Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

12K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51218

⸱

27 januari 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

In dit artikel

Samenvatting

Aanhoudende activering van remmende G-eiwit gekoppelde receptoren leidt tot een sensibilisering van adenylylcyclase signalering. Om de essentiële moleculaire pathways identificeren nonbiased stappen noodzakelijk zijn, maar deze strategie vereist de ontwikkeling van een schaalbare celgebaseerde cAMP overgevoeligheid assay. Hierin beschrijven we een overgevoeligheid test voor kleine moleculen en siRNA screening.

Samenvatting

Sensibilisatie van adenylylcyclase (AC) signalering is betrokken bij diverse neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen waaronder verslaving en ziekte van Parkinson. Acute activering van Gai / O-gekoppelde receptoren remt AC activiteit, terwijl aanhoudende activering van deze receptoren leidt tot heterologe sensibilisatie van AC en verhoogde niveaus van intracellulair cAMP. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze verbetering van AC respons na chronische activatie van verschillende soorten Gai / o-gekoppelde receptoren zoals dopamine D2 en μ opioïde receptoren waargenomen zowel in vitro als in vivo. Hoewel heterologe sensibilisatie van AC eerst werd gemeld vier decennia geleden, het mechanisme (s) dat dit verschijnsel ten grondslag liggen blijven grotendeels onbekend. Het ontbreken van mechanistische gegevens vermoedelijk weerspiegelt de complexiteit die betrokken zijn bij deze adaptieve respons, wat suggereert dat nonbiased aanpak zou kunnen helpen bij het identificerening de moleculaire pathways die betrokken zijn bij heterologe sensibilisering van AC. Eerdere studies hebben kinase en Gbγ signalering geïmpliceerd als overlappende componenten die het heterologe sensibilisatie van AC regelen. Om unieke en extra overlappende doelstellingen in verband met sensibilisatie van AC identificeren, is de ontwikkeling en validatie van een schaalbare cAMP sensibilisatie kwantitatieve analyse vereist voor een grotere verwerkingscapaciteit. Vorige benaderingen van sensibilisatie studeren zijn over het algemeen omslachtig waarbij continue celkweek onderhoud, alsmede een complexe methode voor het meten van cAMP dat meerdere wasstappen inhoudt. Aldus zou de ontwikkeling van een krachtige cel-gebaseerde test die kan worden gebruikt voor high throughput screening (HTS) in 384 putjes toekomstige studies te vergemakkelijken. Met twee D2 dopamine receptor cellulaire modellen (dwz. CHO-D 2L en HEK-AC6 / D 2L), hebben we 48-well assay gevoeligheid (> 20 stappen 4-5 dagen) omgezet in een vijf-step, enkele dag assay in 384-well formaat. Dit nieuwe format vatbaar is klein molecuul screening, en we tonen aan dat deze assay ontwerp ook gemakkelijk kan worden gebruikt voor omgekeerde transfectie van siRNA in afwachting gerichte siRNA bibliotheekscreening.

Inleiding

Een adaptief adenylylcyclase (AC) signalering reactie bekend als heterologe-of super-overgevoeligheid werd voor het eerst ontdekt in het laboratorium van Nobelprijswinnaar dr. Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg voorgesteld dat de waargenomen toename AC respons na chronische δ opioïde receptor activering was een mechanisme betrokken bij opiaten tolerantie en afhankelijkheid 1. Naast chronische δ opioïde receptor activatie dit neuroadaptive reactie van AC signaal komt voor na aanhoudende activatie van verscheidene andere Gai / o-gekoppelde receptoren 2. Met name veel van deze receptoren worden geassocieerd met pijn, neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen, en omvatten μ / κ opioïde, D 2/4 dopamine, 5HT 1A en M 2/4 muscarinereceptoren 2. Naast Dr Nirenberg bevindingen, een grote hoeveelheid bewijs bestaat koppelen sensibilisering van AC signalering naar chronische opioïde receptor activering zowel in vitro en in vivo 3-7. Sensibilisatie van AC is ook geassocieerd met een verscheidenheid van ziekten waarbij D 2-achtige dopamine receptoren waaronder schizofrenie en de ziekte van Parkinson (voor overzicht zie referentie 2). Ondanks het potentiële belang van sensibilisatie, de precieze mechanisme (s) van persistente Gai / o-gekoppelde receptoractivering die leidt tot verhoogde AC respons grotendeels onbekend.

Deze studies vormen de reden voor het onderzoek van de mechanismen voor de sensibilisering van adenylylcyclase als een belangrijke neurobiologische doelwit. Ook moet de fysiologische relevantie van AC signalering 8 en het belang dat de individuele AC isovormen houden in deze adaptieve respons ook worden erkend 2,9,10. In het kader van het onderzoek, de algemene kenmerken geassocieerd met heterologe sensibilisering van de recombinante isovormen van AC parallel die kenmerken described voor het bestuderen van endogene isovormen van AC. Specifiek, heeft eerder onderzoek gevonden dat de activering van Gai / o eiwitten en daaropvolgende afgifte / omlegging βγ subeenheden belangrijkste voorwaarden voor receptor geïnduceerde sensibilisatie van AC-isovormen. Bovendien zijn een aantal studies suggereren dat het signaleren van proteïne kinasen en Gβγ subeenheden zijn betrokken bij overgevoeligheid 2,11-13. Individuele AC ook weer unieke en aparte sensibilisatie patronen 12. Zo is aanhoudende blootstelling D 2 receptoren agonisten geassocieerd met overgevoeligheid van AC1 en AC8 Ca 2 + / calmoduline stimulatie 14,15, terwijl de nauw verwante AC3 niet gesensibiliseerd 2. AC2, AC4, en AC7 zijn nauw verwant, echter alleen PKC-gestimuleerde AC2 groei robuust lichtgevoelig na langdurige blootstelling van D2 receptoren agonisten 7,14,16,17. Daarnaast AC5 en AC6 tonen een aanzienlijke mate van heterologous sensibilisatie voor Gas-en-forskoline gestimuleerde cAMP accumulatie na activatie van D 2 receptoren 14,18-20, maar lijken te verschillen in hun behoefte aan Gβγ subunit-AC interacties 21. Hoewel de meeste studies van AC sensibilisatie model cellijnen (bijv. HEK293 cellen die individuele AC-isovormen) gebruikt, blijkt dat deze bevindingen vertalen naar natieve neuronale celmodellen 4,22. Meer recent, kunnen de effecten van AC isovorm selectieve remmers van kleine moleculen die in HEK293 cellen die AC-isovormen worden vertaald in vivo gedragsonderzoek 23.

Het ontbreken van een geïdentificeerde moleculaire mechanisme voor heterologe sensibilisatie waarschijnlijk weerspiegelt de complexiteit van de adaptieve respons en de unieke regulerende eigenschappen van de individuele AC-isovormen 12. Het ontrafelen van een dergelijke complexiteit wordt verder gecompliceerd door het gebruik van de methode omslachtig thoed heeft beperkte academische onderzoekers van dienst onpartijdige benaderingen. Bijvoorbeeld, onze vorige mechanistische studies betrof het gebruik van continu gekweekte cellulaire modellen met 24 - en 48-well weefselkweek formaat 15. Gekweekte cellen werden meestal gekweekt gedurende 48 uur en vervolgens onderworpen aan agonist behandeling (2-18 uur), gevolgd door een reeks van cel wassingen en incubaties (figuur 1). AC-isovorm specifieke cAMP protocols werden vervolgens toegepast gevolgd door meting van cAMP via een omslachtige en tijdrovende [3H] cAMP bindende methodologie 15,24. De duur van begin tot eind voor elke assay algemeen vereist een totaal van vier tot vijf dagen van cel plateren gegevensanalyse (figuur 1). De toepassing van nieuwe technologieën en automatisering heeft geleid tot duidelijke verbeteringen voor sensibilisatie studies in de industriële en HTS centrum setting. Bijvoorbeeld, een groep die werkt met het National Center for Chemical Genomics meldde een tweedaagse HTS testprocedure voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren van μ opioïd receptor geïnduceerde sensibilisatie in 1536-well formaat 25.

Het huidige artikel beschrijft onze inspanningen om een ​​HTS-test voor studies van heterologe sensibilisatie met behulp van technologieën die beschikbaar zijn op de meeste academische onderzoeksinstellingen ontwikkelen. Deze strategie werd bereikt door de integratie van het gebruik van cryogeconserveerde cellen uit cel modellen heteroloog tot de uiting van de D2 dopamine receptor in combinatie met endogene of individuele recombinante adenylylcyclase isovormen (CHO-D 2L of HEK-AC6 / D 2 L). Om onze doorvoer te verbeteren, hebben we onze vernieuwde 48 en sensibilisatie assay (ca.> 20 treden meer dan 4-5 dagen) een vijf-stap, dag assay in 384-well formaat, dat was in wezen "mixen en te lezen". De nieuwe indeling maakt gebruik van een commercieel verkrijgbare homogene tijdopgeloste fluorescentie (HTRF) test om cAMP acc metenumulation in intacte cellen met een multi mode plaat lezer. De test is robuust en vatbaar voor kleine molecuul screening, en kunnen effectief worden toegepast voor het screenen op remmers van heterologe sensibilisatie. Daarnaast bieden wij de gegevens die het gebruik van deze test met reverse transfectie van siRNA voor gerichte of genome wide siRNA bibliotheek screening met slechts een geringe wijziging in de algemene aanpak maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Uitbreiding en cryopreservatie van Assay Ready Cells

  1. Cultuur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) cellen op een 15 cm 2 celkweek schotel in Ham's F12 medium aangevuld met 1,0 uM L-glutamine, 800 ug / ul G418, 300 ug / ul hygromycine, 100 U / gl penicilline, 100 ug / ul streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS).
  2. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 totdat de cellen 90-95% confluent. Was de cellen met 10 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en oogst de cellen door toevoeging van 3 pi cel dissociatie buffer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Resuspendeer de cellen met 12 ul van het kweekmedium en tel cellen met trypan blauw exclusie.
  3. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 pl ijskoud medium (10% dimethylsulfoxide, 90% FBS). Verdun de celsuspensie om de gewenste celconcentratie (bijv. 1-20 x 10 6 cellen / ul) bereiken.
  4. Aliquot 1,0 pi celoplossing elke cryovial. Incubeer de cryovials in een cel container bevriezen bij -80 ° C overnacht. Breng de cryovials een vloeibare N 2 tank voor lange termijn opslag.

2. Plating Assay Ready Cells (en Reverse transfectie Option)

  1. Snel ontdooien van een bevroren cryovial cellen in een 37 ° C waterbad. Wanneer cellen worden ontdooid, dragen de cellen om een ​​15 pl conische buis met 9 pl Opti-MEM en meng door de buis 3-5x.
  2. Centrifugeer de cellen bij 500 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 pl Opti-MEM.
  3. Tel de cellen met behulp van trypanblauwexclusie levensvatbaarheid van de cellen te bepalen en verdun de levensvatbare cellen als nodig (bv. 3 x 10 5 cellen / ul concentratie) inOpti-MEM. Plaat 10 ul / putje van cellen in een weefselkweek behandeld 384-wells plaat met behulp van een multichannel pipet.
  4. Maak seriële verdunningen van cAMP in Opti-MEM om een ​​standaardcurve te schatten cAMP-productie door de cellen te genereren (volgens de aanbevelingen van de fabrikant - zie hoofdstuk 7). Voeg 10 ul / putje van de cAMP standaarden aan de plaat. Opmerking: een standaard curve kan worden bereid op een afzonderlijke plaat of blanco putjes op een van de testplaten.
  5. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 ° C bij een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 1 uur.

3. Reverse siRNA transfectie Option *

Deze sectie is optioneel en relevant figuur 3.

  1. Bereid een oplossing van siRNA in RNase-vrij DDH 2 O (bijv. 0,4 pmol / pl). Voeg 5 ul aan individuele putjes van 384-well plaat, en centrifuge de plaat bij 100 xg gedurende 15 sec bij kamertemperatuur.
  2. Verdun Lipofectamine 2000 in Opti-MEM met een factor 0.006 (bijv. commentaar 6 pl Lipofectamine 2000 tot 1000 pl Opti-MEM), en meng door en neer te pipetteren.
  3. Incubeer de Lipofectamine 2000/Opti-MEM oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Voeg 5 ul van de verdunde Lipofectamine 2000/Opti-MEM oplossing voor individuele putjes van 384-wells plaat die al bevat siRNA. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur.
  4. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  5. Plaatassay klaar cellen zoals hierboven (hoofdstuk 2) beschreven. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur.
  6. Terug assayplaat naar bevochtigde incubator bij 37 ° C (5% CO 2) voor 48-96 uur zoals bepaald voor gerichte gen knock down (zie bespreking).

4. Small Molecule Screening

  1. Verdun het middel van belang (bijvoorbeeld. Klein molecuul-remmers) in Opti-MEM om de gewenste eindconcentraties 6x. Seriële verdunningen kan worden ingevuld met behulp van hand-held pipetten of een liquid handling station.
  2. Voeg 2,5 ul / putje van de testverbinding of buffer bevattende voertuig (bijv. DMSO) aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet.
  3. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur (incubatie is optioneel).

5. Persistent Agonist Behandeling

  1. Bereid een 600 nM (dwz. 6 keer de gewenste uiteindelijke concentratie van 100 nM) oplossing van quinpirole in Opti-MEM.
  2. Voeg 2,5 ul / putje van de 600 nM quinpirole oplossing aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet.
  3. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 2 uur.

6. Stimulatie van cAMP accumulatie

  1. Tijdens de 2 uur incubatie, bereiden de stimulation oplossing in Opti-MEM. De stimulatie oplossing bestaat uit 40 uM forskoline, 2 uM 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), en 4 uM spiperon (alle concentraties in stap 6 worden 4x de gewenste eindconcentratie).
  2. Voeg 5 ul / putje van de stimulatie oplossing aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet.
  3. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.

7. Afschrikken en Schatting van cAMP accumulatie

  1. De productie van cAMP door de cellen wordt gemeten met de cAMP dynamische 2 kit volgens instructies van de fabrikant. In het kort, reconstrueren anti-cAMP-cryptaat en cAMP-d2 in gedestilleerd water. Freeze fracties bij -20 ° C gedurende korte termijn opslag.
  2. Verdun een aliquot van anti-cAMP-cryptaat en een aliquot van cAMP-D2 afzonderlijk in de lysis buffer volgens de instructies van de fabrikant be-oplossingen.
  3. Eendd 10 ul / putje van anti-cAMP-cryptaat werkende oplossing en 10 gl / putje van de cAMP-d2 werkoplossing de 384-wells plaat met een multichannel pipet.
  4. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  5. Lees de plaat in een fluorescentieplaatlezer (automatische schaal instelling voor gevoeligheid) met behulp van een excitatie van 337 nm en bij 620 nm en 665 nm per maatregel de uitstoot produceert instructies.
  6. Solliciteer ratiometrisch analyse om te beoordelen cAMP standaard curve per instructies van de fabrikant. De resulterende waarden extrapoleren de geschatte cAMP in de test wells met gegevensanalyse software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deel I. Het ontwikkelen van een 384 goed heterologe overgevoeligheid test voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren met een algemeen verkrijgbare cel model.

Om heterologe sensibilisatie studeren in een cel model, hebben we een aantal verbeteringen die ons in staat om de test te stroomlijnen in een "mix en lees" formaat. Enkele belangrijke aanpassingen zijn hieronder aangegeven en worden in meer detail in de discussie. De eerste belangrijke stap wijzigd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In een poging om studies van heterologe sensibilisatie te vergemakkelijken, hebben we behoorlijk gemodificeerd onze vorige methode het bereiken van een gestroomlijnd "mix en lees" formaat dat amendeerbaar naar high-throughput screening en werkingsmechanisme onderzoek. De belangrijkste wijzigingen in ons protocol kan als volgt worden samengevat: 1) het gebruik van cryogeconserveerde cellen als "test klaar" reagentia, 2) de miniaturisatie van de assay in 384 putjes, en 3) het gebruik van de meting van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag aan de heer Richard Zink en Todd Wiernicki erkennen voor methodologische training en test begeleiding. We danken ook John Paul Spence voor zorgvuldige lezing en redactionele suggesties. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, en Eli Lilly and Company door de Lilly Research Award Program (LRAP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CHO-K1-DRD2L cellenDiscoveRx930579C2
Ham’s F12 mediaVWRSH30026fs
Fetaal bovien serumVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HygromycinFisher50-230-5556
Penicillin/streptomycineLife Technologies15070063
15 cm schalenBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
Cell dissociatie bufferLife Technologies13150016
Fosfaat Buffered SalineLife Technologies10010-049
CryovialsFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC behandelde 384-well platenPerkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
(±)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperonSigmaS7395
ClozapineSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-)SulpirideSigmaS112
Lipofectamine 2000 transfectie reagensInvitrogen11668019
Trypan blauwLife TechnologiesT10282
Water, DNase- en RNase-vrijMP Biomedicals821739
Gas siRNADharmaconcustom siRNA
Nontargeting siRNA controleDharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02

Referenties

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Sensitisatie van adenylylcyclasecAMP accumulatie assayhigh throughput screening384 wells formaatcryopreserveerde cellenHTRF detectiescreening van kleine moleculensiRNA reverse transfectieD2 dopaminereceptorbehandeling met quinpirol
Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.