Kleinere naalden (30 G) kunnen ook worden gebruikt. 25 G kan een beetje te groot zijn.
Clipapplicateur	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clipverwijderaar	MiKRon	7637	Twee paar tangen (ROBOZ RS-8160) kunnen worden gebruikt in plaats daarvan.
Naaldhouder voor hechtdraad	ROBOZ	RS-7820
Hechtdraad	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Kan worden vervangen door elke 4-0 tot 6-0 absorbeerbare hechtdraad met een smalle gebogen naald.
Glas capillairen	VWR	100 ul gekalibreerde pipetten 53432-921	Het bevat een mondspiratiesysteem dat alleen een 0,22 µm filter in de slang vereist om klaar voor gebruik te zijn. Meer informatie is verkrijgbaar in Nagy et al.8
Brander	KISAG AG	Typ 2002	Gasgestuurde brander, kan worden opgeladen met Kigas (CH-4512, van dezelfde leverancier). Alcoholbranders mogen ook worden gebruikt, maar gas zorgt voor een hogere temperatuur en deze brander zorgt voor een kleine en nauwkeurige vlam.
Stereomicroscoop	Leica	MZFLIII	Dit is een dure estereomicroscoop met fluorescentie, die ook voor andere doeleinden kan worden gebruikt. Er zijn goedkopere opties zoals Leica MZ8 of Nikon SMZ-10 of SMZ-2B, om er een paar te noemen. Het is beter om twee stereomicroscopen te gebruiken, één voor het hanteren van de embryo's (die niet hoeft te zijn erg mooi) en een andere voor de ontvanger. Degene die voor de ontvanger wordt gebruikt, moet een lange afstand weergeven van de stageschaal tot de objectieflens, om 3-4 cm boven de stageschaal (waar de eileider zal worden geplaatst) te kunnen focussen en toch wat ruimte te laten voor de chirurg; de meeste stereomicroscopen kunnen dit, maar sommige niet.
Vezeloptische verlichting	Dolan Jenner	Fiber lite	Om het chirurgische gebied te verlichten. Er zijn verschillende systemen beschikbaar.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	Deze kunnen boven de stageschaal van de stereomicroscoop worden geplaatst. Sommige aanpassingen (het inbrengen van een stok om de stage te egaliseren) kunnen nodig zijn als deze te kort is voor de stereomicroscoop. Een grote warme stage kan worden gebruikt om de kooi te verwarmen als deze beschikbaar is. Als dat niet het geval is, kan een reguliere verwarmingskussen worden gebruikt, maar de temperatuur moet worden gecontroleerd.
Kweekschalen voor embryomanipulatie	Falcon	353001	351008 kan ook worden gebruikt; ze zijn smallere druppels.