Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

17.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51220

⸱

11 april 2014

 , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

In dit artikel

Samenvatting

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

Samenvatting

Chromatine is een zeer dynamische nucleoproteïne complex van DNA en eiwitten die verschillende DNA-afhankelijke processen regelt. Chromatinestructuur en functie op specifieke gebieden wordt geregeld door de plaatselijke verrijking van histon post-translationele modificaties (hPTMs) en varianten, chromatine-bindende eiwitten, waaronder transcriptiefactoren en DNA methylatie. De proteomics karakterisering van chromatine samenstelling op verschillende functionele gebieden tot dusver is gehinderd door het ontbreken van efficiënte protocollen om dergelijke domeinen te verrijken op de juiste zuiverheid en voor de daaropvolgende diepgaande analyse door massaspectrometrie (MS). We beschrijven hier een nieuw ontworpen chromatine proteomics strategie, genaamd ChroP (Chro matin P roteomics), waarbij een preparatieve chromatine immunoprecipitatie wordt gebruikt om verschillende chromatine gebieden waarvan de kenmerken qua hPTMs, varianten en co-geassocieerde derde histonic eiwitten te isoleren, zijn door MS geanalyseerd. We illustreren hijre het opzetten van ChroP voor de verrijking en analyse van transcriptioneel stille heterochromatic regio, gekenmerkt door de aanwezigheid van tri-methylatie van lysine 9 op histon H3. De behaalde resultaten tonen het potentieel van ChroP in grondig karakteriseren van de heterochromatin proteoom en bewijzen dat het als een krachtige analytische strategie om te begrijpen hoe de verschillende eiwit determinanten van chromatine interactie en synergie te locus-specifieke structurele en functionele configuraties vast te stellen.

Inleiding

Chromatine is een zeer dynamische nucleoproteïne complex dat betrokken als primaire template voor DNA-gemedieerde processen. Het nucleosoom is de basis herhaalde eenheid van chromatine en bestaat uit een eiwitachtig octamère kern met twee moleculen van elk canonieke histon H2A, H2B, H3 en H4, waaromheen 147 bp DNA verpakt 1,2. Alle kernhistonen zijn gestructureerd als een bolvormige domein en een flexibele N-terminale "staart" die buiten de nucleosome uitsteekt. Een van de belangrijkste mechanismen voor het reguleren chromatinestructuur en dynamica is gebaseerd op covalente post-translationele modificaties (PTMs), die voornamelijk voor de N-termini van histonen 3,4. Histon modificaties kunnen functioneren hetzij door wijziging van de hogere orde chromatinestructuur door verandering contacten tussen histon-DNA of tussen nucleosomen en daarmee de toegankelijkheid van DNA-bindende eiwitten (cis mechanismen) regelen, of door als Docking sites voor regulerende eiwitten, hetzij als afzonderlijke eenheden, of ingebed in multimere complexen. Dergelijke regulerende eiwitten hun functie in verschillende manieren: door direct moduleren van genexpressie (bijvoorbeeld TAF eiwitten), of door het veranderen van de nucleosoom positionering (dwz chromatine complexen) of door het modificeren van andere histon residuen (bijvoorbeeld eiwitten met methyl-transferase of acetyl- transferase activiteit) (trans mechanismen) 5. De observatie dat verschillende PTM patronen cluster op specifieke chromatine loci geleid tot de uitwerking van de hypothese dat verschillende wijzigingen op verschillende plaatsen kan synergize een moleculaire code bemiddelen van de functionele staat van de onderliggende DNA te genereren. De "histoncode hypothese" heeft opgedaan grote consensus in de jaren, maar haar experimentele verificatie is tegengehouden door technische 6,7 beperkingen.

Massaspectrometrie (MS)-gebaseerde proteomics heeft ontpopt als eenkrachtig hulpmiddel om histonmodificatie patronen in kaart en chromatine-bindende eiwitten 8 karakteriseren. MS detecteert een wijziging als een specifieke Δmass tussen de experimentele en theoretische massa van een peptide. Op het niveau van individuele histonen, MS biedt een onbevooroordeelde en uitgebreide methode in kaart PTMs, waardoor de detectie van nieuwe veranderingen en onthullende wisselwerkingen tussen hen 9-14.

De laatste jaren zijn een aantal strategieën ontwikkeld om het proteomische samenstelling van chromatine ontleden, zoals de karakterisatie van intacte mitotische chromosomen 15, de identificatie van oplosbare Hptm bindingseiwitten 16-18 en de isolatie en analyse van specifieke chromatine gebieden (dwz telomeren) 19,20. Uit het onderzoek van de locus-specifieke synergieën tussen histon PTMs, varianten, en chromatine-geassocieerde eiwitten is nog onvolledig. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak, genaamd ChroP (Chro matin P roteomics) 21, die we hebben ontwikkeld voor het efficiënt karakteriseren functioneel verschillende chromatine domeinen. Deze aanpak past chromatine immunoprecipitatie (chip), een gevestigde protocol dat wordt gebruikt in epigenetisch onderzoek, voor de efficiënte MS-gebaseerde proteomics analyse van het verrijkte monster. We hebben twee verschillende protocollen ontwikkeld, afhankelijk van het type chromatine als input en door de lidstaten gemaakte vraag; in het bijzonder: 1) chip van de losgemaakte inheemse chromatine geknipt met MNase wordt gebruikt om mono-nucleosomen te zuiveren en de co-associëren hPTMs (N-ChroP) ontleden; 2) ChIP verknoopt chromatine gefragmenteerd door sonificatie wordt gebruikt in combinatie met een SILAC gebaseerde strategie interactomics alle co-verrijken chromatine bindende eiwitten (X-ChroP) te karakteriseren. We illustreren hier de combinatie van N-en X-ChroP voor het verrijken en het bestuderen heterochromatin, gebruik H3K9me3 als aas voor de immunoprecipitatie stappen. Het gebruik van ChroP kunnen worden uitgebreidofwel verschillende regio's op chromatine, of veranderingen in het chromatine samenstelling binnen dezelfde regio tijdens de overgang naar een andere functionele staat te bestuderen, waardoor de weg vrij voor verschillende toepassingen in de epigenetica.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celkweek

  1. Standaard medium voor inheemse ChIP
    1. Groeien HeLa cellen in gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% glutamine, 1% Pen / Strep en 10 mM HEPES pH 7,5.
  2. SILAC etikettering voor het verknopen van ChIP
    1. Groeien HeLa cellen in SILAC DMEM medium uitgeput van lysine en arginine, aangevuld met 10% gedialyseerd FBS, 1% glutamine, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5 en ofwel de lichte L-lysine (Lys 0) en L- arginine (Arg 0) of hun zware tegenhangers, L-lysine (Lys 8) en L-arginine (Arg 10) (Materialen tabel), bij eindconcentraties van 73 mg / L en 42 mg / L, respectievelijk.
    2. Groei cellen voor maximaal acht generaties SILAC medium tot volledige-isotoop gecodeerde aminozuren incorporatie waarborgen. Pass cellen om de twee dagen, bij het ​​bereiken van een dichtheid van 1,0-1,5 x 10 6 cellen / ml, ze zaaien bij aconcentration van 3 x 10 5 cellen / ml.
    3. Evalueer groei cellen en levensvatbaarheid in SILAC medium om eventuele wijziging van de fysiologie die kunnen voortvloeien uit de armere samenstelling van het SILAC medium individualiseren; om dit te doen:
      1. Inspecteer visueel cellen morfologie bij de microscoop elke dag tijdens de etikettering.
      2. Tellen cellen en groei plot rondingen van cellen groeien in SILAC versus standaard medium.

2. Inheemse Chromatine immunoprecipitatie (N-chip)

  1. Kernen voorbereiding van gekweekte cellen
    1. Gebruik 1-2 x 10 8 ongelabelde HeLaS3 cellen per experiment. Oogst cellen, maak monster van 50 x 10 6 cellen in 50 ml en centrifugeer bij 340 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, wassen met ijskoude PBS.
    2. Resuspendeer elk celpellet in 8 ml Lysis Buffer (Tabel 1) en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C op een roterend wiel. Giet carefully elke cellulaire lysaat op een sucrosekussen (tabel 1) en centrifuge in een swing-out rotor, bij 3270 xg gedurende 20 min bij 4 ° C, om kernen te scheiden van cytoplasma.
    3. Gooi bovenstaande vloeistoffen, houden nucleaire pellets en was ze tweemaal in ijskoud PBS door centrifugeren, gooi supernatant bij elke wasbeurt.
  2. Micrococcal Nuclease (MNase) spijsvertering (kleinschalig) en kwaliteitscontrole van chromatine na vertering
    1. Resuspendeer de gewassen nucleaire pellet in 1 ml Digestion Buffer (tabel 1); verdelen in twee porties van 500 pl en blijf op ijs.
    2. Meet de optische dichtheid (OD) bij 260 nm van een monster, verdund 1:200 in 0,2% natriumdodecylsulfaat (SDS). Opmerking: OD = 1 komt overeen met ongeveer 50 ug / ml van chromatine DNA. Typisch vanaf 2 x 10 8 cellen, de OD in het bereik van 40-60.
    3. Neem 1% kernen, voeg MNase enzym tot een uiteindelijke concentratie van 0.005 U enzym / ul kernen en incubeer bij 37 ° C gedurende verschillende tijd verstrijkt (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. Op elk tijdstip, verzamel 4 pi geknipt kernen en voeg 1 mM EDTA aan het MNase reactie te stoppen. Blijf op ijs.
    5. Extraheer DNA-monsters door PCR zuivering kit en elueren ze in 50 pi TE-buffer (Tabel 1).
    6. Neem 20 pi van elk DNA-monster, voeg 10 pl laadbuffer (tabel 1) en plaats de monsters op 1% (w / v) agarosegel bevattende ethidiumbromide, met PCR teller als een maat controle.
    7. Controleer de spijsvertering evaluatie van het chromatine nucleosome ladder geproduceerd door MNase incubatie.
    8. Kies de optimale tijd voor de spijsvertering, gebaseerd op de prevalentie van mono-nucleosomen in het preparaat. . Typisch voor 0.005 U enzym / ul van kernen het optimale tijdstip van MNase spijsvertering is 60 min (Figuur 1B, linkerpaneel) Opmerking: De optimale MNase concentratie / tijd van digestiop kan worden aangepast aan de gewenste celtype en van de grootte van nucleosomen stretch.
  3. Large-scale/preparative MNase spijsvertering en herstel van oplosbare chromatine fracties
    1. In elk monster (zie 2.2.1) 5 pl MNase, overeenkomend met een uiteindelijke concentratie van 0,005 U enzym / ul kernen; Meng voorzichtig en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten (of in het algemeen voor de optimale tijdsinterval, gebaseerd op kleine schaal test).
    2. Voeg 1 mM EDTA om de reactie te stoppen en blijf op ijs. Pellet de gedigereerd kernen door centrifugeren bij 7800 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Breng de supernatanten (fractie S1) in een nieuwe buis en opgeslagen bij 4 ° C. Opmerking: S1 bevat de eerste oplosbare fractie van chromatine, omvattende mono-nucleosomen. Voeg de proteaseremmers (tabel 1).
    3. Zorgvuldig mengen pellets in 1 ml dialysebuffer (tabel 1) en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C (cut off van de dialyse buis is 3,5 kDa), in 3 L dialysebuffer, met een constante milde roeren. Verzamel gedialyseerde materiaal en centrifugeer bij 7800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande (S2 fractie) in een nieuw Eppendorf buis en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: S2 omvat di-EPTA-nucleosomen, afhankelijk MNase vertering mate.
  4. Kwaliteitscontrole van chromatine voordat immunoprecipitation
    1. Breng een hoeveelheid overeenkomend met 5 ug S1 en S2 chromatine fracties (gekwantificeerd door meting van de OD bij 260 nm in een NanoDrop systeem). Extraheer DNA door PCR zuivering kit en elueren in 50 pl TE-buffer (Tabel 1).
    2. Neem 20 pi S1 en S2 DNA mengen met 10 gl laadbuffer (tabel 1) en plaats ze op 1% (w / v) agarosegel. Controleer de kwaliteit en efficiëntie van MNase spijsvertering door visuele inspectie van de nucleosomen ladder. Opmerking: Fraction S1 is zeerverrijkt in mono-nucleosomen, terwijl fractie S2 bevat voornamelijk poly-nucleosomen (Figuur 1B, rechter paneel).
  5. Incubatie van chromatine met antilichaam
    1. Bewaar bij -20 ° C 50 pl S1 fractie voor verdere massaspectrometrie analyse.
    2. Voeg 1 volume ChIP Dilution Buffer (Tabel 1) om fractie S1.
    3. Voeg het antilichaam tegen het Hptm (of eiwit) van belang; incubeer overnacht op een draaiend wiel bij 4 ° C. Opmerking: Typisch gebruik 10 ug tot 20 ug antilichaam gedurende 2 x 10 8 cellen. De optimale verhouding tussen de hoeveelheid antilichaam en uitgangscellen nummer moet zorgvuldig worden per geval bepaald, afhankelijk van de hoeveelheden van de Hptm / proteïne als aas in het monster en het antilichaam efficiëntie. Optimalisatie experimentele basis van de volgende proeven:
      1. Vergelijk de hoeveelheid Hptm / eiwit van belang tussen input en doorstroom (FT,zie 2.7.2) door Western Blot of MS om te controleren of de immunoprecipitatie verrijkt een aanzienlijk deel van de specifieke chromatine regio. Opmerking: Dit wordt in het algemeen bereikt wanneer ten minste 50% van de Hptm / eiwit aas is uitgeput in de FT (figuur 1C) .
      2. Controleer of de immunologisch eiwit van belang detecteerbaar op SDS-PAGE-gel die ervoor zorgt dat voldoende materiaal beschikbaar is voor MS analyse. Opmerking: De aanwezigheid van de gel van de band van de vier kernhistonen op de juiste stoïchiometrie geeft aan dat het intacte nucleosoom is immunologisch door N-ChroP (figuur 1D). Gebrek aan de juiste stoichiometrie is in feite een indicatie van een gedeeltelijke verstoring / ontvouwen van de nucleosoom.
    4. Tegelijkertijd bereiden de eiwit-G gekoppelde magnetische korrels (zie 2.6).
  6. Equilibration en afscherming van eiwit-G gekoppelde magnetische korrels
    1. Equilibreer 100 pl proteïne G-gekoppelde magnetische korrels slurry in Blocking Solution (tabel 1), driemaal wassen en incuberen gedurende de nacht bij 4 ° C op een roterend wiel. Opmerking: Na de bindingscapaciteit van kralen, gebruiken 100 ul suspensie voor 2-20 ug antilichaam.
    2. Was de geblokkeerde parels eenmaal met blockingbuffer en vervolgens tweemaal met ChIP Dilution Buffer (Tabel 1).
  7. Isolatie van chromatine via magnetische partikels
    1. Voeg 100 ul van geblokkeerde parels aan de S1 chromatine monster en incubeer ze op een draaiend wiel bij 4 ° C gedurende 3 uur. Centrifugeer bij 340 xg gedurende 1 min verminderde snelheid van de monster van het deksel van de uiteinden. In een magnetische rek om de kralen pellet.
    2. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe Eppendorf buis. Dit is de stroom door (FT), namelijk de fractie van chromatine die niet binden aan antilichaam.
    3. Was de kralen vierkeer in wasbuffer (tabel 1) verhoging van de zoutconcentratie bij elke wasbeurt (75, 125 en 175 mM NaCl).
    4. De immunologisch chromatine elueren, incubeer de kralen in 30 ui LDS monsterbuffer, aangevuld met 50 mM dithiothreitol (DTT) gedurende 5 min bij 70 ° C. Scheid de eiwitten geëlueerd op een 4-12% Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE pre-cast gradiëntgel en vlekken op de gel met colloïdaal Coomassie kleuring kit (figuur 1D).

3. Crosslinking Chromatine immunoprecipitatie (X-chip)

  1. Verknoping van cellen met formaldehyde
    1. Voeg 0,75% formaldehyde-SILAC gemerkte cellen, meng kort en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Doof het formaldehyde door toevoeging 125 mM glycine en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    2. Verdeel cellen in 5 x 10 7 porties; spoel ze drie keer met ijskoude PBS door centrifugeren bij 430xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en werp de supernatant na elke wasbeurt. Bij de laatste wasbeurt, gooi supernatant en houden de pellet. Opmerking: Als cellen verknoopt, kunnen ze opgeslagen bij -80 ° C, indien niet onmiddellijk wordt gebruikt.
  2. Kernen voorbereiding
    1. Resuspendeer elk celpellet in 10 ml Lysis Buffer (Tabel 1). Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C onder rotatie. Centrifugeer bij 430 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de bovenstaande vloeistoffen; houden nucleaire pellets.
    2. Resuspendeer elke nucleaire pellet in 10 ml wasbuffer (tabel 1). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min op een roterend wiel.
    3. Centrifugeer bij 430 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de bovenstaande vloeistoffen en het verzamelen van de pellets.
    4. Resuspendeer elke nucleaire pellets in 3 ml ChIP incubatiebuffer (tabel 1). Blijf op ijs.
  3. Chromatine sonicatie en kwaliteitscontrole
    1. Sonicaat ch. romatin bij 200 W (cycli van 30 sec "aan" en 1 min "off"), in een gekoelde Bioruptor, chromatine fragmenteren Opmerking: het aantal cycli en sonicatie intervallen afhankelijk van het celtype en de gemiddelde duur van nucleosomale stretch gewenst. Typically, 30 min. sonicatie noodzakelijk om DNA fragmenten van 300-500 bp in lengte te genereren, corresponderend met di-en tri-nucleosomen. De keuze van de fragmenten hangt af van de aard van chromatine domein onderzocht.
    2. Neem 2% van de totale invoer in omgekeerde verknoping door incubatie bij 65 ° C gedurende ten minste 1 uur bij ChIP incubatiebuffer. Pak het DNA door PCR zuivering kit, elueren in 50 ui TE-buffer en laad de DNA op agarosegel om chromatine fragmentatie controleren.
  4. Incubatie van chromatine met antilichaam
    1. Voeg 1/10 volume 10% Triton X-100 aan gesoniceerd chromatine. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet debris.
    2. Spaar 50 ul van chromatine input van zware cellen voor het testen van de integratie niveau van SILAC aminozuren in gelabelde cellen en voor eiwit profilering.
    3. Voeg het antilichaam van keuze om de resterende zware en lichte gelabeld gesoniceerd chromatine en incubeer overnacht bij 4 ° C op de draaiende schijf. In het licht kanaal, voeg ook een overmaat vouw van de oplosbare peptide. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een roterend wiel. Opmerkingen: De optimale conditie tussen ug antilichaam en het uitgangsmateriaal van cellen gekozen geval tot geval, zoals besproken in 2.5.3. De optimale voudige overmaat molariteit van de oplosbare peptide ten opzichte van het antilichaam moet zorgvuldig worden getitreerd per geval.
  5. Isolatie van chromatine via magnetische partikels
    1. Equilibreer en blokkeren eiwit-G gekoppelde magnetische korrels door de stappen in 2.6 beschreven en met behulp van chip Incubation Buffer.
    2. Voeg 100 ul van geblokkeerde bEADS chromatin monsters en incubeer op een roterend wiel gedurende 3 uur bij 4 ° C. Centrifugeer bij 340 xg gedurende 1 min verminderde snelheid van de monster van het deksel van de uiteinden. In een magnetische rek om de kralen pellet. Het supernatant is de stroom door (FT), die ongebonden nucleosomen. Was kralen viermaal wasbuffer (tabel 1) met toenemende zoutconcentratie (twee wasbeurten bij 150 mM en twee bij 300 mM NaCl).
    3. Incubeer kralen in 30 pl SDS-PAGE geladen Sample Buffer (Tabel 1) en gedurende 25 min bij 95 ° C geëlueerd en de-verknopen de immunologisch neergeslagen eiwitten. Afzonderlijke eiwitten op 4-12% Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE pre-cast gels (figuur 3D).

4. Monstervoorbereiding Voorafgaand aan MS

  1. In-gel digestie van histonen verrijkt N-chip
    Opmerking: Tijdens de vertering van eiwitten en peptiden extractiestappen verzorgenkeratine verontreinigingen die interfereren met LC-MS/MS, zoals eerder beschreven 22, 23 te minimaliseren.
    1. Cut gelstukjes overeenkomt met de kernhistonen banden (figuur 1D). De vlek-de gelstukken met 50% acetonitril (ACN) in DDH 2 O, afgewisseld met 100% ACN om de gel krimpt. Herhaal dit tot gels stukken zijn volledig de-gekleurd en droog ze in een vacuüm centrifuge.
    2. D 6-azijnzuur anhydride commentaar 1:09 (v / v) 1 M ammoniumbicarbonaat (NH 4 HCO 3) (typisch het eindvolume is 60-100 ul) en 3 pl natriumacetaat (CH3COONa) als katalysator. Incubeer 3 uur bij 37 ° C onder krachtig schudden. Opmerking: Het monster kan na montage van de reactie bellen in de eerste minuten genereren: het van belang te behandelen voorzichtig en laat het gegenereerde gas, die van tijd tot tijd de buizen tijdens incubatie.
    3. Spoel de gel stukken meerdere malen wet NH 4 HCO 3, afgewisseld met ACN bij stijgend percentage (van 50% tot 100%), teneinde resten van D-6 azijnzuuranhydride volledig te elimineren.
    4. Verklein de gel stukken in 100% ACN; drogen in een vacuüm centrifuge complete de-hydratatie te garanderen. Re-hydraat gelstukken met ijskoude 100 ng / ul trypsine-oplossing in 50 mM NH 4 HCO 3 en incubeer overnacht bij 37 ° C. Opmerking: De combinatie van chemische modificatie van lysines met gedeutereerde azijnzuuranhydride en trypsine digestie genereert een "Arg- C-achtige "in gel verteringpatroon van histonen 21,24.
    5. Gooi de overtollige oplossing en voeg een hoeveelheid van 50 mM NH 4 HCO 3 volledig te bedekken de gelstukken; incubeer overnacht bij 37 ° C.
    6. Verzamel oplosbaar verteerd peptiden in een nieuw Eppendorf buis. Lyofiliseren peptiden. Resuspendeer ze in 0,5% azijnzuur acid/0.1% trifluorazijnzuur (TFA). Ontzouten en concentrerenpeptiden op een omgekeerde fase C 18 / Carbon "sandwich" en ionenuitwisselingschromatografie (SCX) op handgemaakte microkolommen (StageTip) 25.
    7. Bereid de StageTip microkolommen door er Teflon meshwork schijven met geïmmobiliseerd C 18 / Koolstof ("sandwich") en SCX kralen in een 200 ul tips. Het verkrijgen van de "sandwich" door het laden van de C 18 microkolom bovenop een tweede tip geladen met koolstoffilter. Opmerking: De zeer korte peptiden, die niet op de C 18-filter worden vastgehouden, pas in de flow-through die direct op wordt geladen de Carbon Tip, die doorgaans vangt hen. SCX StageTips kan verrijken specifieke peptiden, zoals H3 (3-8) peptide, niet efficiënt bewaard door omgekeerde fase chromatografie.
    8. Belasting 50% van peptiden op de C 18 / Carbon "sandwich StageTip" en 50% op SCX StageTips. Elueren ze van de C 18 / Carbon Tips behulp van 80% ACN/0.5% azijnzuur acid en de SCX Punten met 5% ammoniumhydroxide (NH4OH) / 30% methanol. Na vriesdrogen, resuspendeer peptiden in 0,1% FA en te analyseren door LC-MS/MS.
  2. In-gel Spijsvertering van immuungezuiverd eiwitten
    In-gel vertering van eiwitten wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven 22 uitgevoerd, met kleine aanpassingen.
    1. Snijd elke baan in tien plakjes (Figuur 3D) en elke plak in kleine blokjes van 1 mm 3. De vlek-de gelstukken met 50 mM NH 4 HCO 3/50% ethanol en voeg absolute ethanol aan de gels krimpen. Herhaal dit totdat de gels zijn volledig de-gekleurd.
    2. Voeg reductie buffer (tabel 1) om de gel stukken gedurende 1 uur bij 56 ° C, gevolgd door de toevoeging van alkylering buffer (tabel 1) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was en droog de gel stukken in vacuüm centrifuge.
    3. Rehydrateren de gel stukken met ijskoude 12,5 ng / ul trypsine solution in 50 mM NH 4 HCO 3 en incubeer op ijs tot volledige rehydratie van de gel stukken. Verwijder trypsine in overmaat.
    4. Voeg 50 mM NH 4 HCO 3 volledig te bedekken de gelstukken. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
    5. Verzamel de vloeibare deel. Voeg de extractiebuffer (tabel 1) om de gel stukken; incuberen met sterke schudden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Tweemaal herhalen.
    6. Incubeer de gelstukken in ACN gedurende 10 min onder krachtig roeren. Tweemaal herhalen en bundelen alle bovenstaande vloeistoffen.
    7. Lyofiliseren de peptiden. Resuspendeer gedroogd peptiden in 0,5% azijnzuur acid/0.1% TFA.
    8. Ontzouten en concentreren peptiden op een omgekeerde fase C 18 StageTip, zoals beschreven 26, 27.
    9. Elueer peptiden uit de C 18 StageTip met 80% ACN/0.5% azijnzuur. Verwijder het organische oplosmiddel door verdampen onder vacuüm centrifuge en resuspendeer de peptiden in 0,1% FA (typisch 5-10 &# 181; l), wanneer je klaar bent om de MS-analyse.

5. LC-MS Analysis

  1. Vloeistofchromatografie-analyse
    1. Verpak de analytische kolom in een 15 cm fused silica emitter (75 urn inwendige diameter 350 urn buitendiameter) met omgekeerde fase (RP) C 18, 3 urn hars in methanol bij een constante helium druk (50 bar) met een bom-loader apparaat, zoals eerder 28 beschreven.
    2. Paar het gepakte emitter (C18 RP kolom) bij de uitlaat van de 6-wegklep van de HPLC door een 20-cm (25 micrometer binnendiameter) kwartsglas zonder pre-kolom of split apparaat.
    3. Laad het verteerde peptiden C 18 RP-kolom bij een stroomsnelheid van 500 nl / min mobiele fase A (0,1% FA / 5% ACN in DDH 2 O).
    4. Na monster laden, scheiden de peptiden met de volgende hellingen:
      1. Solliciteer 0-40% mobiele fase B (0,1% FA/99% ACNin DDH 2 O) en 250 nl / min in 90 minuten gevolgd door een gradiënt van 40-60% in 10 min en 60-80% in 5 min, voor elutie van peptiden afkomstig van histonen (zie 2).
      2. Breng 0-36% mobiele fase B bij 250 nl / min op 120 min gevolgd door een gradiënt van 36-60% in 10 min en 60-80% in 5 min, voor elutie van peptiden die uit immuungezuiverd eiwitten (zie 3).
  2. Massaspectrometrie analyse met behulp LTQ-FT-ICR-Ultra massaspectrometer
    1. Opereren in een data-afhankelijke acquisitie (DDA) functie automatisch overschakelen tussen MS en MSMS acquisitie. MS volledige scan spectra worden verworven, meestal in de m / z variëren van 200-1,650, wordt verworven met een resolutie R = 100.000 op 400 m / z. De vijf (Top5) meest intense ionen worden geïsoleerd voor fragmentatie in de lineaire ion trap met een botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) bij een streefwaarde van 5.000.
    2. Gebruik de in tabel 2 fo genoemde parametersr de 'Tuning' overname bestand.
    3. Stel de standaard verwerving instellingen vermeld in Tabel 2.

6. Data Analysis

  1. Label gratis kwantificering van histonmodificaties co-verrijkt in chromatinedomeinen
    1. Zetten de verworven raw bestanden naar MGF bestanden met behulp Raw2msm software (versie 1.10) 29.
    2. Doorzoek het histonmodificaties behulp Mascot Deamon (versie 2.2.2), het instellen van de in tabel 3 beschreven parameters.
    3. Op de Mascot uitgang peptide lijst verwijderen peptiden met een score lager dan 15 of meer dan 5 vermeende PTMs 29. Opmerking: Voor elke afzonderlijke peptide ID, selecteer het peptide met de hoogste score Mascot en filteren alle andere overbodige peptiden met dezelfde ID .
    4. Teken de geëxtraheerde ion chromatogrammen (XIC) voor elke precursor correspondeert met elke gemodificeerde peptiden, based op de waarde m / z, met de QualBrowser. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) voor elke piek (figuur 2A).
    5. Valideren elke geïdentificeerde peptiden die wijzigingen door visuele inspectie van de MS / MS-spectra met behulp van de QualBrowser (Figuur 2B).
    6. Bereken de relatieve abundantie voor elke gewijzigde peptide. Bereken de relatieve verrijking van elke wijziging in de ChIP-ed materiaal. Opmerking: relatieve overvloed wordt berekend als een verhouding tussen de AUC van elk specifiek gemodificeerd peptide via som van AUC van de gemodificeerde en ongemodificeerde vormen van hetzelfde peptide, terwijl relatieve verrijking als een verhouding van de relatieve overvloed van de specifieke wijziging in de chip boven de ingang (figuur 2C).
  2. Kwantitatieve proteomics analyse van eiwitten co-verband binnen chromatinedomeinen
    1. Voor eiwitten identificatie en kwantificatie gebruik de MaxQuant pakket(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configureren van de ingebouwde zoekmachine "Andromeda" met de AndromedaConfig.exe 31 en stel de zoekparameters in tabel 3.
  3. Oprichting testen
    1. Schat de mate van integratie van zware aminozuren in eiwitten in zwaar-gemarkeerde chromatine-ingang, gebruik MaxQuant programmatuur, als hieronder:
      1. Stel de parameters zoals beschreven in 6.2, maar het uitschakelen van de re-kwantificeren optie.
      2. Bereken de opname vast voor de volgende formule om niet-redundante peptide ratio's:. Oprichting (%) = verhouding (H / L) / ratio (H / L) + 1 x 100 (Figuur 3B) Opmerking: Accepteer alleen als incorporatie> 95 %.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek om de lokalisatie van een eiwit of een histonmodificatie langs het genoom profiel. In een proteomics-equivalent, wordt ChIP gevolgd door MS-gebaseerde proteomics om kwalitatief en kwantitatief de hPTMs, histon varianten en chromatine-bindende eiwitten die aan elkaar zijn geïmmunoprecipiteerd met de wijziging of eiwit van belang, wordt gebruikt als "lokaas" te identificeren. In de N-ChroP benadering, beschreven in figuur 1A, inwoner ChIP, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben recent beschreven ChroP een kwantitatieve strategie voor de grootschalige karakterisering van de eiwitcomponenten van chromatine. ChroP combineert twee complementaire benaderingen gebruikt in de epigenetische veld, chip en MS, profiteren van hun sterke punten en het overwinnen van hun beperkingen. ChIP gekoppeld aan diepe sequencing (ChIP-Seq) maakt het genoom-brede kartering van histon modificaties aan de resolutie van enkele nucleosomen 35. Hoewel voordelig voor hun gevoeligheid, zijn op antilicha...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Mol Cell Proteomics. Soldi M. en Bonaldi T. De Proteomic Onderzoek van chromatine functionele domeinen Onthult Nieuwe synergieën tussen Verschillende Heterochromatine Components MCP. 2013; 12: 64-80. © de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Wij danken Roberta Noberini (Italian Institute of Technology en IEO, Italië) voor het kritisch lezen van het manuscript. TB werk wordt ondersteund door subsidies van de Giovanni Armenise-Harvard Foundation Career Development Program, de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. MS werk werd ondersteund door een FIRC fellowship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dialyzed FBSInvitrogen26400-044
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)Sigma AldrichL8662
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)Sigma AldrichA6969
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)Sigma Aldrich68041
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)Sigma Aldrich608033
Micrococcal NucleaseRoche10 107 921 001
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche04 693 132 001
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot lengthSpectrumlabs132720
QIAquick PCR purification kitQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP gradeAbcamab8898
Histone H3 peptide tri-methyl K9 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel InvitrogenNP0335BOX
Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
LDS Sample BufferInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Aceti anhydride-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
Formic AcidSigma Aldrich94318-50ML-F
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystallineSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg)PromegaV5113
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Carbon extraction disk, 47 mmAgilent Technologies12145040
Cation extraction diskAgilent Technologies66889-U

Referenties

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
  5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
  8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
  9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
  10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
  11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
  12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
  13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
  14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
  15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
  16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
  17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
  18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
  19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
  22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
  23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
  24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
  25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
  27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
  28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
  29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
  30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
  31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
  32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
  33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
  34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
  35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
  36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
  37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
  38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
  39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
  40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

ChromatineproteomicsChIP-massaspectrometriehistonmodificatieschromatine-immunoprecipitatienuclei-preparatieenzymatische digestieSDS-PAGE-analysevloeistofchromatografiemassaspectrometrie-analysestabiele isotopenmarkering
De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.