Method Article

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een experimenteel ontwerp aanpak die kan worden bepaald en modelleren invloed van transgene regulerende elementen plantengroei en ontwikkeling parameters en incubatieomstandigheden de tijdelijke expressie van monoklonale antilichamen en reporter eiwitten in planten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Planten bieden meerdere voordelen voor de productie van biofarmaceutische producten met lage kosten, schaalbaarheid en veiligheid. Tijdelijke expressie biedt het bijkomende voordeel van de korte ontwikkeling en productie tijden, maar expressie niveaus kunnen aanzienlijk verschillen tussen batches dus aanleiding geven tot regelgeving betreft in het kader van de goede praktijken bij het vervaardigen. We gebruikten een ontwerp van experimenten (DOE) benadering van het effect van de belangrijkste factoren als regulerende elementen in het expressieconstruct, plantengroei en ontwikkeling, alsook de incubatieomstandigheden tijdens expressie, de variabiliteit van expressie tussen partijen kan worden toegepast. We testten planten die een model anti-HIV-monoklonaal antilichaam (2G12) en een fluorescente merker proteïne (DsRed). We bespreken de reden voor het selecteren van bepaalde eigenschappen van het model en identificeren van de mogelijke beperkingen. De algemene aanpak kan gemakkelijk worden overgedragen aan andere problemen, omdat de beginselen van het model eenre breed toepasbaar: op kennis gebaseerde parameter selectie, complexiteit reductie door het splitsen van de initiële probleem in kleinere modules,-software stapsgewijze installatie van optimale experiment combinaties en stapsgewijze ontwerp augmentatie. Daarom is de methode is niet alleen nuttig voor het karakteriseren van eiwitexpressie in planten, maar ook voor het onderzoeken van andere complexe systemen ontbreekt een mechanistische beschrijving. De voorspellende vergelijkingen die de interconnectiviteit tussen parameters kunnen worden gebruikt om mechanistische modellen voor andere complexe systemen stellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De productie van biofarmaceutische eiwitten in planten is gunstig omdat planten goedkoop te kweken, kan het platform worden opgeschaald door gewoon groeit planten en menselijke pathogenen niet kunnen repliceren 1,2. Tijdelijke expressie strategieën gebaseerd bijvoorbeeld op infiltratie van bladeren met Agrobacterium tumefaciens biedt extra voordelen omdat de tijd tussen het moment van levering van DNA en de levering van een gezuiverd product wordt verminderd van jaar tot minder dan 2 maanden 3. Tijdelijke expressie wordt ook gebruikt voor functionele analyse, bijvoorbeeld om genen te testen op hun vermogen om verlies-van-functi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het plannen van een DoE strategie

  1. Identificeer relevante factoren en reacties voor opname in het ontwerp.
    1. Definieer een of meerdere antwoorden voor meting. Hier werden 2G12 en DsRed expressieniveaus gebruikt (ug / ml), zoals de minimale detecteerbare verschil geacht relevant (10 en 20 ug / ml) en een benaderende waarde voor de geschatte standaarddeviatie van het systeem (4 en 8 ug / ml) op basis van eerdere experimenten.
    2. Gebruik de beschikbare literatuur, gegevens uit eerdere experimenten of gespecialiseerde screening designs (bijvoorbeeld een factorieel ontwerp, zie de inleiding) om belangrijke factoren waarvan de invloed op....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een beschrijvend model voor DsRed accumulatie tijdens transiënte expressie met behulp van verschillende promotors en 5'UTRs

DsRed fluorescentie in bladextracten werd gebruikt om het expressieniveau van het recombinante eiwit geven en aldus werd gebruikt als de reactie in de DOE strategie. De minimale detecteerbare verschil we relevant geacht was 20 ug / ml en de geschatte standaarddeviatie van het systeem 8 ug / ml gebaseerd op de initiële experimenten. Factoren opgenome.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elk experiment vereist een zorgvuldige planning omdat de middelen zijn vaak schaars en duur. Dit geldt met name voor DoE strategieën omdat fouten tijdens de planningsfase (bijvoorbeeld het selecteren van een basismodel dat geen betrekking heeft op alle belangrijke factor interacties) aanzienlijk de voorspellende kracht van de resulterende modellen kunnen verminderen en dus devalueren het hele experiment. Toch kunnen deze fouten gemakkelijk vermeden worden door het volgen van elementaire procedures.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De publicatie vergoeding werd gedeeltelijk gesponsord door de bedrijven Statease, Inc (USA) en Statcon (Duitsland), die niet betrokken waren bij het betrokken bij de voorbereiding van het manuscript of verantwoordelijk voor de inhoud ervan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dank aan Dr Thomas Rademacher voor het verstrekken van de PPAM plantenexpressievector en Ibrahim Al Amedi voor het kweken van de tabaksplanten gebruikt in deze studie. We willen graag Dr Richard M. Twyman bedanken voor zijn hulp bij het bewerken van het manuscript. Dit werk werd deels gefinancierd door de European Research Council Advanced Grant "Future-Pharma", voorstel nummer 269110 en het Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoE software
TryptoneCarl Roth GmbH8952.2Media component
Yeast extractCarl Roth GmbH2363.2Media component
Sodium chlorideCarl Roth GmbHP029.2Media component
AmpicillinCarl Roth GmbHK029.2Antibiotic
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2Media component
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012Microorganism
pPAMGenBankAY027531Cloning/expression vector; 
NucleoSpin Plasmid MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spectrophotometer
NcoINew England Biolabs Inc.R3193LRestrictionendonuclease
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101LRestrictionendonuclease
AscINew England Biolabs Inc.R0558LRestrictionendonuclease
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004SRestrictionendonuclease buffer
TRISCarl Roth GmbH4855.3Media component
Disodium tetraborateCarl Roth GmbH4403.3Media component
EDTACarl Roth GmbH8040.2Media component
AgaroseCarl Roth GmbH6352.4Media component
Bromophenol blueCarl Roth GmbHA512.1Color indicator
Xylene cyanolCarl Roth GmbHA513.1Color indicator
GlycerolCarl Roth GmbH7530.2Media component
Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RKDSMZ12365Microorganism
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658Electroporator
Beef extractCarl Roth GmbHX975.2Media component
PeptoneCarl Roth GmbH2365.2Media component
SucroseCarl Roth GmbH4621.2Media component
Magnesium sulfateCarl Roth GmbH0261.3Media component
CarbenicillinCarl Roth GmbH6344.2Antibiotic
KanamycinCarl Roth GmbHT832.3Antibiotic
RifampicinCarl Roth GmbH4163.2Antibiotic
FWD primerEurofins MWG Operonn.a.CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primerEurofins MWG Operonn.a.CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cyclerApplied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfold webserverUniversity of Viennan.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cmGrodann.a.Rockwool block
Greenhousen.a.n.a.For plant cultivation
PhytotronIlka Zelln.a.For plant cultivation
Omnifix-F SoloB. Braun6064204Syringe
Murashige and Skoog saltsDuchefaM 0222.0010Media component
GlucoseCarl Roth GmbH6780.2Media component
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GPhytohormon analogon
 BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008Photometer
Osram cool white 36 WOsram4930440Light source
Disodium phosphateCarl Roth GmbH4984.3Media component
Centrifuge 5415DEppendorf5424 000.410Centrifuge
Forma -86C ULT freezerThermoFisher88400Freezer
Synergy HTBioTekSIAFRTFluorescence plate reader
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPR device
Protein ALife Technologies10-1006Antibody binding protein
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Media component
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Media component
2G12 antibodyPolymunAB002Reference antibody

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Design Of ExperimentsTransient Protein ExpressionTobacco PlantsProtein AccumulationLeaf AgeIncubation ConditionsFluorescence MeasurementResponse SurfaceNumerical OptimizationPredictive Modeling

Related Articles