Methodenartikel

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

DOI:

10.3791/51217

⸱

17 december 2013

 ,  , 
1Genetics and Biochemistry Branch of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel illustreert het gebruik van puls-chase radio-labeling in combinatie met plaatsspecifiek fotocrosslinking om interacties te monitoren tussen een eiwit van belang en andere factoren in E. coli. In tegenstelling tot traditionele chemische cross-linking methoden, genereert deze aanpak hoge resolutie “momentopnamen” van een geordende assemblageroute in een levende cel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode om dynamische interacties tussen een eiwit van belang en andere factoren in vivo te detecteren en te analyseren. Onze methode is gebaseerd op de amber-suppressietechnologie die oorspronkelijk werd ontwikkeld door Peter Schultz en collega's1. Een ambermutatie wordt eerst geïntroduceerd op een specifiek codon van het gen dat codeert voor het eiwit van belang. De amber mutant wordt vervolgens tot expressie gebracht in E. coli samen met genen die coderen voor een amber suppressor tRNA en een amino acyl-tRNA synthetase afgeleid van Methanococcus jannaschii. Met behulp van dit systeem wordt het foto-activeerbare aminozuur analoog p-benzoylfenylalanine (Bpa) opgenomen op het ambercodon. Cellen worden vervolgens bestraald met ultraviolet licht om de Bpa-rest te covalent verbinden met eiwitten die zich binnen 3-8 Å bevinden. Fotocrosslinking wordt uitgevoerd in combinatie met pulse-chase labeling en immunoprecipitatie van het eiwit van belang om veranderingen in eiwit-eiwitinteracties die zich voordoen over een tijdschaal van seconden tot minuten te monitoren. We hebben de procedure geoptimaliseerd om de assemblage van een bacteriële virulentiefactor te bestuderen die bestaat uit twee onafhankelijke domeinen, een domein dat is geïntegreerd in de buitenste membraan en een domein dat wordt getransloceerd naar de extracellulaire ruimte, maar de methode kan worden gebruikt om vele verschillende assemblageprocessen en biologische paden in zowel prokaryotische als eukaryotische cellen te bestuderen. In principe kunnen interacterende factoren en zelfs specifieke residuen van interacterende factoren die binden aan een eiwit van belang worden geïdentificeerd door massaspectrometrie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is vaak essentieel om interacties tussen een eiwit van belang en andere cellulaire componenten te identificeren en te karakteriseren om zijn rol in een biologische route te definiëren, zijn samenstelling te begrijpen of zijn werkingsmechanisme te verduidelijken. Er worden vaak verschillende benaderingen gebruikt om eiwit-eiwit interacties te bestuderen, maar ze hebben allemaal hun beperkingen. De eenvoudigste onbevooroordeelde methode om eiwitten die aan een eiwit van belang binden te identificeren, is copurificatie (of co-immunoprecipitatie), maar deze benadering vereist dat een eiwitcomplex intact blijft tijdens de zuiveringsprocedure. Zwakke of tijdelijke eiwitinteracties kunnen worden gestabiliseerd door chemische cross-linking, maar deze methode vereist meestal het gebruik van verbindingen die eiwitten koppelen via primaire aminen die wijd verspreid zijn in de eiwitsequentie. Er kunnen ingewikkelde cross-linking patronen ontstaan die moeilijk te interpreteren zijn, vooral wanneer eiwitten van belang componenten zijn van multi-eiwit complexen. Bovendien, omdat de ruimteramen van chemische cross-linkers meestal langer zijn dan 10 Å, kunnen covalente bindingen worden gevormd met eiwitten die zich in de nabijheid bevinden, maar niet direct interageren met het eiwit van belang. Methoden zoals affiniteitschromatografie en two-hybrid screens zijn ook vaak nuttig om eiwit-eiwit interacties te identificeren. De eerste benadering vereist echter het reproduceren van omstandigheden die fysiologisch significante interacties bevorderen en kan niet worden gebruikt om zwakke interacties te detecteren. De tweede benadering vereist dat bindingsinteracties kunnen worden gerepliceerd in het gastheereiwit en worden gehandhaafd wanneer een eiwit van belang en zijn bindingspartners in de context van een fusie-eiwit worden geplaatst. Two-hybrid methoden hebben ook de neiging om vals-positieve resultaten te genereren2. Zodra een eiwit-eiwit interactie is vastgesteld, is er vaak aanzienlijk werk vereist om de interactieplaats in kaart te brengen. Misschien is het grootste nadeel van traditionele benaderingen dat ze geen informatie geven over de tijdelijke volgorde van intermoleculaire interacties of de kinetiek van binding.

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode die enkele van de beperkingen van andere benaderingen overwint die worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Aanvankelijk wordt een enkele amber mutatie geïntroduceerd in het gen dat codeert voor een eiwit van belang. De amber mutant wordt vervolgens geco-expresseerd met een amber suppressor tRNA en een aminoacyl-tRNA synthetase afgeleid van Methanococcus jannaschii die zijn ontworpen om het fotoactiveerbare aminozuur analoog p-benzoylfenylalanine (Bpa) alleen bij amber codons in te bouwen3. Bestraling van cellen met langgolf ultraviolet (UV) licht (~365 nm) vergemakkelijkt vervolgens de vorming van een covalente binding tussen Bpa en eiwitten die zich binnen ~3-8 Å bevinden4,5. In sommige experimentele contexten kunnen cross-links ook worden gevormd tussen geactiveerde Bpa en niet-eiwitcomponenten van cellen zoals lipiden en nucleïnezuren6. Moleculen die worden beëindigd bij het amber codon moeten over het algemeen gemakkelijk onderscheidbaar zijn van het volledige eiwit op SDS-PAGE en kunnen niet worden gekruist met andere eiwitten. Door cellen te onderwerpen aan pulse-chase radiolabeling voorafgaand aan cross-linking en vervolgens cross-linking producten immunoprecipiteren of affiniteitszuiveren, kunnen de sequentie en duur van eiwit-eiwit interacties worden vastgesteld. Het vermogen om tijdelijke informatie te genereren over intermoleculaire interacties is vooral waardevol om de progressie van een eiwit van belang door een geordende multi-staps assemblage, transport of signaalroute te bestuderen en pad-intermediaten te identificeren. Net als chemische cross-linking detecteert locatie-specifiek cross-linking eiwit-eiwit interacties die plaatsvinden onder fysiologische omstandigheden, maar de introductie van een cross-linker op een enkele positie vergemakkelijkt de analyse van interacties tussen individuele segmenten van een eiwit en andere factoren. Deze unieke eigenschap van locatie-specifiek cross-linking is vooral voordelig wanneer het eiwit van belang meerdere segmenten of domeinen heeft die het potentieel hebben om met verschillende bindingspartners te interageren. Bovendien kan locatie-specifiek cross-linking in combinatie met methoden zoals massaspectrometrie worden gebruikt om de residuen die eiwit-eiwit interacties met precisie mediëren in kaart te brengen. Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor gebruik in E. coli, is de incorporatie van fotoactiveerbare aminozuur analogen in eiwitten door amber suppressie gerapporteerd in Mycobacterium, gist en zoogdiercellen7-11. Dus in principe kan onze methode in andere systemen worden gebruikt.

We hebben deze methode uitgebreid gebruikt om intermoleculaire interacties te identificeren die de biogenese van EspP, een E. coli O157:H7 virulentiefactor, vergemakkelijken. EspP is een lid van een superfamilie van eiwitten die bekend staan als "autotransporters" en die een grote N-terminale extracellulaire domein ("passagiersdomein") en een C-terminaal domein ("b domein") bevatten dat zich opvouwt in een cilindrische b-vatstructuur en het eiwit aan het buitenmembraan (OM) verankert12. Het mechanisme waarmee het passagiersdomein over het OM wordt getransporteerd, is een langstaande mysterie. Net als alle bacteriële celoppervlakte-eiwitten, moet EspP worden getransporteerd over het binnenmembraan, over het periplasma (de ruimte tussen het binnen- en buitenmembraan) worden getransporteerd en gericht op het OM in een reeks geordende gebeurtenissen. Na zijn translocatie over het OM wordt het EspP passagiersdomein ook gescheiden van het b-domein door een proteolytische splitsing en vrijgegeven van het celoppervlak. Door site-specifiek cross-linking te combineren met pulse-chase radiolabeling, hebben we aangetoond dat beide domeinen van het eiwit aanvankelijk interageren met de moleculaire chaperon Skp in het periplasma6. Vervolgens interageren discrete segmenten van het b-domein op een stereospecifieke manier met componenten van een hetero-oligomeer genaamd het Bam-complex, dat de integratie van b-vat-eiwitten in het bacteriële OM door een onbekend mechanisme katalyseert. Misschien het meest interessant is dat we hebben gevonden dat het passagiersdomein in contact is met een van de Bam-complex subeenheden (BamA) terwijl het het OM passeert13</

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plasmid Construction

  1. Na het klonen van een gen dat codeert voor een eiwit van belang in een geschikte expressievector, introduceer amber mutaties op gewenste locaties met behulp van een site-directed mutagenese kit.
    OPMERKING: Structurele informatie en voorspellingen van oppervlakte-expositie kunnen nuttige richtlijnen zijn om de posities van mutaties te bepalen. Omdat de efficiëntie van amber-suppressie en cross-linking aanzienlijk kan variëren, moeten amber mutaties op meerdere posities worden geïntroduceerd. Bovendien, omdat Bpa een analoog is van tyrosine en fenylalanine, probeer amber mutaties te introduceren op posities die normaal gesproken grote hydrofobe aminozuren coderen om veranderingen in eiwitstructuur en functie te minimaliseren. Ten slotte, houd er bij het kiezen van een expressievector rekening mee dat het overmatig produceren van een eiwit van belang op een zeer hoog niveau de efficiëntie van Bpa-incorporatie zou kunnen beperken.

2. Cultuurvoorbereiding

  1. Gebruik elektroporatie om een geschikte E. coli-stam te transformeren met een plasmide dat het amber-suppressiesysteem codeert (pDULE-pBpa; zie verwijzing4) en een compatibel plasmide dat het eiwit van belang met een amber-mutatie codeert.
  2. Plaat cellen op LB-agar bevattende geschikte antibiotica (gebruik 5 µg/ml tetracycline om te selecteren voor pDULE-pBpa). Bebroed de platen O/N bij 37 °C.
  3. De volgende dag start O/N-culturen van enkele kolonies in 3-5 ml M9-medium14 bevattend 0,2% glycerol, alle L-aminozuren behalve methionine en cysteïne (40 µg/ml) en antibiotica. Bebroed bij 37 °C.
  4. De volgende dag centrifugeer O/N-culturen bij 2.500 x g gedurende 5 min bij RT om cellen te pelletten. Resuspendeer de cellen in 5 ml vers M9-medium en herhaal de centrifugatie.
    OPMERKING: Deze wasstap is cruciaal om plasmiden te behouden die ampicilline-resistentie coderen, omdat kleine hoeveelheden b-lactamase die aanwezig zijn in het medium van O/N-culturen vers gevoegd ampicilline degraderen voordat significante celgroei optreedt.
  5. Resuspendeer de cellen in 2 ml vers medium en meet de celconcentratie in een spectrofotometer (OD550).
  6. Voeg cellen toe aan een 250 ml Erlenmeyer kolf bevattend 50 ml M9-medium en antibiotica bij OD550=0,03. Bebroed de culturen bij 37 °C in een schuddende waterbad.

3. Bpa-incorporatie en voorbereiding voor fotocrosslinking

OPMERKING: Het hieronder beschreven protocol is voor een monstertijdsverloop dat drie tijdstippen heeft (0, 1 en 5 min). Pas de volumes aan als een ander aantal tijdstippen gewenst is. Een overzicht van de procedure wordt geïllustreerd in Figuur 1.

  1. Terwijl de culturen groeien, bereid een verse 1 M (1.000x) oplossing van Bpa in 1 M NaOH (27 mg Bpa in 100 μl 1 M NaOH) voor. Gebruik een donkerwandige buis om de oplossing in het donker te houden.
  2. Wanneer de culturen een vroeg tot midden log-fase bereiken (OD550=0,2), voeg 50 μl 1 M Bpa toe aan elke cultuur. Voeg Bpa één druppel per keer toe terwijl je de kolf rond zwaait om precipitatie te voorkomen. Voeg vervolgens eventuele inductoren toe die nodig zijn om de expressie van de amber-mutant aan te drijven. Blijf de culturen gedurende 30 min bij 37 °C bebroeden.
  3. Tijdens de 30 min inductieperiode label zes wegwerpbare 15 ml centrifugeerbuisjes met het tijdstip (0 min, 1 min, 5 min) en hetzij "+ UV" of "- UV". Plaats de buisjes op ijs.
  4. Vul een tweede emmer met ijs en plaats een 6-well weefselkweekplaat op het ijs.
  5. Ontdooi hoog specifiek activiteit (1.000 mCi/mmol) 35S-methionine en 35S-cysteïne (of een vooraf gemaakte mix van de twee verbindingen) voor de pulslabeling en bereid (of ontdooi) een oplossing van niet-radioactieve L-cysteïne en L-methionine (100 mM elk) voor de chase.
  6. Zet de UV-lamp vijf min voor radiolabeling aan.
    OPMERKING: De lamp moet instelbaar zijn zodat deze ongeveer 3-4 cm van de monsters in de multiwellplaat kan worden geplaatst.
  7. Voeg ijs toe (~2 ml) aan elke buis gelabeld "- UV" en aan twee van de putjes in de multiwellplaat.
    OPMERKING: IJs moet aan een derde put worden toegevoegd onmiddellijk vóór het 5 min tijdstip. Het is essentieel om ijs direct in de buisjes en putjes te plaatsen om intracellulaire reacties onmiddellijk bij elk tijdstip te stoppen en daarmee nauwkeurige "snapshots" van een specifiek biochemisch pad te verkrijgen.
  8. Aan het einde van de 30 min inductieperiode breng 25 ml van de cultuur over in een voorverwarmde 125 ml wegwerp Erlenmeyer kolf. Plaats de kolf in het 37 °C schuddende waterbad.

4. Puls-chase labeling en UV-bestraling

OPMERKING: Het puls-chase labeling en UV-bestraling protocol heeft veel stappen die op tijd moeten worden uitgevoerd en die aanzienlijke organisatie en voorbereiding vereisen. Alle reagentia en buisjes moeten gemakkelijk toegankelijk zijn. Hieronder

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten locatie-specifiek fotocrosslinking om eiwitten te identificeren die interageren met EspP tijdens zijn reis naar de OM. In de experimenten die hier worden getoond, zijn phenylalanine codons op residuen 1113 en 1214 vervangen door amber codons. Beide posities bevinden zich in de b-domein, die zich integreert in de OM en dient als membraananker. De kristalstructuur van het EspPβ domein16 laat zien dat de twee residuen zich aan de periplasmatische kant van de b-vat bevinden, maar worden gescheiden do...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode die locatiespecifiek fotocrosslinking combineert met pulse-chase labeling om de dynamische interacties tussen een eiwit van belang en andere componenten van een levende cel te onderzoeken. De methode is vooral nuttig om meertrapsprocessen te bestuderen waarbij het eiwit opeenvolgend interactie heeft met andere factoren. In tegenstelling tot traditionele chemische crosslinking-benaderingen, biedt locatiespecifiek fotocrosslinking gedetailleerde informatie over de status van individuele s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het Nationaal Instituut voor Diabetes en Spijsverterings- en Nierziekten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
QuikChange II Site-Directed Mutagenesis KitAgilent200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)BachemF-2800
TRAN35S-LABEL, Metabolic Labeling Reagent (35S-L-methionine en 35S-L-cysteïne, >1.000 Ci/mmol)MP Biomedicals51006
Spectroline SB-100P Super-High-Intensity UV-lamp, 365 nmSpectronics CorporationSB-110P
Spectroline Vervangingslamp 100SSpectronics Corporation11-992-15
Falcon weefselkweekplaat, 6-wellBecton Dickinson Labware353046
Beker met opzetstuk 125 ml ErlenmeyerCorning430421
Innova 3100 schudkweekincubatorNew Brunswick Scientificn.a.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  2. von Mering, C., et al. Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417, 399-403 (2002).
  3. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli. PNAS. 99, 11020-11024 (2002).
  4. Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).
  5. Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning. Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).
  6. Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain. PNAS. 108, 383-391 (2011).
  7. Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 5, (2010).
  8. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae. J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).
  9. Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris. Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).
  10. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).
  11. Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells. Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).
  12. Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).
  13. Ieva, R., Bernstein, H. D. Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane. PNAS. 106, 19120-19125 (2009).
  14. Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion. PNAS. 110, (2013).
  15. Harlow, D., Lane, D. Using antibodies: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
  16. Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes. Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).
  17. Akiyama, Y., Ito, K. SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eiwit eiwitinteractiesPulse Chase labelingAmber suppressietechnologieBenzoylfenylalanine incorporatieUV bestralingImmunoprecipitatieSDS PAGE analyseAssemblage van bacteri le virulentiefactorenMassaspectrometrie identificatie

Gerelateerde artikelen