Utero-eileiders Embryo Transfer en vasectomie in het muismodel

Samenvatting

Utero-eileiders embryo transfer maakt gebruik van de utero-eileiders splitsing als een belemmering voor het embryo uitstroom die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de baarmoeder overdracht te voorkomen. Vasectomized mannetjes zijn verplicht om pseudozwanger ontvangers krijgen voor embryotransplantatie. Beide technieken worden besproken.

Samenvatting

De overdracht van implantatie embryo's een vrouwelijke surrogaat is een verplichte stap voor de productie van genetisch gemodificeerde muizen of onderzoeken de effecten van epigenetische veranderingen ontstaan ​​tijdens de pre-implantatie ontwikkeling op latere foetale en volwassen gezondheid. Het gebruik van een effectieve en consistente embryo transfer techniek is cruciaal voor het genereren van genetisch gemodificeerde dieren verbeteren en het effect van verschillende behandelingen inplantingstarieven en overleving termijn bepalen. Embryo's in het blastocyst stadium worden meestal overgedragen door baarmoeder overdracht, het uitvoeren van een lek in de baarmoederwand aan de embryomanipulatie pipet introduceren. De opening uitgevoerd in de baarmoeder niet gesloten nadat de pipet is ingetrokken en de embryo kan uitstroom naar de buikholte door de positieve druk van de baarmoeder. De punctie kan produceren ook een bloeding die implantatie schaadt, blokkeert de overdracht pipet en van invloed kunnen embryo development, vooral wanneer embryo's zonder zona worden overgedragen. Bijgevolg, deze techniek resulteert vaak in zeer variabel en algehele lage embryo overleving. Het vermijden van deze negatieve effecten, baarmoeder-eileiders embryotransplantatie profiteren van de utero-eileiders splitsing als een natuurlijke barrière die embryo uitstroom belemmert en te voorkomen dat de punctie van de baarmoederwand. Vasectomized mannetjes zijn vereist voor het verkrijgen van pseudo-ontvangers. Een techniek om vasectomie uitvoeren wordt beschreven als een aanvulling op de utero-eileiders embryo transfer.

Inleiding

Embryo overdracht is waarschijnlijk de meest voorkomende chirurgische ingreep in het muismodel. Deze techniek is essentieel om nakomelingen te verkrijgen van embryo's die in vitro manipulatie technieken en derhalve een noodzakelijke stap voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde modellen van pronucleaire injectie, lentivirale transductie of chimeer vorming. Bovendien, de techniek kan de studie van de ontwikkeling van diverse effecten beledigingen die tijdens pre-implantatie ontwikkeling. Het gebruik van kunstmatige voortplantingstechnieken ¹ of blootstelling aan abnormale concentraties van verschillende stoffen of metabolieten ^{mei 2} embryoontwikkeling waardoor implantatie of placentatie storingen en de nakomelingen lange termijn beïnvloeden. Een betrouwbare en reproduceerbare embryo transfer techniek is cruciaal om de mogelijke negatieve effecten van de experimentele behandeling op de implantatie en de foetale ontwikkeling op een consistente man te testenner.

Muizen-implantatie embryo's kan worden overgedragen aan een ontvanger vrouwelijke ofwel in de eileider via de ampullen van 0,5 dagen na de coïtus (dpc) pseudozwanger ontvangers (eileider transfer) ^3,4 of in de baarmoeder van 2,5 dpc pseudozwangere ontvanger (baarmoeder transfer) ^5,6 Afhankelijk van hun ontwikkelingsfase. Embryo's in het blastocyst stadium, zoals die chimere muizen te genereren door injectie van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen, wordt normaliter door baarmoeder overdracht. Blastocysten kunnen ook worden overgedragen aan de eileider van een 0,5 dpc ontvanger, maar het vormt een minder fysiologische test voor ontwikkelingsstoornissen verstoorders, omdat het embryo ondergaat diapause en heeft 2 dagen om te herstellen van de belediging voor implantatie plaatsvindt. Baarmoeder overdracht omvat aanprikken van de baarmoederwand met een smalle naald teneinde een opening die de toegang van een embryo manipulatie pipet kan in de baarmoeder lumen genereren. Eenoewel deze techniek kan goede resultaten opleveren, de overleving termijn (dwz het percentage van embryo's die zich ontwikkelen naar een pup) is vaak laag en onvoorspelbaar ^7,8.

De punctie van de baarmoederwand is evenwel niet zonder schadelijke bijwerkingen. Eerst myometrium is een zeer gevasculariseerde weefsels en de punctie resulteert vaak in een kleine bloeding. Bloed kan de embryo transfer pipet blokkeren of binnenvallen de baarmoeder lumen waardoor embryonale sterfte en / of implantatie mislukking. Dit is met name relevant wanneer embryo's zonder zona worden overgedragen, als de bloedcellen en vuil kan hechten aan de blastomeren. Ten tweede, heeft de opening verricht niet dichten nadat de embryo's zijn overgebracht, zodat ze terug kan stromen door de opening en worden uitgezet naar de buikholte wanneer een te groot volume is te introduceren in de baarmoeder. De baarmoeder-eileiders embryotransplantatie hierin beschreven profiteren van de utero-eileiders afslag naar de embr leverenyos in de baarmoeder zonder prikken de baarmoederwand en aldus voorkomen de nadelige gevolgen ^9.

De pseudo-ontvanger vrouwtjes gebruikt voor embryotransplantatie worden verkregen door natuurlijke bevruchting met vasectomized mannetjes ^8. Het rudimentaire afscheidingen door een steriele mannelijke vereist de baarmoeder ontvankelijk voor de overgebrachte embryo worden. Om een ​​ontvanger te krijgen, maximaal 2 teefjes van 8 weken tot 6 maanden oud zijn ondergebracht bij een vasectomie mannelijke in de middag. De volgende ochtend, het koeien gecontroleerd op de aanwezigheid van een vaginale copulatie stekker, een klomp van gestolde eiwitten van de mannelijke zaadvloeistof. Als paring komt gewoonlijk tijdens middernacht, wordt de dag van de vaginale plug detectie beschouwd 0,5 dpc. Hoewel vasectomie mannetjes kunnen worden gekocht bij een aantal leveranciers, de hierin beschreven chirurgische procedure is relatief eenvoudig en vereist geen extra instrumenten nodig dan vereist voor embryotransfer.

Protocol

Alle dierproeven werden door de Beltsville Area Animal Care en gebruik Comites (BAACUC 11-015) goedgekeurd volgens USDA Animal Care en gebruik Guidelines.

1. Anesthesie en analgesie (Gemeenschappelijk voor beide Chirurgische ingrepen)

1. Weeg de muis en plaats de volgende anesthetica en analgetica in twee 1 ml spuiten met 27 G naalden:
   1. Ketamine (0,1 mg / g: 0,01 ml / g van een 10 mg / ml oplossing) en xylazine (0,01 mg / g: 0,005 ml / g van een 2 mg / ml oplossing).
   2. Buprenorfine (0,1 ug / g: 0,01 ml van een 0,01 mg / ml oplossing).
2. Immobiliseren de muis door het oppakken van de zijn nekvel zo dicht mogelijk bij de kaken mogelijk met de duim en wijsvinger en houdt de staart tussen de kleine en ringvinger.
3. Injecteren Ketamine-Xylazine mengsel intraperitoneaal. Om te beschadigen interne organen, houdt de muis methaar hoofd iets onder het niveau van haar heupen (figuur 1A)
4. Injecteren Buprenorfine subcutaan in het nekvel van de nek greep tussen de duim en wijsvinger (Figuur 1B).
5. Laat de muis in de kooi (schoon en zonder andere dieren) op een warme fase.
6. Eenmaal bewusteloos, controleer voor het ontbreken van de achterste voet reflex (gecontroleerd door teen knijpen). Solliciteer oogzalf droogheid van de ogen te vermijden en om te controleren op de afwezigheid van ooglidreflex (figuur 1C).
7. Dit protocol verschaft een chirurgische anesthesie vlak ten minste 30 minuten, genoeg om de hieronder beschreven procedures uit te voeren (Protocollen 2 en 3). Als langere tijden vereist zijn, kan een bijkomende injectie van ketamine + xylazine met de helft van de in 1.1.1 dosering worden aangebracht na 30 minuten. Een verandering in het ademhalingspatroon om een ​​snellere en onregelmatige ene geeft de loss van de juiste anesthesie vliegtuig.

2. Vasectomie

1. Gebruik een man met een bewezen paringsprestatie.
2. Steriliseren chirurgische instrumenten, het reinigen van de oppervlakken waar de ingreep zal worden uitgevoerd en veeg ze met 70% ethanol.
3. Voer anesthesie zoals eerder beschreven (protocol nr. 1), het controleren op verlies van reflexen.
4. Plaats de muis op een warme fase, verwijder vacht met tondeuse uit het ventrale gebied tussen twee denkbeeldige transversale lijnen geplaatst 0,5 cm en 2,5 cm boven de penis (Figuur 2A).
5. Sanitize het geschoren gebied door opeenvolgende afvegen met 10% povidonjood en 70% ethanol.
6. Plaats de muis in rugligging met zijn staart naar de chirurg en de deksel met een steriele doek met een gat bloot het geschoren gebied. Verlichten het operatiegebied.
7. Voer een 10-15 mm longitudinale huid incision in de mediale lijn van de buik, ongeveer 1 cm boven de penis. Houd de huid met dressing getande tang en knip met een schaar (Figuren 2A en 2B).
8. Voer een 5-10 mm longitudinale incisie in de linea alba. Houd de spier met microdissecting getande pincet en knip met een schaar (figuur 2C).
9. Pak de testis vet pad van de ene kant met micro ontleden getande tang en trek hem naar testis bloot, zaadleider en de bijbal. Zaadleider ligt mediaal van de testis en het is een duidelijk te onderscheiden gratis buis (niet verbonden aan de testis muur als de bijbal) een bloedvat langs een kant (figuur 2D).
10. Houd de zaadleider met een micro ontleden getande tang, vlam dressing pincet totdat ze rood (figuur 2E ), en vervolgens te gebruiken om de zaadleider gesneden en cauterize in twee punten in een keer (figuur 2F). De snede moet een gedeelte van ongeveer 5 mm te verwijderen en laat twee duidelijk gescheiden dichtgeschroeid uiteinden (figuur 2G).
11. Verplaats de zaadbal, bijbal en zaadleider terug naar de buikholte.
12. Ga verder met stap 9 in de andere testikel.
13. Hecht de spier met een of twee horizontale matras steken gemaakt met 5/0 absorbeerbare hechtdraad (figuur 2H).
14. Hecht de huid met een of twee wond clippers (figuur 2I).
15. Identificeer de vasectomie mannelijke (oor ring, vinger tattoo ...), verplaatsen van de kooi geplaatst op een warme fase en observeren totdat hij herstelt van anesthesie (bewuste en borstligging te handhaven). Een 0.5-1 ml subcutane injectie van warme zoutoplossing verbetert rehersteltools. Noteer de mogelijke incidenten die zich tijdens vasectomie overdracht, voeg antibioticum aan het drinkwater.
16. Wondklemmen verwijderd worden 10 dagen na vasectomie met een wond clipper remover of een paar tanden tang. De vasectomie mannelijke zal klaar zijn om 2 weken na de operatie paren zijn.
17. Test de onvruchtbaarheid van de vasectomie mannelijke door paren met vruchtbare vrouwtjes alvorens het te gebruiken om ontvangers te verkrijgen.

3. Utero-eileiders Embryo Transfer

1. Muis morulae of blastocysten kan deze techniek worden overgebracht naar een ontvanger vrouwelijk pseudo 2,5 dpc.
2. Bereid embryomanipulatie glazen pipet:
   1. Pools de uiteinden van de glazen capillairen om te voorkomen beschadiging van de pipet houder.
   2. Zachter een middengedeelte van het glazen capillair door verhitting met een fijne vlam, enigszins draaiendede capillaire met beide handen synchroon. Zodra de sectie capillair wordt zacht en kneedbaar (lichtrode kleur), trek hem snel van de vlam en trek beide uiteinden aan de uitwendige diameter te beperken tot 130-150 urn.
   3. Wacht tot het glas afkoelen en snijd het door licht scoren het smalle deel met een diamant-punt potlood, schurende steen of nagelvijl en het trekken van beide kanten. De pauze moet schoon en loodrecht
3. Polijst de tip door heel snel het vlammen, waardoor een 100-130 um diafragma. Pipetten kan worden opgeslagen voor later gebruik.
4. Warm embryomanipulatie media (CZBH of M2, zie bespreking).
5. Steriliseren chirurgische instrumenten, het reinigen van de oppervlakken waar de ingreep zal worden uitgevoerd en veeg ze met 70% ethanol.
6. Voer anesthesie zoals eerder beschreven (protocol nr. 1), het controleren op verlies van reflexen.
7. Het houden van thij muis op een warme fase, vacht verwijderen met elektrische tondeuse op het ruggedeelte tussen de knieën en de distale ribben (Figuren 3A en 3B).
8. Sanitize het geschoren gebied door opeenvolgende afvegen met 10% povidonjood en 70% ethanol.
9. Verplaats de embryo's uit de couveuse naar de voorverwarmde embryomanipulatie media.
10. Verplaats de ontvanger naar een warme fase onder de stereomicroscoop en plaats deze in buikligging de zijkanten aan de chirurg (met zijn hoofd naar de rechter-of linkerkant van de chirurg).
11. Bedek het gebied met een steriele doek met een gat waardoor de geschoren gebied en verlichten het operatiegebied.
12. Voer een 1 cm transversale (verticale) incisie in de huid op een plek op de craniale ⅓ van de lijn tussen de laatste rib en de heupen en de dorsale ⅓ van de lijn tussen de rug en de buik (Figuur 3A eennd 3B). Houd de huid met dressing getande pincet en knip met een schaar (Figuur 3C).
13. Nadat de huid is gesneden, kan ovarium (rood / oranje) of het vet pad rondom de eierstokken (wit) zichtbaar worden gemaakt door het lichaam muur. Voer een 0.3-0.5 cm transversaal (verticale) incisie in het lichaam muur boven de eierstok of vet pad op een plek waar de incisie niet knippen enige grote bloedvat. Houd de spier met micro ontleden getand pincet en knip met een schaar (Figuur 3D).
14. Beweeg de muis om haar hoofd gericht naar de chirurg.
15. Laad de embryomanipulatie pipet (figuur 3E):
    1. Laat CZBH media te stijgen door capillariteit door het nauwe gedeelte van de manipulatie pipet tot ongeveer 5 mm van het bredere gedeelte.
    2. Neem een ​​kleine luchtbel (0.2-0.5 mm).
    3. Introduceer de embryo's (5-10) ineen minimale hoeveelheid medium (2-4 mm).
    4. Neem nog een kleine luchtbel (0.2-0.5 mm) en een kleine hoeveelheid media (0.5-1 mm).
    5. Laat de glazen pipet die aan de mond aspirator houder of aan de met de hand bediende inrichting, klaar voor stap 3.17.
16. Pak het vet pad rond de eierstok met micro ontleden getand pincet en trek hem naar de muis hoofd naar de eierstok, eileider, en een klein deel van de bovenste baarmoeder uit de buikholte (Figuren 3F en 3G) bloot te leggen.
17. Houd de aspirator mondstuk in de mond, klaar om gebruikt te worden, pak het vet pad met micro ontleden gekartelde tang om de eileider te bewegen en de utero-eileiders kruispunt (dwz waar de eileider aan de baarmoeder) bloot te leggen.
18. Houden van de utero-eileiders knooppunt bereikbaar, neem lichte gebogen micro dissectie pincet met je linkerhand (als rechtshandige) en plaats ze net onderde utero-eileiders knooppunt grijpen de eileider ongeveer 2 mm boven dat gedeelte.
19. Houd de utero-eileiders kruising met de lichte gebogen micro dissectie pincet, doorboren de eileider gedeelte dicht bij de tang met een 27 G naald (Figuur 3H).
20. Plaats de embryomanipulatie pipet in de opening uitgevoerd met de naald en ga verder naar de baarmoeder via de eileiders baarmoeder-junction (figuren 3I en 3J). Zodra de pipet de utero-eileiders junction (figuur 3K) is geslaagd voor het glijdt gemakkelijk. Niet erg ver vooruit in de baarmoeder endometrium schade (niet meer dan 3 mm) en pipet blokkering door het puin te voorkomen.
21. Laat de embryo's in de baarmoeder door zachtjes te blazen (figuur 3L). Beide luchtbellen moet door de baarmoeder. Sommige van de media boven de eerste bubblekan ook worden vrijgegeven in de baarmoeder, maar voorkomen dat er meer lucht, omdat implantatie kunnen belemmeren.
22. Verwijder de pipet net na embryo's zijn vrij in de baarmoeder.
23. Verplaats de eileider en de eierstok naar de buikholte door grijpen de vet pad.
24. Hecht de spier met een horizontale matras steek met 5/0 absorbeerbare hechtdraad (Figuur 3M).
25. Hecht de huid met een wond clipper (figuur 3N).
26. Ga verder met stap 10 aan de andere kant indien nodig.
27. Identificeer de ontvanger (oor ring, vinger tattoo ...), verplaatsen naar zijn kooi (geplaatst op een warme fase) en observeren totdat hij herstelt van anesthesie (bewuste en borstligging te handhaven).
28. Annoteren de mogelijke incidenten die zich tijdens embryotransplantatie en voeg antibiotica aan het drinkwater. Een 0.5-1 ml subcutane injectie van warme saline oplossing verbetert het herstel.
29. Wond clips kunnen worden verwijderd 10 dagen na embryo transfer met een wond clipper remover of twee paar tang (figuur 3O). De ontvanger kan worden afgewogen op die dag aan de zwangerschap te beoordelen en schatten het aantal pups. Bieden genesteld materiaal aan de ontvanger 15 dagen na embryo transfer.

Resultaten

Utero-eileiders embryo transfer biedt een middel om embryo's over te dragen aan de baarmoeder vermijden van een aantal van de complicaties verbonden aan de baarmoeder embryo transfer ^2,9,10. In tabel 1 tonen we enkele representatieve resultaten ons verkregen overbrengen CD1 blastocysten blootgesteld aan verschillende manipulaties CD1 ontvangers volgens de beschreven protocol. De term overleving (% van embryo resulteert in een pup) of overleving E15 (bij lentivirus blootgesteld) is gelijk ...

Discussie

Vasectomie is een relatief ongecompliceerd chirurgische techniek die grote moeilijkheden geen sprake. Bij het opschonen met povidonjood en ethanol ervoor te zorgen dat de laatste wasbeurt (met ethanol) verwijdert povidonjood, omdat het het buikvlies kan irriteren. De toegang tot zaadleider kan ook worden bereikt door het scrotum of het uitvoeren van een transversale incisie in de buik ^8. Scrotum incisie is aanbevolen om buikinsnijding transversale te wijten aan de relatief kleinere incisie nodig is e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	Te bestellen door een erkende dierenarts.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	Te bestellen door een erkende dierenarts.
Buprenorfine	Generic	NDC 400-42-010-01	Te bestellen door een erkende dierenarts.
Oogzalf	Novartis	Genteal
Antibioticum	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Toegevoegd aan drinkwater (0,3 mg/ml amoxicillinetrihydraat en 0,075 mg/ml kaliumclavulanaat). Voeg 1,5 ml van de gereconstitueerde 15 ml fles toe aan 250 ml water.
Versnipperde tang voor dressing	ROBOZ	RS-8120	Elke middelgrote chirurgische rechte tang van staal zal werken.
Microdissectietang met gekartelde tangen	ROBOZ	RS-5137	Deze zijn gebogen in een hoek van 90º. Rechte tangen kunnen worden gebruikt indien gewenst.
Licht gebogen microdissectietang	ROBOZ	RS-5136	Dit model is bijzonder nuttig om de eileider vast te houden.
Schaar	ROBOZ	RS-5880	Elke reguliere chirurgische rechte schaar van staal is geschikt.
27 G naalden	Beckton-Dickinson	305136	Kleinere naalden (30 G) kunnen ook worden gebruikt. 25 G kan een beetje te groot zijn.
Clipapplicateur	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clipverwijderaar	MiKRon	7637	Twee paar tangen (ROBOZ RS-8160) kunnen worden gebruikt in plaats daarvan.
Naaldhouder voor hechtdraad	ROBOZ	RS-7820
Hechtdraad	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Kan worden vervangen door elke 4-0 tot 6-0 absorbeerbare hechtdraad met een smalle gebogen naald.
Glas capillairen	VWR	100 ul gekalibreerde pipetten 53432-921	Het bevat een mondspiratiesysteem dat alleen een 0,22 µm filter in de slang vereist om klaar voor gebruik te zijn. Meer informatie is verkrijgbaar in Nagy et al.8
Brander	KISAG AG	Typ 2002	Gasgestuurde brander, kan worden opgeladen met Kigas (CH-4512, van dezelfde leverancier). Alcoholbranders mogen ook worden gebruikt, maar gas zorgt voor een hogere temperatuur en deze brander zorgt voor een kleine en nauwkeurige vlam.
Stereomicroscoop	Leica	MZFLIII	Dit is een dure estereomicroscoop met fluorescentie, die ook voor andere doeleinden kan worden gebruikt. Er zijn goedkopere opties zoals Leica MZ8 of Nikon SMZ-10 of SMZ-2B, om er een paar te noemen. Het is beter om twee stereomicroscopen te gebruiken, één voor het hanteren van de embryo's (die niet hoeft te zijn erg mooi) en een andere voor de ontvanger. Degene die voor de ontvanger wordt gebruikt, moet een lange afstand weergeven van de stageschaal tot de objectieflens, om 3-4 cm boven de stageschaal (waar de eileider zal worden geplaatst) te kunnen focussen en toch wat ruimte te laten voor de chirurg; de meeste stereomicroscopen kunnen dit, maar sommige niet.
Vezeloptische verlichting	Dolan Jenner	Fiber lite	Om het chirurgische gebied te verlichten. Er zijn verschillende systemen beschikbaar.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	Deze kunnen boven de stageschaal van de stereomicroscoop worden geplaatst. Sommige aanpassingen (het inbrengen van een stok om de stage te egaliseren) kunnen nodig zijn als deze te kort is voor de stereomicroscoop. Een grote warme stage kan worden gebruikt om de kooi te verwarmen als deze beschikbaar is. Als dat niet het geval is, kan een reguliere verwarmingskussen worden gebruikt, maar de temperatuur moet worden gecontroleerd.
Kweekschalen voor embryomanipulatie	Falcon	353001	351008 kan ook worden gebruikt; ze zijn smallere druppels.